小鼠白细胞介素- 10”Gene-Deficient开发主要针对肠道微生物区系肠道通透性缺陷

总结

正常肠上皮细胞提供了一个屏障相对不透水腔的选民。然而,患有炎症性肠病的经验增强肠道通透性,与损伤的程度有关。il - 10 gene-deficient老鼠进行了研究以确定是否增加肠道通透性作为主要缺陷发生在粘膜炎症的发病或粘膜损伤是次要的。在2周的年龄,il - 10 gene-deficient老鼠显示增加回肠和结肠渗透率无组织学损伤。这个主要渗透缺陷与粘膜分泌增加有关interferon-γ和肿瘤坏死factor-α和不涉及增加一氧化氮合酶活性。结肠渗透率仍然升高随着炎症的发展,而回肠渗透率可实现6周的年龄。il - 10 gene-deficient老鼠提出在无菌条件下没有炎症,并展示正常通透性和细胞因子水平。这些数据表明,il - 10 gene-deficient小鼠肠道通透性缺陷发生由于免疫反应特异表达正常肠道微生物区系,此外,这渗透缺陷存在之前粘膜炎症的发展。

介绍

内腔的肠道细菌,细菌的产品,和饮食抗原能够启动和维持炎症。正常肠上皮细胞提供了一个屏障相对不透水这些腔的成分,通过肠道吸收和控制腔的抗原发生免疫和上皮细胞(¹)。相比之下,克罗恩病(CD)导致黏膜通透性增加。

一个有趣的假设关于CD发病机理的推测,一个缺陷在上皮屏障功能启动,尽管有一些争论此事(^2,3)。令人信服的证据来支持一个内在肠道通透性的缺陷已经被肠道通透性增加的报告建议无症状患者的家属主动CD (^{3,- - - - - -5})。然而,很可能增加渗透作用至少一次要宽容在肠道炎症的恶化,允许增加抗原的吸收和连续刺激的粘膜免疫系统。对于基因敏感地和无法抑制免疫反应,自我,慢性肠道炎症的结果。

il - 10 gene-deficient鼠标发展一个炎症性肠病的过程非常类似于克罗恩氏结肠炎,特点是不完整的,透壁的急性和慢性炎症和粘膜溃疡(⁶)。我们曾表明,il - 10 gene-deficient小鼠的结肠组织学正常的2周的年龄,但在4周的年龄发展结肠炎(⁷)。本研究的目的是确定是否增加肠道上皮通透性发生前出现炎症的il - 10 gene-deficient鼠标。

材料和方法

材料

化学试剂级获得从σ化学公司(圣路易斯,密苏里州,美国)或费舍尔科学加拿大(Napean,加拿大)。放射性同位素(¹⁴C]聚乙二醇和[³H] D-mannitol,来自新英格兰获得核(美国波士顿)。

动物

纯合子小鼠白细胞介素- 10”gene-deficient,生成129 Sv /电动汽车背景(帕洛阿尔托DNAX研究所、钙、美国)和129 Sv /电动汽车控制(杰克逊实验室,塔科马,华盛顿州,美国)维持在阿尔伯塔大学的殖民地,安置在特定的无菌条件下背后的一个障碍。热压处理过的所有供应设施。Nonautoclavable供应喷洒消毒剂,介绍了通过一个高效微粒空气(HEPA)过滤空气锁。老鼠住在带有密封盖microisolator笼子提供含有涤纶纤维过滤器。测试哨兵Balb / c小鼠(细菌培养、寄生虫学的检查、血清学跟踪配置文件,和组织学染色为阴性小鼠病毒性和细菌性病原体)表明,障碍是完好无损。然而,这些老鼠并征服他们的胃肠道腔与正常肠道菌群。

无菌(无菌胃肠腔)il - 10 gene-deficient老鼠皇帝的派生和维护根据标准技术(⁸在影片Trexler灵活)在阿尔伯塔大学的光电隔离器。无菌状态确认每周由有氧和厌氧培养和革兰氏染色剂粪便样本。

肠道组织学评估

动物被给予一剂钠pentobarbitol(160毫克/公斤)年龄在2、4、8、16周的年龄(n = 6到8在每个年龄)。回肠和结肠,全部收获,在磷酸盐10%福尔马林固定。在4μm这些样本石蜡包埋,切片,和苏木精和伊红染色(H & E)为光显微镜检查。综述了幻灯片蒙蔽的方式由两个病理学家(J.S.D.和L.D.J.),分配一个组织学得分的肠道炎症使用修改得分方案被Saverymutta et al。(⁹),正如前面详细(¹⁰)。短暂,组织学评分(从0到10)代表数值的和4评分标准:粘膜溃疡,上皮增生,固有层单核渗透,固有层中性粒细胞浸润。

肠道屏障的完整性测量

体内灌注

当天研究中,动物体重并给予阿托品(0.2毫克/公斤)麻醉前30分钟。麻醉诱导是通过腹腔内注射含Hypnorm的鸡尾酒(25毫克/公斤)和咪达唑仑(12.5毫克/公斤)。体内吸收测量使用单一通过灌注技术之前描述(¹¹)。总之,结肠或回肠与灵活的孤立和空心管的近端和远端结束。肠道和等渗压的刷新Tyrodes缓冲区(氯化钠,8 g / L;KC1, 0.2 g / L;不₂阿宝₄,0.33 g / L;pH值7.4 37°C)腔的内容。神经与血管的完整性是精心维护。段灌注当时的测试解决方案包含5 g / L聚乙二醇4000(时标记)和1毫米D-mannitol准备Tyrodes缓冲区和放射性标记(¹⁴C)聚乙二醇(10μCi / L)和(³H] -D-mannitol(100μCi / L)。37°C的解决方案是灌注以恒定速率为0.2毫升/分钟和保持在37°C。体温监测通过一个温度探头(插入直肠给药在小肠灌流,在结肠灌注腹腔内)和维持在37°C使用加热床垫和灯。管腔内的静水压力不断监控和维护3厘米以下。30分钟后平衡期,连续8分钟灌注从远端网站收集的样本。样本的重量,100μl整除被液体闪烁计数。这个过程完成后,动物被给予过量和灌注环节肠切除和它的长度测量;当时段干干重的测定。

肠道通透性

净水通量计算基于初始和最终的灌流液的区别和初始和最终浓度之间的差异¹⁴C) PEG(聚乙二醇)使用以下方程:

泵体积([实验¹⁴C挂钩/初始¹⁴C]挂钩样品卷)1000 / 10 /肠道长度

甘露醇间隙使用方程计算

C_探针= (C_我V_我- C_fV_f)/ (C_avgTW)

其中C_我测量初始甘露醇浓度、C_f测量最终甘露醇浓度,V_我是测量初始灌流液的体积,V_f是最后的灌流液的体积,计算C_avg(Ci - Cf) / ln (Ci / Cf), T是灌注时间在小时,W是肠道的重量在mg (¹²)。

髓过氧化物酶活性

髓过氧化物酶活性测定中性粒细胞积聚的指示(¹³)。短暂,结肠粘膜是均相溶液中含0.5%溴化hexa-decyl-trimethyl-ammonium (HTAB)溶解在50 mM / L磷酸钾缓冲(pH值6)和离心机2分钟20000 g在4°C。上层清液反应0-dianisidine和0.1更易与L H₂O₂。吸光度的变化率测量在460海里。髓过氧化物酶活动被定义为酶降解的数量1过氧化μmol /分钟37°C。活动表示为μ/毫克粘膜。

粘膜细胞因子分泌

结肠器官文化准备从控制和il - 10 gene-deficient老鼠。冒号被移除,冻得通红PBS和切成2毫米广场。每平方是清洗和悬浮在组织培养井(猎鹰3046;实验室的器具,正欲林肯公园,新泽西,美国)rpmi - 1640年补充10%胎牛血清,50 mM我,青霉素(100 U /毫升),链霉素(100 U /毫升)。文化在37°C 5%孵化有限公司₂为24小时。上层清液后24小时内,储存在-70°C细胞因子水平的分析。肿瘤坏死因子α(TNF-α)和interferon-γ(IFN-γ)水平细胞上清液测定使用ELISA(酶联免疫吸附试验)包(Medicorp,蒙特利尔,魁北克,加拿大)。

没有合酶活动

结肠粘膜均质在冰(mM)三组成的一个缓冲。HCl 50, EDTA 0.1、0.1 EGTA 2-mercaptoethanol 12, PMSF 1 (pH值7.4)。匀浆是孵化与阳离子交换树脂(AG) 50 w-x8 Na⁺在4°C) 5分钟耗尽内生精氨酸。转换的³H]精氨酸(³H] L-citrulline匀浆测定。实验NADPH的存在,没有Ca^{2 +}5毫米EGTA,进行确定^{2 +}独立号活动。蛋白质浓度测定采用布拉德福德法(¹⁴)。

统计分析

数据表示为值±SEM(均值的标准误差),通过线性回归甘露醇间隙和水运动(探针间隙规范化的价值没有净水运动)。统计分析使用统计软件进行SigmaStat (IL SPSS, Inc .,芝加哥,美国)。差异意味着使用方差分析进行评估或配对t在适当的地方测试。

结果

受伤的动物形象和组织学评估

小鼠与正常肠道菌群

没有区别在幼崽出生的平均数量控制和il - 10 gene-deficient母亲(数据未显示)。在2周的年龄,il - 10 genedeficient老鼠幼崽身体重量类似的控件(图1)。小鼠断奶年龄和3周,4周的年龄,il - 10 gene-deficient小鼠体重明显降低比agematched控制;这种差异持续整个研究。il - 10 gene-deficient老鼠显示正常结肠组织出现在2周的年龄(无花果。和3)。没有区别之间的结肠髓过氧物酶活动的控制(1.1μ/毫克蛋白)和il - 10 gene-deficient老鼠(1.4μ/毫克蛋白),确认缺乏中性粒细胞浸润。4周的年龄,il - 10 gene-deficient老鼠了轻度结肠炎,到达了一个高原的严重性在8周的年龄(无花果。和3)。然而,il - 10 gene-deficient老鼠没有出现回肠受伤在任何时候在16周(数据没有显示)。

无菌鼠

与il - 10 gene-deficient老鼠与肠道微生物区系,il - 10 gene-deficient老鼠提出在无菌条件下没有出现任何结肠粘膜炎症(图4),这表明炎症在il - 10 gene-deficient小鼠诱导了肠道微生物群落通常出现在腔内的胃肠道的头两周期间的生活。

结肠通透性

小鼠与正常肠道菌群

来确定是否存在主渗透率缺陷小鼠il - 10 gene-deficient中,我们检查了结肠渗透率在小鼠2周的年龄。在这个年纪,如上所述,没有组织学证据表明肠道炎症。图5表明体内结肠il - 10对甘露醇的渗透gene-deficient小鼠2周的年龄。渗透率对甘露醇增加双重渗透率agematched结果控制。甘露醇渗透率也在4和10周的年龄增加,在炎症的发展(图5)。

无菌鼠

再次与il - 10 gene-deficient老鼠在正常情况下,枚il - 10两星期genedeficient老鼠在无菌条件下提高了正常结肠通透性(图5),这表明肠道微生物区系的存在起到了作用观察渗透缺陷。

回肠渗透率

确定主要渗透缺陷是特定于结肠(即。,the area that was ultimately to be involved with inflammation), or whether it extended throughout the entire intestine, we measured in vivo ileal permeability to mannitol.

见图6回肠渗透率高出约3倍,il - 10 gene-deficient老鼠比年龄组在2周的年龄。主渗透率缺陷在这些老鼠出现在结肠和ileum-the后者从不参与炎症过程。

确定主渗透率缺陷在回肠瞬变现象,或持续在整个实验周期作为结肠缺陷,我们决心在体回肠渗透率甘露醇2到16周的年龄。与渗透率缺陷在结肠,坚持在16周,增强小鼠il - 10 gene-deficient回肠渗透率是在2周的年龄最大,回到与控制水平6周的年龄(图6)。

粘膜细胞因子水平

小鼠与正常肠道菌群

所示的促炎细胞因子IFN-γ和TNF-α一直破坏上皮屏障完整性体内和体外(^{15,- - - - - -18})。考虑到这种可能性,我们下个决心这两种细胞因子的分泌水平回肠和结肠组织枚老鼠两星期。图7表明,回肠和结肠组织中il - 10 gene-deficient小鼠自发产生大量IFN-γ和TNF-α比数量控制老鼠的组织。这表明,渗透缺陷识别在2周的年龄可能与增强IFN-γ和TNF-α水平有关。

无菌鼠

结肠组织枚il - 10两星期gene-deficient老鼠在无菌条件下提高了正常释放IFN-γTNF-α,表明促炎细胞因子释放的增加是由肠道微生物区系的存在。

结肠号合酶活性

证据表明一氧化氮介导IFN-γ-induced上皮通透性改变(¹⁹)。因此,我们下一个试图确定是否有改变NO-producing酶的活动,碳氮氧和进气阀打开。见图8,没有区别控制和il - 10在结肠cno gene-deficient动物活动任何年龄的检查。相反,在il - 10 gene-deficient老鼠,结肠伊诺活动增加与增加炎症直接相关,但不是在2周的年龄差异。这些数据表明,增加结肠渗透率在2周的年龄并不是引起增加一氧化氮的水平。

讨论

肠道通透性增加回肠和结肠的il - 10 gene-deficient老鼠之前组织学炎症的发展。这些渗透率的变化发生在与促炎细胞因子水平上升但不涉及一个老年病伊诺活动。il - 10 gene-deficient老鼠在无菌条件下没有组织学炎症,和渗透性和正常细胞因子水平。

正常的胃肠炎症反应是严格监管。产生的促炎和抗炎细胞因子的平衡CD4 +辅助(Th)子集1和2细胞(Thl和Th2)是这个管理过程的一个重要组成部分。Thl细胞主要产生2、IFN-γTNF-β,虽然Th2细胞产生高水平的il - 4, IL-5和il - 10 (^20.)。il - 10是一个强有力的单核细胞/巨噬细胞和细胞因子的生产装置的Thl淋巴细胞(^20.)和已被证明,以保护上皮屏障完整性体外(²¹)。增加粘膜IFN-γ水平的il - 10 gene-deficient老鼠组织学炎症的发病之前,建议Th1细胞被激活早期的疾病过程。同样,从CD患者粘膜活检也展示一个优惠Thl细胞因子的表达,IFN-γ和- 2 (^22,23)。TNF-α而言,这可以释放细胞因子激活巨噬细胞,中性粒细胞、淋巴细胞、内皮细胞和平滑肌细胞(²⁴)。没有组织学和生物化学的证据增加中性入侵被认为在回肠或2-weekold小鼠的结肠。因此,TNF-α水平可能表明一个antigeninduced常驻巨噬细胞的活化。当然,有一些猜测,直接刺激巨噬细胞释放的某些微生物结果TNF-α和il - 12,激活Thl细胞释放IFN-γ(²³)。在无菌条件下成长起来的il - 10 gene-deficient老鼠没有演示TNF-α或IFN-γ组织水平增加,这将表明,早期抗原抽样小型或大肠肠道微生物区系的提升者在这个模型的疾病过程。事实上,研究Sellon et al。(²⁴)表明,无菌小鼠il - 10 gene-deficient显示没有证据表明结肠炎或免疫系统激活,类似于我们在这项研究中观察到。

肠道通透性增加的原因仍然是投机。IFN-γ和TNF-α都被证明直接破坏上皮屏障完整性(^{15,- - - - - -18}),可能通过硝酸oxide-mediated机制(¹⁹)。一氧化氮是一种不稳定的氮激进派生虽然精氨酸转化为瓜氨酸的酶没有合酶(NOS)。至少有三个不同的亚型的号是存在于细胞(号我,第二号、第三号)(²⁵)。我号和二号都是本构Ca酶^{2 +}/ calmodulin-dependent,而NOS III是Ca-independent同种型(间接宾语)表示,在应对各种侮辱包括细菌或促炎细胞因子活动。与之前的研究结果相一致(²⁶),我们发现增加水平的成人il - 10的结肠伊诺活动gene-deficient老鼠。然而,我们没有发现差异控制在2周的年龄和il - 10 gene-deficient动物。缺乏差异表明,增加水平的不(间接宾语)不参与疾病的开始在这个模型或崩溃的上皮屏障完整性前炎症的发展。然而,IFN-γ之间的相互作用和TNF-α与特定受体的激活吞噬细胞是已知的导致质膜黄素蛋白NADPH氧化酶;随后,大量过氧化物和过氧化氢的释放。过氧化物可以与无反应释放碳氮氧形成了非常强大的氧化剂,过氧亚硝基(²⁷)。过氧亚硝基细胞毒性虽然很多独立的机制,包括脂质过氧化反应的起始和关键氨基酸的氧化,从而导致损失的完整性(²⁷)。当然从小鼠il - 10 gene-deficient获得的数据在无菌条件下提高表明肠道微生物区系诱导免疫反应在这些特异表达il - 10 gene-deficient老鼠TNF-α和IFN-γ水平上升的特征。然后,这些促炎细胞因子以某种方式行动打破粘膜屏障。进一步的研究将需要定义机制负责在il - 10 gene-deficient小鼠肠道通透性增加。

在啮齿动物,出生时整个胃肠道功能不成熟,仍然在前2周(²⁸)。在这段时间里,小肠是更多有渗透性地,允许增强吸收的脂质(^29日)和大分子(^30.)。因此,瞬态增加回肠渗透率可能仅仅表明成熟小鼠il - 10 gene-deficient回肠的慢。然而,吴et al。(^31日)也观察到在胃和小肠渗透率增加先于组织学结肠疾病的发展il - 10 gene-deficient老鼠。有趣的是,一个缺陷在结肠通透性没有观察到吴et al。(^31日),即使在结肠炎的发展。这些不同的结果可能导致的不同敏感性的技术用来测量渗透率或不同的环境下,这些老鼠。例如,吴et al。(^31日)测量渗透率使用口服一定剂量的蔗糖、乳果糖、甘露醇、蔗糖素和监控输出各种物质的尿液,而本研究使用直接体内灌注方法。此外,吴的研究中使用的小鼠(^31日)是在传统条件下,而我们的老鼠在特定的无菌条件下长大,而很明显,这些老鼠的环境提出影响疾病进展(^31日)。然而,我们的研究结果可能表明,il - 10 gene-deficient结肠炎小鼠模型,它是一个在小肠渗透性增加,导致结肠炎症通过增加抗原摄取。当然进一步调查是必要的。

承认

加拿大先灵葆雅公司,支持的il - 10 gene-deficient鼠标殖民地,和加拿大的克罗恩氏和结肠炎基金会,公司。

引用