全基因组甲基化分析显示类似的模式在巴雷特食管和食管腺癌

文摘

巴雷特食管(是)是食管腺癌(EAC)的前体。识别小说参与食管肿瘤抑制致癌作用和潜在的恶性进展的生物标志物,我们进行了全基因组甲基化分析和EAC组织。使用Illumina公司的英飞纳姆HumanMethylation27 BeadChip微阵列,我们检查了94年27 578 CpG甲基化状态的网站正常食管(NE), 77年和117年EAC组织样本。CpG网站的总体甲基化在CpG岛是高,但CpG岛以外的低比NE和EAC组织组织。层次聚类分析显示一个优秀的不分离组织从和EAC组织;然而,集群和EAC组织不太清楚,表明甲基化发生在早期EAC的进展。我们证实了许多之前报道hypermethylated基因和识别大量的小说hypermethylated基因和EAC组织,尤其是亚当(Disintegrin和金属蛋白酶)肽酶基因编码蛋白质,钙粘蛋白和protocadherins,电压门控钾通道。路径分析表明,通道和运输活动是丰富hypermethylated基因。我们用焦磷酸测序验证选择候选基因,发现高数组之间的相关性和焦磷酸测序数据为每个验证基因(ρ> 0.8)。不同甲基化基因和通路可能提供生物见解的开发和发展,成为潜在的生物标记物的预测和EAC的早期检测。

介绍

食道癌是一个高度积极的恶性肿瘤。在美国,估计会有17 990例新病例和2013年15 210人死亡(1)。尽管先进的治疗食道癌患者,5年总体生存率仍然< 20%,因为大多数患者被诊断为晚期疾病(2)。食道癌患者的存活率可以改善如果更多的患者在早期诊断和潜在可治愈的阶段。因此,它是至关重要的鉴别临床适用的生物标志物可用于食道癌的早期检测和有针对性的预防。

两个主要组织学类型的食道癌,食管鳞状细胞癌和食管腺癌(EAC),发病率有显著的地理差异:食管鳞状细胞癌是主要在亚洲国家,而EAC是最迅速增加实体瘤在西方世界,目前占~在美国新食道癌病例的80% (3,4)。巴雷特食管(是)的前体病变EAC的食管黏膜鳞状上皮细胞癌变前的柱状上皮细胞所取代。是最重要的风险因素EAC的发展。EAC是患者的发病率比一般人群高30 - 100倍(5 - 7)。然而,最近的一次大型人群为基础的队列研究估计,是患者的恶性进展的风险是每年0.22% (8)。这个低绝对风险的发展需要更精确的是患者的危险分层更好地了解预防和/或治疗干预措施。独立客观的生物标志物需要补充和加强的危险分层患者根据病理分级。

现在普遍认识到表观遗传改变与肿瘤转化的过程(9)。DNA甲基化是最重要的表观遗传变化之一,起着至关重要的作用在人类恶性肿瘤的发展(10)。启动子区域通常富含CpG二核苷酸,称为CpG岛(11,12);这些岛屿的甲基化与肿瘤抑制基因的转录镇压有关,而hypomethylation与癌基因的表达增加(13 - 16)。识别特定的DNA甲基化网站不仅可以提供重要的生物学见解的开发和进展癌症还发现新的早期检测生物标志物,癌症的诊断和预后17,18)。识别小说在恶性进展的生物标志物,在这项研究中,我们进行了全基因组甲基化分析在一个大型系列和EAC组织相比,正常食管组织(NE)。

材料和方法

人类组织样本

总共117 EAC组织样本,77组织样本和94个相邻样本不组织周围的食道被纳入本研究。EAC,收集和NE组织如前所述(月19 - 21日)。所有组织都是快速冷冻诊断或治疗内镜活检时使用组织收集机构审查委员会批准的协议。经验丰富的病理组织学进行阅读相应的并列paraffin-fixed标本。只有那些肿瘤细胞> 70% (EAC组织)或化生/发育不良(组织)被纳入本研究。所有组织都从病人诊断为东盟。相应的正常鳞状上皮组织样本收集来自健康的粘膜出现至少3厘米的边缘明显的肿瘤从每个病人的胃肠病学家。所有的肿瘤都上演了根据标准第六版的“美国癌症联合委员会”阿特拉斯(22)。

亚硫酸氢DNA提取和转换

基因组DNA提取使用QIAamp DNeasy血液和组织工具包(试剂盒,瓦伦西亚,CA)根据制造商的指示。DNA浓度是评估一个nd - 1000分光光度计(NanoDrop技术,威明顿、德)和平均片段长度进行凝胶电泳。亚硫酸氢转化基因组DNA从每个样本使用EZ DNA甲基化工具包(Zymo研究、橙色、CA),把unmethylated胞核嘧啶尿嘧啶,但叶子甲基胞核嘧啶不变。

全基因组甲基化分析

Bisulfite-converted人类基因组DNA进行了分析使用Illumina公司的英飞纳姆Methylation27 BeadChip工具包(CA)圣地亚哥。这个数组目标27578个独特的CpG遗址位于近端启动子的转录起始点的地区的14495个基因。甲基化分析是根据制造商的协议执行。简单地说,~ 200 ng bisulfite-converted DNA应用每个芯片。在杂交过程中,DNA分子被退火两种不同珠oligomers-one locus-specific DNA的甲基化位点,另一个用于unmethylated轨迹。的单碱基延伸探针结合标记dideoxynucleoside三磷酸,随后沾荧光试剂。甲基化状态的审问CpG网站然后计算β值,定义为甲基化等位基因的荧光信号比甲基化和unmethylated等位基因的总和。β值的定量测量DNA甲基化水平的具体论文认定和范围从0(完全unmethylated)到1(完全甲基化)。

通过焦磷酸测序获得英飞纳姆甲基化的验证平台

五个不同的甲基化基因的甲基化改变在NE和通过焦磷酸测序获得的样本验证,sequencing-by-synthesis方法定量监测实时整合焦磷酸核苷酸通过释放的酶转化成光信号成比例。重亚硫酸盐处理和PCR后,每个CpG的位置在一个序列的甲基化程度是决定从胸腺嘧啶的比率到胞嘧啶。我们使用了真空准备工具(试剂盒)准备单链PCR产品根据制造商的指示。焦磷酸测序进行使用PyroMark Q96系统(试剂盒)根据制造商的协议。

统计分析

我们使用珠工作室甲基化模块软件(Illumina公司)来评估不同样本的差异甲基化水平和组。从焦磷酸测序结果和甲基化β值使用斯皮尔曼等级相关分析是相关。执行监督的分层聚类分析使用的平均连接方法。统计测试都是双面的。对于所有的测试,P< 0.05作为意义的水平。大卫生物信息学工具(23,24)是用来确定个人基因本体术语和地图的浓缩基因到基因和基因组的京都百科全书通路地图。丰富基因本体术语被报告为集群来减少冗余。的P值为每个集群的几何平均数P值集群中的所有基因本体类别。Benjamini-Hochberg多个测试校正是用来控制错误发现率。

结果

总体甲基化的NE,和EAC组织

我们评估27587 CpG网站14495个基因的甲基化状态在288食管组织中(94不,77和117年EAC)。之前确定微分甲基化,我们删除探针,在任何一个失败的样品(n= 68),X和Y染色体探针(n= 1092)。如前所述(25,26),我们也删除这些探针与β值在各样本≥0.8或≤0.2减少不变网站后续分析(n= 8689)。这导致最后一个数据集的17 729探针进行进一步分析。在这个探针集,10内836 CpG CpG岛和6893 CpG CpG岛之外。比较意味着β值并没有发现整体CpG甲基化的差异在东北,是和EAC组织样本(表我)。然而,当CpG岛和non-CpG岛网站分别进行了分析,我们发现分布之间的显著差异甲基化分析东北,是和EAC组织样本。在CpG岛整体甲基化(意思是β值的网站)不组织明显低于和EAC组织。相比之下,CpG岛之外,整体甲基化在NE组织明显高于和EAC组织。

层次聚类的NE和EAC组织

我们进行一个监督层次聚类区分这些组织(图1)。我们首先随机分割到发现和验证集样品。我们选择最小的十大差异甲基化CpG场所P值意味着每一个成对比较的β值差别组织(即与NE, EAC和NE和EAC和)用于聚合相应组织。不组织的集群和EAC组织非常好;然而,集群和EAC组织更明显(图1 a - c)。当我们使用相同的10 CpG网站集群组织验证集,又有很好的聚类的NE或东盟组织,但和EAC组织散布(图1 d-f)。

接受者操作特性曲线

进一步评估价值的甲基化CpG网站在歧视和EAC从正常组织,我们构建了一个接受者操作特征(ROC)曲线绘制敏感性和特异性(图2使用十大差异甲基化CpG网站)。ROC曲线下的面积,常用指标估算潜在生物标志物的诊断效果,计算。的歧视是不组织,ROC曲线下的面积是0.965(灵敏度:94.81%,特异性:91.49%),和不歧视EAC的组织,ROC曲线下的面积是0.973(灵敏度:94.87%,特异性:93.62%),表明这些差异甲基化的优秀价值CpG网站歧视从东北或EAC组织组织。

不同甲基化CpG网站和宿主基因是/ EAC组织

有大量不同的甲基化个人CpG NE和/ EA之间组织的网站。特别感兴趣的是这些网站内CpG岛的低甲基化在东北组织(β< 0.2),但显示显著(β> 0.5)甲基化/ EA组织。这些hypermethylated CpG网站的宿主基因潜在的肿瘤抑制基因。表二世和三世显示前20名hypermethylated CpG网站和宿主基因两两相比的是与NE和EAC与NE,分别。所有这些CpG网站显示,都是一致的甲基化和EAC组织,其中SFRP1 (27),GBX2 (28),ADAM12 (29日),PTGDR (30.),DMRT1 (31日),PTPRT (32),SH3GL3 (33),LAMA1 (34),COL15A1 (35)和AJAP1 (36,37)已报告之前hypermethylated在各种癌症。除了这些排名前20的CpG网站,一个完整的考试不同的甲基化CpG网站发现几个有趣的基因家族:亚当(Disintegrin和金属蛋白酶)和ADAMTS与血小板反应蛋白图案(亚当)肽酶家族,钙粘蛋白和protocadherins,电压门控钾通道(补充表1,可以在致癌作用在线)。

我们还比较了东盟组织的甲基化状态与组织(补充表2,可以在致癌作用在线)。没有CpG网站符合相同的标准集之前(即β在组织但β< 0.2 > 0.5 EAC组织)。

也有许多hypomethylated CpG网站在两两相比对NE, EAC和NE和EAC和(补充表3- - - - - -补充数据,可以在致癌作用在线),其中大多数是有可能导致全球hypomethylation肿瘤组织。

验证不同甲基化CpG网站通过焦磷酸测序获得

五个不同的甲基化之间的甲基化CpG网站NE和被组织发现集(SLC18A3、CACNB2 SH3GL3, CHRNA3 SFRP1;表二世亚硫酸氢)是通过焦磷酸测序获得的验证后转换。之间有很强的相关性每个CpG位点的甲基化水平的化验,这两个方法(为每一个ρ> 0.8;表4),展示技术Illumina公司数组方法的重现性。焦磷酸测序是一个非常具体的方法与一些非特异性的噪音。因此,通过焦磷酸测序获得的发现甲基化水平普遍低于Illumina公司检测到的数组。

通路分析hypermethylated基因

然后我们使用大卫生物信息学工具探索途径参与东盟发展潜力使用107 hypermethylated基因(β在NE组织和β< 0.2 > 0.5中/ EA组织)。hypermethylated基因丰富的基因参与细胞粘附、细胞运动、细胞表面receptor-linked信号转导,信息信号,调节转录等(补充表6,可以在致癌作用在线)。顶部显著京都百科全书的基因和基因组途径包括转录活动,sequence-specific DNA结合,和大量的通道和运输活动。

讨论

EAC的致癌作用涉及一个多步过程从肠上皮化生低收入和高档发育不良,最后腺癌(38)。众所周知,表观遗传事件参与这个过程。两个截然不同的DNA甲基化改变发挥根本性作用在癌症发展:全球hypomethylation和地区肿瘤抑制基因的甲基化9,10,15)。在这项研究中,我们发现在CpG岛的总体甲基化和EAC组织明显高于正常组织。CpG岛被认为是最相关的相应基因的表达,这些岛屿和甲基化与肿瘤抑制基因的转录镇压相关联。类似的结果在其他肿瘤类型已报告(34,39)。另一方面,我们发现,总体甲基化CpG岛屿外,EA组织明显低于正常组织。不可能CpG网站内部CpG岛CpG CpG岛以外的网站通常不参与调节基因表达。CpG岛外的甲基化水平反映了全球甲基化比特定基因启动子甲基化。这些数据与文献一致,全球hypomethylation和特定的肿瘤抑制基因启动子甲基化的发展中涉及和EAC (40-42)。

我们的层次聚类分析显示一个优秀的不分离组织从和EAC组织;然而,集群和EAC组织是不太清楚。此外,我们可以找到许多个人CpG网站显示低甲基化(β< 0.2)在正常组织,但hypermethylated(β< 0.5)和EAC组织;然而,没有一个CpG甲基化(β< 0.2)较低的网站在组织但hypermethylated EAC组织(β< 0.5)。没有hypomethylated CpG网站在EAC相比是减少β值> 0.2 (补充表5,可以在致癌作用在线)。这些观察结果表明,甲基化发生早期在东盟的发展和发挥更突出的作用在驾驶上皮化生和发育异常的形成比癌发展。与我们的研究结果相似,史密斯et al。(43)相比九hypermethylated已知基因的甲基化在东北,和EAC组织样本,表明高相似性和EAC的异常的DNA甲基化。综上所述,这些数据支持,是癌前期病变有深厚的分子改变,类似于癌。

确定个人hypermethylated CpG网站和宿主基因的特定利益,因为这些基因的候选肿瘤抑制基因和EAC发展。前不同hypermethylated基因/ EAC组织(表二世和三世),一些基因已经被报道之前hypermethylated / EAC组织和其他癌症,如SFRP1 (27),而其他许多人,包括GBX2 (28),ADAM12 (29日),PTGDR (30.),DMRT1 (31日),PTPRT (32),SH3GL3 (33),LAMA1 (34),COL15A1 (35)和AJAP1 (36,37),据报道在其他癌症。为新hypermethylated基因、膜转运体和离子通道基因异常频繁,包括基因编码SLC18A3(水泡胺转运体),CACNB2(压敏电阻器钙通道),CHRNA3 (ligand-gated离子通道),SLC6A2(多通道膜钠和神经递质转运体;表二世),同时大量甲基化potassium-gated通道(补充表1,可以在致癌作用在线)。它也是有趣的,许多频道和运输途径丰富hypermethylated基因(补充表7,可以在致癌作用在线)。人们很容易推测慢性接触胆汁酸会使膜转运蛋白的生理和病理变化和渠道,这可能导致上皮化生。另一个值得注意的观察是频繁的同时甲基化的基因编码细胞矩阵和细胞粘附蛋白,如COL5A1(胶原蛋白),AJAP1 (adherens junction-associated蛋白质),LAMA1(层粘连蛋白;表二世和三世)和大量亚当,ADAMTS,钙粘蛋白和protocadherins (补充表1,可以在致癌作用在线)。这些基因的甲基化可能参与细胞组织学和形态学变化,因为是组织与正常组织的鳞状性质相比柱状。

在新发现的hypermethylated基因,IRX4同源框转录因子,最近的一项研究表明,它可以抑制前列腺癌细胞的生长通过维生素D受体的相互作用和显著IRX4和维生素D受体之间的相互作用在互惠的转录调节(44)。PTPRT是最常见的突变蛋白酪氨酸磷酸酶在人类癌症和可以抑制大肠癌细胞生长(45)。

Illumina公司甲基化数组是一个健壮的平台,产生可靠的和高度可再生的数据。它已经被先前的研究相对于其他平台和显示一致的结果,与相关性等持续> 0.8 (46)。我们相关研究的五个不同甲基化CpG网站Illumina公司阵列之间的数据和焦磷酸测序数据数组支持Illumina公司的技术可靠性的平台。大多数之前报道的重演hypermethylated基因进一步支持这项技术的再现性。Illumina公司的Methylation27化验检测~ 2 CpG网站每个基因的甲基化状态对于大多数基因。与多个CpG位点基因的数组,我们发现所有的位点差异甲基化在同一个方向。最近的一项研究,使用相同的平台,分析DNA甲基化变化在长期的文化间充质基质细胞发现,微阵列定位论文认定密切了非常相似的甲基化模式(47)。这些观察结果表明,异常甲基化并不局限于单个CpG网站,而是影响附近的CpG网站和整个CpG岛。

本研究的主要力量是大样本大小的样本。有288个组织样本包括在这项研究中,使本研究最大的全基因组甲基化阵列的研究。这项研究有一些局限性。首先,这是一个横断面研究比较一次组织来自不同个体的集合。所有的组织在本研究从患者获得发达的东盟。是可能的,这些组织可能更猖獗的甲基化比组织畸变是患者在一般人不会EAC发展。未来的前瞻性研究的比较患者甲基化在开发和那些不开发EAC识别预测生物标记的发展。

总之,这个大规模的研究提供了强有力的证据表明,DNA甲基化的发展中扮演着重要的角色和EAC。的甲基化模式和EAC是非常相似的。不同甲基化的基因识别在这项研究可能提供生物见解的开发和发展,成为潜在的生物标记物的预测和EAC的早期检测。

补充材料

补充表1- - - - - -补充数据可以发现在补充数据

资金

美国国立卫生研究院(CA111922和CA138671);邓肯的癌变前的基因组图谱计划家庭癌症预防研究所和风险评估在德克萨斯大学MD安德森癌症中心;MD安德森癌症中心启动资金(j)。

利益冲突声明:没有宣布。

缩写:

缩写:
• 亚当

  Disintegrin和金属蛋白酶

• 是

  巴雷特食管

• EAC

  食道腺癌

• 不

  正常食管

• 中华民国

  接受者操作特征。

引用