人造甜味剂的代糖促进肠道变形菌门在克罗恩氏病、失调和髓过氧物酶反应性回肠炎

文摘

背景

流行病学研究表明,人工甜味剂的使用双打克罗恩病(CD)的风险。为期6个月的实验,我们量化的影响补充中商业甜味剂(三氯蔗糖;原料三氯蔗糖麦芽糊精、1:9 9、w / w)的严重性CD-like回肠炎和肠道微生物组改变使用SAMP1 / YitFc(桑普)老鼠。

方法

宏基因组的DNA测序最初是用来描述ileitis-prone桑普小鼠的微生物。16 s rRNA微生物基因组测序,定量聚合酶链反应,荧光原位杂交(FISH),细菌培养,立体显微镜,组织学,髓过氧化物酶(MPO)活性分析然后实现比较与控制微生物和回肠炎表型在桑普ileitis-free AKR / J小鼠后,代糖补充。

结果

宏基因组表示,桑普小鼠肠道微生物丰富的表型拟杆菌门,实验表明Helicobacteraceae没有一个加剧影响回肠炎。代糖没有增加的严重性(stereomicroscopic /组织学)回肠炎;然而,生化反应,回肠MPO活性增加桑普处理代糖而nonsupplemented老鼠(P< 0.022)和健康AKR鼠。代糖促进生态失调的扩张变形菌门在所有的老鼠大肠杆菌生长过度增加细菌渗透桑普回肠固有层的老鼠。鱼显示增加malXgene-carrying细菌集群补充桑普的国际执法学院(但不是AKR)老鼠。

结论

代糖促进肠道变形菌门、失调和生化MPO活性的自发模型(拟杆菌门丰富)回肠CD。我们的研究结果表明,尽管代糖可能促进并行微生物改变CD-prone和健康的主机,这并没有导致MPO水平升高在健康小鼠,只有CD-prone老鼠。三氯蔗糖/ maltodextrin-containing食品的消费可能会加剧MPO肠道与炎性反应只有在个人素质,如CD。

介绍

最近的自我评估膳食调查表明~ 10%的病人患有炎症性肠病(IBD)认为,“甜食”恶化他们的症状的严重程度和引发冲突。^{1 - 3}流行病学研究已经相应地呈现强劲人造甜味剂的使用之间的联系()和炎症性肠病的风险增加(优势比> 2.12;95%可信区间(CI), 1.1 - -4.2),^{4 - 6}但食源性IBD的机制是未知的。虽然营养一直被认为是关键在严重的炎症性肠病,改善营养不良和缺铁^7,8除了德尔菲专家意见和系统评价,目前没有以证据为基础的膳食指南来帮助IBD患者管理自己的饮食。⁴小说膳食研究,以促进肠道健康的重要性在IBD已经独立了²患者和临床医生“饮食”十大上市研究IBD优先级在2017年詹姆斯·林德联盟报告。⁹执行和解释人类饮食的研究是具有挑战性的,然而,由于遗传、微生物、饮食变化。作为一种替代方法,动物模型被用来研究膳食成分的影响,分别在很多疾病。认为饮食习惯不健康(如“西方”饮食,富含脂肪和糖类)被认为改变肠道微生物和直接或间接引发炎症性肠病。尽管我们的知识实质性进展的急性肠道炎症模型,精确的“multi-ingredient”对IBD的恶化的影响尚不清楚。

正在进行的和肥胖的患病率增加,伴随着炎症性肠病诊断的兴起,表明有可能这两种疾病的风险因素之间的联系。由于不断增长的肥胖流行病和压力,避免糖减少卡路里的摄入量,食品工业和消费者使用蔗糖的替代品”。“糖的主要成分是蔗糖,葡萄糖和果糖的二糖。代替蔗糖,(如代糖)使用“三氯蔗糖”作为noncaloric甜味剂成分,通常在1%浓度,混合填充成分(99%)提供结构和体积。¹⁰最常用的填料是麦芽糊精、营养多糖视为惰性和确认”通常被认为是安全的”(GRAS)由美国食品和药物管理局(21 cfr184.1444代码)。¹¹然而,研究表明,三氯蔗糖和麦芽糖糊精是生物惰性。^{12 - 17}在各种疾病的潜在不利影响是有争议的,因为他们不同的疾病和人类研究(如肥胖、糖尿病),¹⁵与一些报道表明轻微或没有负面影响。^12,17

因为炎症性肠病的饮食调制是一个现实的目标,可能需要修改病人的行为,尤其是在克罗恩病(CD),这是炎症性肠病的相关性最强的饮食习惯,重要的是要确定multi-ingredient商业的影响(如三氯蔗糖和麦芽糖糊精代糖)在炎症性肠病。信息来源于学习任何商业混合膳食成分可以帮助临床医生和病人知情和纠正饮食决策,有可能缓解炎症性肠病的症状和预防冲突。使用老鼠,在这项研究中,我们首先确定肠道微生物的特性和变化的自发性小鼠模型CD-like回肠炎(应变SAMP1 / YitFc(桑普))相比,其父母ileitis-free控制鼠标应变AKR / J (AKR),然后我们量化六周慢性的炎症影响商业的补充使用桑普回肠炎(代糖)在炎症性肠病小鼠模型。本研究的目标是(1)的粪便metagenome(即集体组成的肠道细菌基因组的分析)实验桑普老鼠和动物共住的能力在桑普回肠炎传染给健康AKR鼠;然后(2)量化的影响代糖补充CD回肠炎使用桑普和AKR鼠和粪便均化协议¹⁸所有小鼠实验之前被暴露于(通过口服填喂法)的粪便微生物存在于所有老鼠。CD-relevant形态特性,最近的三维(3 d) stereomicroscopic (SM)评估和模式分析(3 d-smap肠道)表现型协议显示,桑普老鼠自然发展与鹅卵石病变节段性肠炎形成一种时尚类似CD(外显率100%)。¹⁸在此,我们发现ileitis-prone桑普老鼠有微生物丰富拟杆菌门物种(如CD所述),慢性回肠炎表型不是AKR传染性或受到的影响幽门螺杆菌在肠道共生的。在这种微生物环境,然后,我们确定,6周的代糖补充成人炎症小鼠的饮用水不回肠炎的形态严重恶化桑普老鼠,根据组织学或stereoenterotype 3 d-smap肠道分数索引。然而,代糖并引起肠道微生物群失调桑普和AKR鼠,主要增加了变形菌门,显著增加促炎髓过氧化酶(MPO)活动和穿透细菌主要在桑普小鼠的肠道组织(回肠炎)。有趣的是,代糖没有诱导MPO活性的增加或细菌等组织丰富健康小鼠(AKR),表明三氯蔗糖可能促炎症影响只有当消费者对CD,可能加重症状的严重程度和冲突,这将是在协议与观测报告的IBD患者。^{1 - 3}

方法

老鼠和畜牧业

这项研究是与协议批准的机构进行的动物保健和使用委员会凯斯西储大学(IACUC-CWRU),使用桑普,AKR, C57BL / 6 j小鼠(B6),保持在特定的无菌(SPF)殖民地在动物资源中心(美国ARC-CWRU,克利夫兰,哦)。老鼠们安置在鞋盒与松木刨花为床上用品,提供反渗透饮用水(如无盐、细菌、病毒),美联储随意辐照标准实验室chow (Prolab RMH 3000;猪动物脂肪与底部钻具组合保存;6.8%的内容通过酸水解),保持12小时光/暗周期。¹⁸年龄和sex-matched老鼠(5 - 7 /组)被用于所有实验。桑普老鼠起源于选择性兄弟AKR鼠的繁殖,一个外交B6,如前所述。^{18 - 20}桑普老鼠容易发展进步回肠炎与“典型的鹅卵石病变”类似的3 d特征CD。^{18 - 20}初步的全基因组测序分析表明桑普回肠炎是一种多基因疾病,是人类的CD。²¹根据需要,AKR和B6小鼠作为父母的遗传ileitis-free控制。代糖与老鼠实验中产生的主要桑普繁殖集落(此处指定为设施)。一个平行交替殖民地(设备B)是用于验证的宏基因组研究设施A保持桑普的表型和遗传同质性设施,定期交换者之间发生2设施每12个月。“增殖老鼠”通常是定在1:2男:男女比例产生后代”实验的老鼠中,添加“断奶的3 - 4周的年龄和维护“增殖老鼠”旁边的笼子里。幽门螺杆菌- SPF桑普老鼠,重新推导出在美国国家癌症研究所(癌症研究中心;美国马里兰州弗雷德里克),维护和测试的高层在ARC-CWRU隔离单元,使用上面描述的饲养标准。

粪便Metagenomic猎枪DNA测序

由于未解决的问题与所有王国的宏基因组的DNA测序分析存在于肠道微生物群,这可能是相关的炎症性肠病的原因或结果,^22,23这里我们决定主要关注屏幕上的细菌和病毒。为了防止测序和postsequencing分析变化,验证生物信息学方法用于测序原始和高质量的过滤数据(即Illumina公司和Metaphlan)。²⁴我们专注于细菌因为健康的“kingdom-agnostic”宏基因组需要控制的巨大差异细胞完整性肠道菌群的所有成员,^22,23没有得到广泛的验证或研究开始时可用。

DNA提取,粪便样本均质被迅速冻结1 x PBS(1:5,克:卷)与陶瓷珠子和机械破坏使用快速准备FP120均质器(设置5 4点30秒^oC两次,1冻结周期之间)。匀浆,20秒后离心10000×4 g^oC,一夜之间被运往华盛顿大学博士的实验室跳过处女,圣路易斯,密苏里州DNA的提取和纯化进行匀浆使用商业DNA提取试剂盒mini-kit按照制造商的指令进行操作。DNA的完整性(数量)是通过分光光度法和凝胶电泳监测。dsDNA是量化的表达载体量子位荧光计(8.62±5µg /毫升;Quant-iT)。猎枪metagenome分析后进行图书馆准备使用Illumina公司试剂和Miseq测序验证协议。标准Fastaq文件被用来量化丰富的细菌读取使用MetaPlhan对齐和分析管道由Huttenhower博士在哈佛大学公共卫生学院的。²⁴短暂,生FASTQ文件被转移到一个本地服务器,Metaphlan管道运行在星系,其中R1和R2 fasta文件连接,然后使用bowtie2组装,并炮轰very-sensitive-local搜索。使用merge_metaphlan_tables Metaphlan输出文件被合并。py脚本,规范化和分析使用Metaphlan和R可视化工具。

桑普回肠炎传播性、公共住宅和粪便微生物群的趋同性

来确定粪便病原体的被动暴露在笼子里共住在一个狭小的空间里可以改变预期形态粘膜模式(业务/没有鹅卵石回肠炎)AKR和桑普殖民地,质询桑普和年龄/ sex-matched AKR小鼠断奶并受24周内的笼子里共住。作为我们metagenome数据表明,有一个相关的微生物群殖民地内变化随着时间的推移,代糖实验7天后实现粪便菌群(微生物群)均化协议(IsPreFeH),^18,25所有小鼠暴露于复合(池)的粪便从所有实验老鼠,400年填喂法µL粪便悬浮液的老鼠。^18,25

人造甜味剂在老鼠身上的实验

确定代糖补充对桑普回肠炎和肠道微生物群的影响,我们进行了3个单独的实验与增量调整。在实验1中,我们添加了一个“低剂量”的代糖(1.08毫克/毫升)的饮用水6周,相比“白开水”只使用桑普老鼠(6 /组)。体重,微生物培养的数据(粪便和脾脏)和回肠组织学和SM分数是主要的研究结果。在实验2中,我们重复相同的协议,但增加剂量的最大推荐的美国食品和药物管理局(FDA;3.5毫克/毫升)和包括AKR鼠(6 /组)。粪便bacteriome变化评估使用16 s rRNA微生物,葡萄糖耐量测试,经生化方法基于MPO活性的酶检测炎症回肠和结肠。^18,25最后,系统性炎症评价血清肿瘤坏死因子-α(TNFα)水平(Ready-Set-Go酶联免疫试剂盒eBioscience,圣地亚哥,美国),和血糖反应被葡萄糖耐量测试评估。在实验3中,我们重复协议2但管理代糖10倍的剂量实验2中使用的剂量(即35毫克/毫升)。主要结果MPO活性和肠道炎症(组织学和SM)。最小化cage-to-cage集群可变性,所有动物都单独居住,和水瓶都取代了每48小时提供新的补充,防止细菌生长。辐照/热压处理过的标准饮食是提供给所有小鼠在实验期间防止外部微生物混杂因素。我们最近报道的效果弄脏床上用品在鼠标微生物来源的微生物研究的“周期性bedding-dependent偏见”,这可能是不同取决于许多因素,包括老鼠的数量、微生物群,和湿度。²⁶在目前的研究中,我们控制了“周期性偏见”(1)房屋所有老鼠分别,(2)维护所有笼子HEPA-filtered加压标准宿舍(低湿度笼),每周同时取代所有笼(3),(4)收集的所有数据(食品消费,粪便样本,安乐死)和样品(生活和后期)当天所有的动物。Stereomicroscopic 3 d模式分析(以确定SM的存在异常黏膜表面)和组织学评估进行Bouin固定的肠道组织。组织学评价炎症的严重程度取决于苏木精和eosin-stained 5-µm-thick部分使用半定量的评分系统。在有执照病理学家所有分数蒙蔽的方式决定的。详细的3 d-smap肠道协议的注意事项,以及得分形式和标准,已验证并描述了其他地方。¹⁸

相对Multidilution枚举的粪便细菌社区使用“平行车道电镀”方法

传统上,枚举总细菌的粪便进行了使用扩散板的方法,这需要十10倍系列稀释接种100μL每个稀释在个别琼脂板上。^27,28粪便,包含8 - 9日志₁₀每克的细菌菌落(cfu),一个完整的量化中光谱需要10琼脂板上。为了降低成本,科学家们通常板稀释7,8,9,估计粪便CFU计数,留下更多的集中稀释(1 - 6)未经检验的。其他方法用于枚举mono-strain细菌悬浮液在食品科学使用5-μL滴每个系列稀释10倍"发现" /孵化琼脂板。尽管简单,发现测绘只允许二进制数据的集合(存在/没有生长在每个地方)获得“近似”CFU日志₁₀计数(最可能的数量/稀释),没有能力比较的相对增长或抑制潜在cocultured菌株。²⁷我们感兴趣的是估计的相对浓度老鼠粪便细菌社区,在天然丰度可能不同,这将是禁止用传播来检查镀方法在代糖的实验中,²⁸我们开发了一个方法在此被称为“平行车道电镀”快速估计总量和相对细菌丰度在大量稀释使用单一琼脂板。这种方法允许8 - 10 10倍稀释的电镀同时枚举细菌子组的CFU殖民地表现出不同的形态出现,不论他们的并发高或低丰度在同一个样本。简而言之,所有10倍的方法使用10 - 20μL串行粪便在PBS稀释,也同时放置滴使用多路分配器1一侧倾斜的琼脂板(> 60岁^o-80年^o角)。琼脂板的倾角使液滴向下滑动琼脂表面,创建平行车道传播解决方案5厘米²表面积,它允许不同细菌菌落的容易识别和枚举所有粪便稀释和抑制交互(0.5×10厘米)(补充图1)。在干燥和48小时的有氧和无氧孵化37^oC,单一的殖民地枚举相对于总样本的可培养的细菌菌落。琼脂使用包括脑心浸液(BHI)或大豆胰蛋白酶的琼脂(TSA)补充5%绵羊血液(美国BD,,),仅有Brentani(磅;肠道菌),德曼Rogose夏普(乳酸杆菌),肉肝脏(挑剔的厌氧菌和亚硫酸盐还原),和普通微生物琼脂补充仅仅用酵母提取物、麦芽糊精、或三氯蔗糖(3.5%)。在选择媒体(TSA),纯化后殖民地桑格测序标准协议。具体的幽门螺杆菌用于semiquantify引物也幽门螺杆菌种虫害在选择动物的粪便和组织使用扩增子凝胶分析(5 ' - B38 GCA TTT棉酚法案GTT法案CTG;太极拳在20 B39 CTG TTT柠檬酸AGC亚美大陆煤层气有限公司;C97 GCT ATG ACG GGT ATC C;C98手枪TTT ACC的有条件现金援助ACA CCA)。^29日

16 s rRNA基因的微生物分析

微生物在CWRU使用离子激流协议进行了分析,验证和详细描述。^30.,31日量化细菌变化与三氯蔗糖的六周的补充中,我们使用纯终点粪便样本的DNA(天42-47)PCR-amplify V4地区16 s rRNA基因的一式三份使用向前引物- s - d - bact - 0564 a - 15 (5′-AYT GGG YDT AAA GNG)和反向- s d - bact - 0785 b - a - 18 (5′tac日光GGT ATC TAA太极拳),如前所报道。^31日PCR产品被评估在2%琼脂糖凝胶电泳和纯化Agencourt AMPure XP系统。PCR扩增子选择获得400 - bp长度图书馆准备和使用离子激流测序试剂和CWRU台式音序器。^32,33序列分析,mothur包的算法(v1.32.1)³⁴和相关的依赖关系。正如我们此前报道,^31日对齐paired-end读取席尔瓦16 s rRNA参考数据库保持一致。序列是244个基点>或< 239 bp的长度,包含任何模棱两可的基本电话或长跑(> 8 bp) holopolymers或没有结合正确的地区被移除。嵌合体被确定使用uchime和被淘汰。包罗万象的用于评估物种丰富度,而分类任务依赖RDP分类数据库(http://rdp.cme.msu.edu/index.jsp)。他们用序列为操作分类单元的单元(辣子鸡)不同水平3%。而不是二次抽样正常化,^31日我们规范化OTU表重新调节所有样本的粪便样本的丰度最低的总丰度序列的研究。R软件被用来可视化微生物组剖面,计算单变量和多变量统计数据。系统树图是使用欧氏距离计算,独特的无监督分层集群观察时,我们测试了鼠标分配使用频率统计信息(Fisher精确)。在这种方式中,我们确定的分配老鼠微生物集群随机或明显与研究变量,尤其是鼠标应变和治疗(三氯蔗糖或白开水)。

定量聚合酶链反应Mucosa-Associated细菌

DNA是独立于回肠组织使用罗氏高纯PCR模板准备包基因组DNA隔离。qPCR执行使用10 ng真细菌的DNA反应和引物³⁵或六16 s rRNA-specific序列大肠杆菌,³⁶拟杆菌,乳酸菌/肠球菌,真细菌rectale /球菌样的梭状芽胞杆菌(Erec)分段丝状细菌(SFB),和鼠标肠道拟杆菌(MIB)³⁷在iTaq SYBR绿色Supermix火箭(BioRad)在7900年ABI棱镜ht (ThermoFisher科学)使用SDS2.4软件。样本一式三份。因为没有正确的被广泛接受的“参考控制细菌数量标记”规范化qPCR微生物数据,定量毒株特异性16 s引物扩增子数据分析了集体使用的原始qPCR-CT值如前所述¹⁸和多元统计数据可视化和量化的整体影响,补充mucosa-associated微生物组成回肠的老鼠。

荧光原位杂交

可视化malX携带的细菌基因的定位,这对于maltodextrin-degrading编码酶,^14,38,39回肠组织固定在methanol-based Carnoy固定剂(60%无水甲醇,30%冰醋酸,10%氯仿),分段嵌入在石蜡块,和。Five-µm部分与250 - ng deparaffinized和杂化大肠杆菌-Cy3探针(5“-Cy3-CAT CAC AGC插科打诨TTC-3总部”),500 - ng MalX-Alexa488探针(5 'alex488-acg CGT TCG TTC CTT CAA-Alexa488-3”),真细菌338 - alexa647探针(5 'alexa647-gct GCC太极拳CGT gg AGT-3”)或buffer-only控制在20毫米Tris-HCL, 0.01% SDS,一夜之间0.9 m氯化钠46°C。⁴⁰幻灯片然后用水冲洗两次,5分钟在孵化20毫米Tris-HCL, 0.9 m氯化钠46°C,用水冲洗两次,干10分钟46°C,和应用Vectashield包含DAPI实验室(向量)和盖玻片。用莱卡TCS-SP光谱成像收购激光扫描共焦显微镜配有Q-Imaging Retiga EXi冷却CCD相机和图像ProPlus捕获和分析软件(媒体控制论)。图像z-stacks收集每0.49μm生成图像分析的完整细胞和出口厚度使用图像ProPlus捕获和分析软件(媒体控制论)。

统计分析

在所有的实验中,小鼠随机使用系统的方法。我们使用最优分析和匹配策略来控制混杂偏差,实现介入和观察性研究。⁴¹此外,眩目的执行在代糖补充或实验和分析阶段幽门螺杆菌地位不明显的处理程序;noninformative码后显示分析。独立进行了单变量和多变量统计分析每个剂量三氯蔗糖。参数统计(学生t测试和/或1路的方差分析(方差分析))或他们的非参数方法被用于比较实验数据(例如,体重,炎症分数,MPO活性)。宏基因组和微生物细菌丰度数据(OTU分类表)对数转换,规范化,和加工使用R软件或占据。多元霍特林的丁字尺分布统计信息用于细菌qPCR组织数据的综合分析。数据被当作SD或95%置信区间;意义举行P≤0.05。P值在0.05和0.1之间也显示在适当的时候。

结果

肠道Metagenome Ileitis-Prone桑普小鼠富含门的家庭拟杆菌门

测试前代糖的影响,我们首先检查肠道metagenome桑普的“实验老鼠”殖民地与AKR相比,一直保持在同一种动物CWRU设施超过十年。因为每个殖民地可以选择自己的微生物,适应他们的健康或患病的肠道环境多年来确定潜在的微生物差异很重要(“转移/飘”)可能是由于炎症性肠病易感性基因型和进步桑普表型(轻微炎症在年轻的时候;在成人严重的炎症)。为此,从6实验小鼠粪便样本(3男性,女性;6笼子)3种不同年龄组(7日,22日和50周)(见实验设计图1一个)收集,加工,集中进行DNA提取和测序使用metagenome MiSeq Illumina公司测序试剂。我们使用池创建一个复合试样为每个年龄组作为背景的有效的筛选方法来控制个人和笼可变性,因为粪便池是一个强大的和具有成本效益的方法来研究大型动物种群的微生物表型(池5 - 10个人样本显示最佳性能)。^42,43在门级,宏基因组显示显著增加拟杆菌门门在桑普老鼠。在类级别,在拟杆菌门,Sphingobacteriia和Bacteroidia增加在桑普与AKR鼠(无花果1中)。在这两类,可能7门拟杆菌门,这是最丰富的门在这项研究中,值得注意的是,最丰富的物种鉴定的门属于4 6可能在类属Bacteroidia(普氏菌,Alistipes,Parabacteroides,拟杆菌;订单细菌性的)。总的来说,Bacteroidia是最常见的改变相比,桑普老鼠只有1属6可能增加Sphingobacteriia(1/6和4/6;1-tailed费舍尔P= 0.045)(见物种图1 e)。这一发现是实验与CD因为CD与相关拟杆菌门纯度的浓缩铀失调(如拟杆菌和普氏菌属在人类肠道粘膜样本)。⁴⁴

在门变形菌门、分析在家庭层面揭示了引人注目的增加Helicobacteraceae(C:Epsilonproteobacteria;O:Campylobacterales在桑普老鼠(图1中)。然而,随着Helicobacteraceae(第六最丰富的家庭在这项研究中,41)已经丰富年轻桑普老鼠(7周的年龄),研究结果表明Helicobacteraceae丰度并不是由于回肠炎的严重性,这通常是未被发现在3周的年龄,但是影响> 60%的回肠55周的年龄。因为宏基因组是强劲的基础上量化细菌社区使用单份基因数据,结果池(n = 36)小鼠强烈表示,第一次,桑普微生物表型有丰富的几个Bacteriodetes家庭,令人惊讶的是二分和丰富的Helicobacteriaceae。因为幽门螺杆菌一直被视为一个混杂因素和必要的生物在某些B6小鼠结肠炎模型,但不是全部,⁴⁵被认为是必要和一套新的样本证实这项发现个人(不是池)宏基因组,特别是细菌性的和Helicobacteraceae已知人类肠道的居民可能成为投机取巧的病原体,例如,Odoribacter splanchnicus(图1)。^46,47

Virome测序显示没有诺瓦克病毒“汇集粪便”

进一步研究微生物“汇集粪便”实验的殖民地,粪便样本也处理和shotgun-sequenced使用罗氏454 -测序平台,筛选DNA和互补脱氧核糖核酸病毒基因组的存在,除了Illumina公司测序。宏基因组序列的检查表明没有诺瓦克病毒的混合样品。到目前为止,宏基因组分析表明没有检测到dsDNA病毒在汇集了年轻的桑普和AKR鼠的粪便。诺瓦克病毒PCR和小说astroviruses也负,尽管测试我们的SPF殖民地已被证明是不定地随着时间的推移对诺瓦克病毒血清反应阳性的。我们最近报道并发血清学筛查的成年桑普在无菌(GF)条件下生活的老鼠,在桑普展示鹅卵石回肠炎没有血清转化诺瓦克病毒长达62周的年龄。²⁶因此,血清学表明桑普回肠炎发生独立于诺瓦克病毒,病毒需要促进肠道炎症ATG16L1gene-dependent使用B6小鼠模型。^48,49

个人宏基因组说明伟大的笼子和设施的可变性幽门螺杆菌在老鼠身上

来验证Helicobacteraceae在桑普老鼠稳定丰富的随着时间的推移,第二个宏基因组分析“汇集”宏基因组进行了8个月后评价,但测试个人从“增殖老鼠粪便样本。“配对男:雌性老鼠被笼取样作为集群的再现性验证无监督metagenome层次分析中使用的池metagenome分析“实验小鼠。“十八活跃30周饲养者妊娠(1男1女/笼)代表进行了测试,因为他们会的主要来源肠道共生的微生物遗传后代”实验老鼠”取样。正确确定Helicobacteraceae在桑普异常,B6饲养者也采样,连同原AKR vs桑普殖民地(图1一个)。确保合规科学严谨和数据再现性,桑普和AKR鼠也抽样从另一个殖民地(B)设施。出乎意料,宏基因组分析(5440万年原始读取;2090万高质量的细菌paired-end 79±5%独特)显示的主要变化Helicobacteraceae在整个殖民地和设施,进一步挑战的相关性Helicobacteraceae随着有关桑普回肠炎。这一次,幽门螺杆菌缺席3笼子桑普和B6小鼠,但丰富的关在笼子里的AKR设施(图2一个),这是对并发发现设备b分析清楚地表明,序列的能力幽门螺杆菌SPF小鼠在宏基因组高度变量和二分(高度丰富或缺席),可能由于季节性或单个笼子的差异。鉴于高可变性,没有绝对的结论可以对潜在的因果或调节的作用幽门螺杆菌桑普鹅卵石回肠炎。然而,分析(1)确认拟杆菌丰富成人桑普老鼠和(2)的最佳再现性验证我们的宏基因组方法对育种者总是聚集在一起(如预期在笼子的任务,尽管臭名昭著的“鼠标自己的个性”)使用非监督集群分析(图2模拟)。

的存在Helicobacteraceae不改变鹅卵石病变进展在桑普回肠炎

幽门螺杆菌种虫害16 s-primer放大特定的粪便细菌DNA证实,两个鼠标线(桑普和AKR)设施存在细菌的排泄物,桑普可能比AKR DNA拷贝数(图2 e)。因为最初汇集宏基因组分析表明强烈的签名幽门螺杆菌种虫害在桑普,然后,我们创建了一个新的桑普rederivation和殖民殖民地幽门螺杆菌消极的老鼠在美国国立卫生研究院的微生物群。rederivation后,育种对运输和安置在我们的表型测试的设备。SM分析小鼠的小肠在30周的年龄显示3 d的持久性鹅卵石发炎回肠病变结构,而组织学分析显示,随着时间的推移,这个殖民地幽门螺杆菌没有必要的疾病发生或组织学检查恶化(immunophenotyping差异的研究正在进行中,并将单独报告)(图2 f)。

桑普回肠炎不是传染性或可预防与健康小鼠的长期同居

之前的研究使用DSS-induced colitic老鼠和公共住宅建议急性结肠炎是“传染性”影响B6小鼠影响老鼠暴露在他们的肠道微生物群。⁵⁰通过使用公共住宅,其他人已经报道,NOD2基因敲除B6小鼠的微生物群传输colitogenic属性B6小鼠,主要通过改变丁酸弧菌属,Lachnobacteriumspp。,拟杆菌(上图所示在桑普)也增加了。⁵¹相比之下,我们最近决定,相同的NOD2突变桑普出人意料的改善,而不是恶化,鹅卵石回肠炎(50%在30周)和减少DSS结肠炎的严重程度。⁵²相反,我们没有发现证据表明,抗炎的好处NOD2基因突变是由于给定的微生物组配置文件根据粪便metatranscriptomic(细菌基因mRNA表达)和16 s微生物分析。虽然传染性结肠炎的概念似乎与B6小鼠的基因,基因差异在我们桑普模型及其自发进步回肠炎表型²¹促使我们确定微生物暴露的年轻的质询健康AKR鼠在公共住宅可以保护年轻的质询桑普老鼠从发展中回肠炎,以及是否可以传播疾病从桑普AKR长期实验。6个月的实验进行了14只老鼠。3 d-smap肠道分析表明,3 d回肠炎表型没有传染性AKR鼠和桑普回肠炎没有阻止与AKR同居期间。文化分析(厌氧菌和enterobacterial粪便枚举)表示,尽管总细菌负荷相似AKR和桑普cohoused老鼠,桑普青睐肠道enterobacterial增长(补充图1)。

在一起,上述分析表明,桑普回肠炎(1)了拟杆菌门丰富的微生物表型,(2)有利于enterobacterial增长增加了可能性,(3)可以开发鹅卵石病变的存在的影响幽门螺杆菌在肠道和诺瓦克病毒,(4)没有传染性AKR长期共住。交叉实验从桑普粪便移植到GF-AKR老鼠,反之亦然,被认为是验证桑普回肠炎没有microbiome-transmissible,但实验是不可能由于缺乏可用的GF-AKR老鼠。由于动物福利问题(SAMP-AKR老鼠打架,与桑普层次主导公共住宅实验),我们认为代糖实验无法进行共住成人AKR和桑普老鼠。

代糖不改变桑普鹅卵石回肠炎表型但增加组织MPO活性

由于困难合住AKR和桑普控制观测metagenome笼子里的老鼠和可变性,我们实现了IsPreFeH协议^18,25在所有动物中⁵²接受代糖实验,紧随其后的是个体动物住房和代糖补充42-47天。尽管低剂量补充导致瞬态在补充期间体重减少(广义线性回归(GLM)P< 0.0001),高剂量没有显著变化。此外,虽然粪便文化表明,代糖促进enterobacterial桑普maltodextrin-utilizing细菌生长,没有证据表明文化的系统性影响在场脾脏,血清TNF水平,或血液葡萄糖耐量测试。相比之下,厌氧菌总数(TSA)和乳酸杆菌(琼脂夫人),肠道菌的数量(磅)在小鼠Splenda-supplemented桑普显著增加。没有差异在1、3或补充后14天(图3 g)。出乎意料,SMAP肠道和回肠的组织学分析表明,三氯蔗糖不增加回肠炎症分数,SM-abnormal粘膜的百分比,或3 d-morphological鹅卵石病变的特点CD-prone(桑普)的老鼠在任何3剂量测试。更重要的是,补充并没有导致回肠炎和结肠炎在健康小鼠(AKR)。相比之下,经定量酶活性测定表明,MPO活性的量的回肠桑普小鼠接受最大代糖食品及药物管理局批准的剂量(3.5毫克/毫升)高出2.7倍,而桑普老鼠喝白开水(219.1 vs 81.8 U / g,t测试P= 0.022)。控制多个变量,分析回肠组织桑普小鼠在实验3(大剂量,35毫克/毫升)证实,MPO的增量增加活动只发生在Splenda-treated桑普(双向方差分析F_2、27= 4.08,P= 0.055,控制重要的代糖和器官之间的相互作用(结肠和回肠),P= 0.0515)。有趣的是,同样的剂量的代糖没有影响回肠MPO AKR鼠的活动(例如,实验3,双向方差分析F_2、21= 0.09,P> 0.76)。结肠的MPO活性较低而回肠(双向方差分析AKR和桑普P= 0.012,P< 0.0001),由代糖的鼠标线(图4 a e)。这些结果表明,代糖促进肠道组织MPO活性的增加(“生化炎症”)只在小鼠的肠道壁容易IBD,没有诱导主要(明显的组织学)显微结构变化与活跃的炎症有关。这一发现是非凡的考虑,亚临床炎症(例如,增加MPO和其他炎症生物标记,没有证据的组织学异常)最近被观察到在健康的同卵双胞胎和异卵不整合对炎症性肠病与健康相比nontwin亲戚。这进一步支持了概念,遗传和环境因素的组合容易使人生化反应性炎症性肠病的炎症。⁵³

代糖促进肠道微生物生态失调变形菌门在桑普和AKR鼠

粪便细菌成分的差异进行评估使用16 s微生物分析(142万年V4 16 s rRNA从20老鼠基因序列;70879读/样品质量控制通过过滤器;有99.36%爆炸击中了比赛的16 s数据库)。确凿的文化发现桑普老鼠接受代糖,分析显示,补充最一致的效果,代糖对小鼠肠道菌群是一个显著的广泛推广5微生物菌种的类内识别变形菌门门(Alphaproteobacteria,Betaproteobacteria,Epsilonproteobacteria,Deltaproteobacteria,Gammaproteobacteria)。proteobacterial意味着AKR之间的丰度和桑普的比较表明,桑普可能更多变形菌门在控制(6/6;1次反面标志P= 0.016)琼脂(见文化从cohouse AKR-SAMP老鼠补充图1 e)和代糖组(5/6;1次反面标志P= 0.109)(图5模拟)。比较,微生物分析还表明,AKR之间存在细微差别和桑普老鼠,集群分别为鼠标菌株。此外,代糖改变肠道微生物通过减少其他类群,而没有观察到显著的影响拟杆菌门或厚壁菌门(如乳酸杆菌和梭状芽胞杆菌),集群根据饮食的老鼠也影响他们的肠道微生物(图5模拟)。文化Splenda-treated桑普与小鼠的饮用水的数据显示,代糖乳酸杆菌的数量没有影响(琼脂夫人),细菌总数(TSA),或厌氧梭菌属的物种(夫人、TSA和肉琼脂肝脏;全球语言监测机构的规范化的日志₁₀调整P> 0.2),而它提升的显著增长大肠杆菌在小鼠的粪便。感兴趣的,大肠杆菌增生明显发生的取代,至少可耕种的链球菌例如生物,明显在老鼠的粪便只喝水(图6)。因为一些证据表明,代糖促进组织MPO活性和生长大肠杆菌(Gammaproteobacteria)在肠内容(粪便),然后使用qPCR和荧光原位杂交(FISH)分析确定从桑普老鼠回肠组织处理代糖会mucosal-associated失调,增加细菌渗透到深层肠道。

代糖会导致截然不同的回肠组织与增加细菌微生物群Malx基因桑普老鼠

多元定量分析的DNA复制数字回肠(全厚度)组织样本从桑普老鼠使用7特定引物对各种细菌的家庭/物种表明补充小鼠明显(dysbiotic)微生物概要文件与未经处理的动物(相比看到浓缩的真细菌、乳酸杆菌和的贡献大肠杆菌作为二维向量图7)。尽管桑普回肠炎已知高度节段小肠疾病,盲鱼桑普老鼠证实ilea分析Splenda-treated桑普老鼠增加了数字和大集群内的细菌绒毛而未经处理的桑普和AKR鼠。这些细菌集群积极杂化的大肠杆菌调查和调查malX,一个基因编码一个maltodextrin-binding麦芽糖和麦芽糊精的蛋白质代谢系统。⁵⁴转化的价值,FISH-positive集群的存在几乎是不知不觉中ileitis-resistant AKR鼠在两组中,有和没有三氯蔗糖/麦芽糊精(代糖)补充(图7 b和C)。这个观察进一步支持,三氯蔗糖/麦芽糊精dysbiotic影响ileitis-prone桑普老鼠,但不是在健康AKR鼠。

在一起,我们的数据表明,三氯蔗糖/麦芽糊精的日常补充水(6周)促进细菌失调与扩散变形菌门物种,包括大肠杆菌,增加了细菌侵袭性绒毛组织,这可能会反过来增加回肠组织MPO活性的过程中小鼠鹅卵石CD-like回肠炎。

讨论

CD与倾向复发缓和炎症性肠病是一种慢性开发高度独特的粪便微生物群干扰(失调)与其他形式的炎症性肠病。⁵⁵拥有丰富的典型,CD拟杆菌门和减少的厚壁菌门。^56,57最近的一项荟萃分析的原始测序数据从IBD微生物研究,DGGE一起研究,^56,57表明一些CD患者可能没有大量的粪便拟杆菌门,这表明有2种CD患者基于这门的存在或有大型数据的变化。我们的研究支持的角色拟杆菌门在CD,我们最近发现的拟杆菌门纯度的浓缩铀的校内的海绵管状的病变严重发炎的肠道样本从病人手术CD。¹⁸第一次,我们提交的数据表明桑普回肠炎表型丰富(而不是不足)拟杆菌门这个模型,使微生物相关的进行饮食研究的拟杆菌门丰富的上下文,或在无菌条件下。metagenome分析还显示一个大变化Helicobacteraceae。虽然我们评估这个属的相关性实验通过推导桑普鼠标殖民地免费幽门螺杆菌,重要的是要强调固有的困难在实现自然微生物群落的组成与单个有机体re-deriviation过程中缺席。尽管内在困难,桑普的存在回肠炎动物缺乏幽门螺杆菌表明这个属必要的作用诱导回肠炎在桑普是最小的。Mono-strain关联研究正在检查这个属的潜在微不足道的调节效应对当地发展的和系统性免疫桑普回肠炎。

因为目前微生物方法不定量的净粪便物生物量的内容(例如,每克粪便细菌类群的变化,检测极限阈值和变量图5)⁵⁸由于粪便微生物群的相对组成的变化不一定意味着肠道壁的变化,我们互补的微生物进行基于枚举的方法在粪便样本(图6),然后qPCR和鱼在回肠组织化验(图7),我们确认补充调节的影响鼠标微生物组成桑普回肠组织。因为代糖的影响在MPO活性独家ileitis-prone桑普老鼠,而不是控制IBD-free老鼠,它是合理的假设如果三氯蔗糖/ CD患者可能增加了MPO-inflammation易感性maltodextrin-containing食品长期食用,即使在低浓度,作为常规习惯。同样,这也是合理的强调增加生化MPO活性可以把CD患者的风险会有夸张的炎症如果其他情况下启动粘膜炎症,例如,在意外的食源性细菌重复感染,进一步招募MPO-containing白细胞肠道。^59,60增加的相对丰度变形菌门由于代糖,发现在我们的研究中,已报告与各种肠道疾病在不同的物种,包括人类。变形菌门是革兰氏阴性细菌的主要门,包括各种各样的病原体对人类和动物共同,包括弧菌,沙门氏菌,鼠疫,幽门螺杆菌,埃希氏杆菌属spp。病理特征,最多变形菌门革兰氏阴性,有外膜组成的脂多糖(LPS),这是很强的先天免疫的触发器,与当地和系统性反应,根据有限合伙人剂量,细菌生长的速度成正比。在这项研究中,我们没有发现任何临床或肿瘤坏死的因素代糖引起的系统性炎症的证据。然而,我们发现的微生物和病理证据表明,代糖促进当地MPO活动增加,细菌肠道上皮细胞的渗透,增加的优势大肠杆菌。在一起,我们的研究结果进一步支持dysbiotic的角色变形菌门扩张作为肠道的微生物签名和上皮功能障碍。^61年,62年

MPO酶由巨噬细胞和中性粒细胞产生进化中扮演着重要的角色在降解入侵的病原体之一,最早的先天免疫防御线。然而,诱导MPO-derived氧自由基级联(导致活性oxydative压力),反过来,催化反应可以导致修改的蛋白质和细胞外基质的破坏可能夸大了炎症。因此,过度MPO活性与三氯蔗糖/麦芽糊精补充、增加粪便细菌丰度的检测和渗透的大肠杆菌在肠道壁,可能导致亚临床夸张回肠炎的CD。作为IBD患者认为“甜食”可能是一个原因导致他们的症状严重程度的增加,与流行病学证据支持他们的临床恶化,我们AKR鼠数据表明它是合理的考虑,健康的人不应该担心或期望开发CD回肠炎(或MPO hyper-reactivity)如果他们使用代糖。然而,IBD-free“健康”的消费者三氯蔗糖和麦芽糖糊精应该意识到扩散变形菌门的特点之一,就是预期与AS-induced失调,这功能吗^63年调节其他条件不被认为是在我们的研究中。补充甜味剂的研究只评估了6周,但长期增加的活性氧化应激炎症组织也可以携带DNA氧化和组织损伤的风险更高,而长期以来被认为是诱发机制IBD-associated癌症和其他严重并发症。^{64 - 66}

已经近一个世纪以来的引入noncaloric在我们的饮食中,消耗的~ 30%的成年美国人。感兴趣的,有些分析表明,可能有IBD的发病率之间的直接时间相关和的数量在不同的国家销售。^67年虽然其他主要的变化发生在人类营养,同样重要的是要强调肥胖和糖尿病似乎平行IBD的发病率的上升。¹⁶此外,“西方饮食”这个词意味着改变肠道微生物群的证明提高adherent-invasive的易感性大肠杆菌在老鼠身上感染和肠道炎症。^68年在这项研究中,我们报告类似的结果仅仅是因为政府微量组分的饮食(一个人造甜味剂基于一个共同的三氯蔗糖和麦芽糖糊精在食品零售市场),这表明一些饮食习惯或添加剂可能会导致类似的微生物群的改变。例如,饮食乳化剂作为食品添加剂最近也被证明改变肠道微生物群,促进小鼠结肠炎。^69年我们的研究结果提供实验数据,帮助人类饮食IBD调制的通知机制,并指导易感个体的饮食习惯。除了演示实验的作用sucralose-maltodextrin-based人造甜味剂(相关市场上类似产品)在促进肠道失调和MPO活性,我们的研究也表明,它可能措施变形菌门和MPO活性,同时患者的粪便生物标志物监测肠道的疾病/健康调整他们的饮食。监测MPO和变形菌门人类可以帮助识别个人因素引发患者炎症性肠病易感性看似无害的饮食习惯。

补充数据

补充数据是可用的炎症性肠病网上。

支持:这部分工作是由美国国立卫生研究院拨款DK091222 DK055812,和DK042191足球和职业发展从克罗恩氏和结肠炎基金会奖A.R.P.得到格兰特01 dk082437的支持,和K.P.N.霍华德休斯医学研究所的“地中海毕业生”倡议。特别确认→CCF核心徕卡SP5共焦成像多光子显微镜共享仪器格兰特1 s10rr026820-01,小鼠模型的核心和组织学/成像的核心NIH P30消化系统疾病研究中心核心的克利夫兰西尔维奥·o·孔戴(DK097948)。

作者的贡献:A.R.P.和足球俱乐部设计的研究。A.H.,l。K。,h,P。米。assisted with laboratory and mouse experiments. S.K.D. and M.H.M. rederived and provided幽门螺杆菌消极的老鼠。T.T.P.老鼠和样本提供备用鼠标设备b . S.I.和A.R.P.开发和验证“平行车道电镀”文化的策略。A.R.P.,A.H.,通用,核磁共振,年代。我。led microbiome and microbiology analysis. C.M. and K.P.N. performed qPCR and FISH assays. C.M.C. and L.K. conducted glucose tolerance test assays. F.C., T.T.P., S.I., and M.L. commented on and edited the manuscript. All authors read and approved the manuscript.

利益冲突:所有作者声明没有利益冲突。

确认

我们感谢约翰·d·沃德和林赛n Kaydo魏博士的技术支持和鑫回肠炎组织学评分的严重性。ARP是医学CWRU医学院的助理教授。宏基因组测序是在博士的实验室进行跳过处女华盛顿大学,医学院,圣路易斯,密苏里州。

可以在原始测序数据文件将被要求。

引用