系统发育分析失调在缓解溃疡性结肠炎

背景

肠道微生物的存在是一个先决条件溃疡性结肠炎(UC)的发展,虽然偏离正常肠道菌群的组成、生态失调,可能是与溃疡性结肠炎的病因。

方法

30 UC的粪便微生物群样本来自15个病人采样两次,从15名健康对照组来自2地理位置进行了分析使用高度可再生的系统发育的微阵列检测和量化的能力超过1000肠道细菌的宽动态范围。

结果

粪便微生物群组成没有显著受到地理位置、年龄、或性别,但明显不同的UC患者和对照组之间(P= 0.0004)。在缓解UC-associated微生物群是稳定的,类似的患者在所有加州大学。显著减少细菌的多样性的成员梭状芽胞杆菌集群IV和显著减少大量的细菌参与丁酸和丙酸代谢,包括瘤胃球菌属bromiirel。真细菌rectalerel。,Roseburiasp。Akkermansiasp.失调在加州大学的标志。增加大量的病原体包括(机会)梭菌属sp。消化链球菌属sp。幽门螺杆菌sp。弯曲杆菌sp.以及艰难梭状芽胞杆菌被发现与加州大学有关。

结论

失调在加州大学是稳定的时间从不同的地理位置和患者之间共享。微生物变化提供一个机械的了解疾病的发病机制。

溃疡性结肠炎(UC)是一种慢性的复发和汇款大肠炎性疾病,特点是积极的免疫反应被认为是引发共生的肠道微生物。加州大学的病因是复杂和不完全理解,但有一个共识,即发病机制包括遗传易感性因素、环境因素、免疫介导的组织损伤。¹的发生率显著增加加州移民的后代从发展中国家向发达地区说明了环境的重要性,尤其是饮食和生活方式因素在疾病的发展。²此外,加州大学的和合率同卵双胞胎(大约10%)明显不同于克罗恩氏病(大约30%)和显示环境贡献加州大学的主导地位。³免疫系统的机制可能涉及缺陷教育在儿童早期,这可能会导致误解或不适当的应对无害的环境刺激。

因为肠道微生物的存在是疾病发展的先决条件,几项研究已经寻找改变肠道菌群的组成在加州大学。近年来,应用分子和高通量技术被用来克服文化传统方法的局限性,使微生物多样性和功能的全面分析。⁴尽管证据表明微生物群的变化(失调)炎症性肠病(IBD)是新兴的,有更少的数据比与克罗恩病UC患者。⁵在最近的2全面的微生物群的研究,生态失调被分配到一个子集的克罗恩氏病和溃疡性结肠炎患者和加州大学的病人。^6,7此外,有许多技术和方法之间的差异的研究主要局限于病人从一个地理位置。虽然变化的意义,在人类肠道菌群的组成仍不确定,有证据表明,这种变化可能与提醒在加州大学微生物代谢活动。⁸

在这项研究中,我们应用一个全面、深度和高度可再生的系统发育微阵列检测和量化的能力超过1000肠道微生物⁶研究粪便微生物群的UC患者和健康对照组的2个欧洲的位置。UC患者疾病的研究在非活动(缓解)阶段2采样点调查如果疾病的微生物群组成在此阶段有可能引起复发。第一个应用程序的系统发育的微阵列分析微生物群的UC患者显示UC患者显著和稳定的生态失调,独立于他们的地理位置。扩展以前的观测结果,识别不平衡微生物群落的成员,并提供机械的解释可能作用的微生物群的UC发病机理可能促进生物标记的发展探索在加州大学。

材料和方法

参与者

研究小组由15 UC患者在2次取样缓解期间,他们招募了2处的欧洲项目PROGID (qlk1 - 2000 - 00563)包括科克大学、爱尔兰(9例),和医院一般Vall d ' hebron,西班牙巴塞罗那(6例)。条目,一个稳定剂量的患者5-aminosalicylic酸和糖皮质激素临床缓解期(中没有与一个活动活跃的症状和分数的< 4 colitic活动指数)。⁹所有患者的筛查艰难梭状芽胞杆菌glucosylating外毒素A和B在凳子上,没有一个病人毒素阳性。UC患者的平均年龄(6女人和9)35岁(范围、17-56年)。比较分析,15健康受试者(8妇女和7人)从相同的地理位置和类似的年龄(意思是,34年;范围,23-51年)被招募。

粪便DNA提取

共45收集粪便样本。UC患者两次采样之间的时间跨度1个月取样点样本(30),而健康的对照组(15)样品取样一次。后续交货,粪便样本被冻结在−20°C,干冰运输,储存在−20°C,直到进一步的处理。总DNA提取粪便使用修改后的协议QiaAmp DNA的小凳子工具包(试剂盒、希尔登,德国)。¹⁰DNA产量量化使用NanoDrop nd - 1000分光光度计(NanoDrop技术,威明顿、德)。DNA浓度调整到10 ng /μL并被用作模板PCR扩增和进一步的微阵列分析。

HITChip系统微阵列分析

分析人类的肠道(打击)芯片,系统芯片,执行,如前所述。¹¹简而言之,整个16 s rRNA从粪便DNA编码基因扩增技术使用启用的T7启动子序列的引物。RNA在体外转录amino-allyl-modified核苷酸的存在,后来被耦合到Cy3或Cy5染料。标记RNA是支离破碎的,2样品,每个携带不同的染料,杂化的HITChip微阵列是由安捷伦科技(Palo Alto, CA)。数组是清洗和扫描,数据提取获得使用安捷伦微阵列图像特征提取软件(www.agilent.com)。数据归一化和进一步的微阵列分析进行使用一组R-based脚本(http://www.r-project.org/)结合专门设计的关系数据库,运行MySQL数据库管理系统(下http://www.mysql.com/)。

所有样品都是杂化微阵列的两倍。最小满意2独立杂交过程之间的相关性为98%(以皮尔逊积矩相关的评估(r])。

HITChip微阵列包含duplicate-spotted 3699独特的16 s rRNA-targeting探针的特异性水平,包括(1)级别定义1,等于门除了进一步划分的硬壁菌门菌门梭状芽胞杆菌集群,¹²(2)二级,genus-like分类水平组phylotypes > 90% 16核糖体rna基因序列相似性,和(3)三级phylotype /物种水平。HITChip微阵列显示> 10000倍的动态范围,和大约100个独立的微阵列读数被用于这项研究。

数据分析

沃德的最小方差法用于分层聚类的微生物群的生成配置文件而矩阵之间的距离是基于样本r。测试不同参数对生成的复合的影响集群,每个集群组成描述使用2虚拟变量(1和0)分配给UC患者和对照组,女性和男性,西班牙和爱尔兰主题。不同集群组成不同的参数的函数被应用卡方测试评估产生的数据集。

通过计算评估总微生物群的相似r日志转换之间的杂交信号获得3699独特的HITChip探针一双样品。

总微生物群的多样性及其子组是由计算评估辛普森多样性指数倒数(1 / D)¹³使用方程λ= 1 /Σπ^ 2,π是i个分类单元的比例。每一个分类单元的比例计算,每个探测信号的比例与总信号相比HITChip总微生物群的分析,或与总信号获得一级系统组在评估一级系统组的多样性。辛普森多样性指数倒数考虑两个分类单元的数量在一个示例以及丰富的社区。辛普森的更高价值的互惠指数对应于一个更加多样化的社区。

评估如果2的数据集是明显不同的,P使用学生的价值计算t测试假设等于变量和2-tailed分布。之前的统计测试,数据集被日志转换为确保正态分布。统计测试时进行大量的变量消除错误发现率P值转换为问值。

综合多元统计分析、软件Canoco Windows 4.5¹⁴是使用。冗余分析(RDA)被用来评估细菌群体的丰度之间的相关性HITChip分析检测到的样本特征的函数。蒙特卡洛置换过程中实现Canoco软件包被用来评估统计学意义差异的大型数据集。排列的数量设置为2000,排列是无限制的,完整的模型应用。

结果

总粪便微生物群的系统发育分析和聚类分析

粪便微生物群的数组数据集来自45个样本的UC患者和健康对照组被收购,分层集群。加州大学和健康受试者集群根据健康状况的抽样点(图1 a和C;P< 0.0001)。聚类的微生物群的概要文件是独立的地理起源和对象的性别(P= 0.5633,P分别为= 0.9624)。

对照组的平均当中唯一的个人间的相似性为80.3% (SD, 5.2%),这是高于个人间的相似性之间的微生物群资料群UC患者,76.3% (SD, 7.8%),但差异不显著(P= 0.1936)。当微生物群的UC患者与对照组相比,获得的相似度明显低于健康对照组和平均值为73.5% (SD 9.7%),达到显著差异(P= 0.0198,图1 b)。微生物群的相似性之间的每个UC患者2样品评估,89.4%的平均值(SD, 10.1%)。这不是明显不同的个体内的变异的微生物群的健康受试者(数据相同时间间隔另一个HITChip-based健康受试者的研究¹¹)。尽管大多数的UC患者稳定的微生物群,比得上在健康受试者中观察到的微生物群的2例2样本之间的是非常不同的。没有明显的临床区别这两个UC患者,作为其中一个处于缓解期至少额外的11个月,而其他复发。

UC患者被发现的微生物群多样性显著低于对照组的微生物群(图2)。总细菌多样性的减少主要是由于减少的多样性梭状芽胞杆菌第四集群,这是唯一的一级系统组显著减少多样性检测。

定量和多元微阵列分析

分析不同细菌群体的量化贡献微生物群,被微生物群组成的平均杂交信号强度genus-like系统组。比较获得的杂交信号的UC患者和健康对照组的129分析系统组显示34系统组显著UC患者和对照组之间的不同(表1)。详细的分析显示,观察组内的差异可以归因于一个phylotype-uncultured新鲜的梭菌属的细菌HuCA6(资源库AJ408962)——是新描述的远亲Christensenella属和显示平均丰度在对照组26倍高于UC患者(在两个样本)。进一步详细的分析表明,在种特异的信号艰难梭状芽胞杆菌et rel.系统集团梭状芽孢杆菌物种平均高5倍丰度在UC患者。在同一个系统组c . glycolicum物种明显(三倍)更丰富的UC患者比对照组。

所有的肠道微生物群的系统发育组织显示重要的协会与地理起源或性别主题。

进行多变量分析(RDA)在样本数据的矩阵描述的杂交信号genus-like系统组和相关的环境变量包括年龄、地理起源、性别和健康状况。这RDA表明,在给定的环境参数,健康状况有最强的影响微生物群组成和数据集可以解释9.1%的变异(图3;P= 0.0004)。独立的性别和地理起源、20系统组显示强烈显著相关(P与健康状况(< 0.01)图3 b)。地理学科的起源可以解释5.4%的变异在整个数据集,但是这个因素的影响没有达到意义(P= 0.1034)。性别和年龄的主题并没有显著影响微生物群组成(P= 0.5412,P分别为= 0.9105)。当微生物群组成的UC患者样本收集2次相比,似乎UC患者非常相似的微生物群组成(P= 0.9345)。

讨论

全面、深入分析结果显示明显的失调与一个单独的集群总微生物群概要的UC患者和对照组(图1)。值得注意的是,这期间与病人样本聚类得到缓解,指示明显失调UC患者在没有疾病的症状。失调的持久性缓解是值得注意的,表明它可能有潜在致病性或代表一个环境风险因素,尽管确认与长期随访期间反复复发和缓解是可取的。相关性的发病机制失调的加州大学的象征,微生物群在UC患者(类似图1)。除了减少微生物多样性(图2),生态失调包括定量变化UC患者和对照组之间细菌组(图3)。年龄,性别,和地理起源对微生物群组成没有显著影响。

减少细菌的加州大学的主要影响成员的多样性梭状芽胞杆菌集群四门中厚壁菌门,它与其他报告是一致的。^{15,- - - - - -18}减少细菌的多样性和数字子组有2个在加州大学广泛的影响;第一个损耗的土著居民肠道可能导致的损失对宿主生理代谢的影响;其次,这可能提供的优势与潜在的机会主义的微生物引起积极的免疫反应。我们的研究结果是一致的但证据前两个场景更具挑战性,因为大多数结肠细菌物种尚未培养及其病理生理的潜力是未知的。¹⁹在无教养的细菌与未知的生理无教养的梭菌的我出现在10倍低丰度比对照组患者的加州大学。这个细菌群体的最重要UC-associated失调(表1;图3)和要求表示关系的进一步研究。

粪便的UC患者表现出明显的代谢主要是因为丁酸盐的生产和其他短链脂肪酸(SCFA)。^8,20.短链脂肪酸水平较低的微生物群加州大学可能与大量的减少瘤胃球菌属bromii,这是抗性淀粉的主要肠降能器,醋酸形成。²¹在级联反应,使用醋酸生产真细菌rectale -相关的物种产生丁酸。在目前的研究中,这两种细菌组显著降低UC患者的粪便。丁酸产量低加州大学也可能因为butyrate-producing的损耗Roseburiasp。²²减少butyrate-producing细菌数量在IBD患者也被别人发现,⁶和丁酸盐代谢的作用一直是在加州大学进行辩论。^23,24最近,减少在丁酸氧化相关基因的表达被报道在UC患者粘膜,²⁵这可能与减少细菌生产的衬底。SCFA有抗炎作用²⁶通过G-protein-coupled受体介导43和一连串的细胞凋亡和先天immunity-related流程。²⁷值得注意的是丙酸和丁酸盐一样,也有抗炎的潜力,²⁶我们发现了丰富的典型的丙酸生产在我们的病人。尽管一个丙酸生产国(Akkermansia muciniphila丙酸)是枯竭的5倍,其他不那么丰富的生产者-Megamonassp。Megasphaerasp。Mitsuokellasp.-were增加UC患者的粪便。减少Akkermansiasp. UC患者的活检最近报道。^28,Akkermansiasp.种植只黏蛋白和居住地区接近肠道上皮细胞。^29日尽管的影响Akkermansiasp.仍在研究中,^30.很明显,这些细菌与宿主能够密切互动引起多个先天和适应性免疫反应的主机。^31日

代谢饮食芳香族化合物在UC患者似乎也被改变,如图所示,耗尽hippurate尿排泄。³²一个无教养的菌株与hippurate呈正相关尿排泄已被确认为mpn-isolate组25(资源库AF357573),有关leptum梭状芽胞杆菌。³³我们发现一个phylotype 98%相似的序列(adhufec168,基因库AF132242)及其亲属显著减少UC患者的粪便。报告减少hippurate排泄在炎症性肠病的疾病可能与失调有关。³⁴我们还发现,无教养的phylotypes相关Sporobacter在加州大学枯竭;唯一代表的这群细菌培养,美国termitidis,只长在芳香族化合物,³⁵这提供额外支持的观点microbe-mediated芳香族化合物的代谢可能受损的加州大学。

其他微生物代谢物与调节免疫反应的能力包括两性离子多糖脆弱拟杆菌,这是保护在结肠炎动物模型。³⁶我们不能确认是否变化拟杆菌sp.在我们的研究和其他研究^6,37通过这样的途径影响人体生理学。值得一提的是,证据的作用拟杆菌sp.在加州大学这是相互矛盾的报道一些报告增加了丰富的细菌集团在UC患者。^16,20.,38

本研究的另一个重要的观察报告问题的主要还原一个无教养的细菌(资源库AJ408962)内无教养的梭菌的。超过20倍,这减少了丰度是最显著的差异之一UC患者和对照组的微生物群。没有知道这个无教养的生物体的生理,但是相关的注意,相同的16 s rRNA基因序列已经从肠道样本检索也从家庭灰尘。^39,40项目细菌的丰度的主要还原UC患者可能会提供支持卫生假说。⁴¹

一些细菌群体在目前研究发现增加了丰富的加州大学(表1图3 b)。例如,梭菌属sp. UC患者增加。它已被证明梭菌属varium从加州大学促炎小鼠模型。⁴²它也表明,局部感染梭菌属sp.负责急性阑尾炎的大多数情况下,⁴³建议这对肠道炎症细菌群体的重要性。同样的,2的最近的研究提供了证据梭菌属sp.参与大肠癌。^44,45其他病原体被发现是在加州大学在这个研究包括增加弯曲杆菌sp.和幽门螺杆菌sp。,这是符合这些细菌的报道在UC患者结肠活检。^46,47此外,我们发现签名的艰难梭状芽胞杆菌在UC患者的粪便。梭状芽孢杆菌,曾被发现在UC患者复发^48,49和缓解。⁵⁰病人招募研究检验了负面的外毒素A和B表明这些菌株梭状芽孢杆菌在加州大学没有毒素形成抽样但可能代表一个严重疾病的危险因素,以等待的抗生素。⁵¹

最后,我们观察到一个程度的增加消化链球菌属sp.在加州大学。这组氨基酸acid-degrading细菌曾被发现在更多cultivation-based UC患者与对照组的研究。⁵²同样的,消化链球菌属sp.增加结直肠癌患者的粪便样本。⁵³大量的增加消化链球菌属sp.以及减少Roseburiasp.在同一个病人,除了增加的梭菌属sp,微生物生态失调的模式共同加州大学和结肠直肠癌。当无菌鼠被殖民大肠杆菌和消化链球菌属sp,引入第二个细菌刺激宿主免疫反应大肠杆菌。⁵⁴因为没有致病特性尚未被分配到消化链球菌属sp免疫反应的方向,对其他潜在的致病菌,在加州大学增加,可能代表了一种机制,通过这种机制消化链球菌属sp.导致加州大学的病理。

总之,全面、深入分析UC患者的粪便微生物群从2地理位置已确认在缓解一个稳定的生态失调,与几个微生物的变化提供一个机械的了解疾病的发病机制。

引用

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