体外gydF4y2Ba全血的分泌干扰素(IFN) -γ和IFN-γ-inducible protein-10以酶联免疫吸附试验IFN-γ一样敏感的检测酶联immunospot gluten-reactive T细胞人类白细胞抗原(HLA) dq2·5gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba相关的腹腔疾病gydF4y2Ba

总结gydF4y2Ba

T细胞释放细胞因子分析是用于诊断传染病,但不是自身免疫或过敏性疾病。腹腔病(CD)是一种常见的T细胞介导的疾病诊断的gluten-dependent肠道炎症和血清学的存在。许多病人不能被诊断出患有乳糜泻,因为他们减少膳食蛋白在医学检查。在CD患者口服蛋白挑战无谷蛋白饮食(GFD)动员gluten-reactive T细胞可衡量的干扰素(IFN) -γ酶联immunospot有关酶联免疫斑点)(或主要组织相容性复合体(MHC)二类四聚体。Immunodominant肽在90%的病人拥有相当一致的hla dq2·5。我们旨在开发全血化验检测gluten-specific T细胞。前后血液收集面筋GFD捐助者的挑战证实CD (gydF4y2BangydF4y2Ba= 27,hla dq2·5gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba),GFD捐助者证实没有CD (gydF4y2BangydF4y2Ba= 6 hla dq2·5gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba11 hla dq2·5gydF4y2Ba^−gydF4y2Ba)和捐助者CD不遵循GFD (gydF4y2BangydF4y2Ba= 4,hla dq2·5gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba)。等离子体IFN-γ和IFN-γ诱导protein-10 (IP-10)后,酶联免疫吸附试验(ELISA)测定全血孵化肽或醇溶蛋白,并与有关酶联免疫斑点。IFN-γT细胞试验无法区分乳糜泻病人和控制之前挑战,但面筋挑战后全血IFN-γ有关酶联免疫斑点都85%敏感和ELISA和特定hla dq2·5 100%gydF4y2Ba^+gydF4y2BaCD患者;整个血液IP-10 ELISA特殊敏感的94%和100%。我们得出结论,整个血液细胞因子释放化验是敏感和具体检测gluten-reactive T细胞CD;进一步临床研究解决这些测试的效用不确定诊断乳糜泻患者是十分必要的。gydF4y2Ba

介绍gydF4y2Ba

腹腔病(CD)是一种T细胞介导autoimmune-like疾病引发的谷蛋白的摄入小麦、黑麦、大麦和有时基因易感个体燕麦。唯一治疗CD是一个严格的终身无谷蛋白饮食(GFD)。在美国社区普遍存在的CD是0·7%,但83%的病例难以识别(gydF4y2Ba1gydF4y2Ba]。解决这个问题尚未被满足的医疗需求,准确诊断病人是被自我诊断基于症状反应GFD (gydF4y2Ba2gydF4y2Ba),也由不一致坚持临床指南推荐确认小肠活检而麸质饮食中包含(gydF4y2Ba3gydF4y2Ba,gydF4y2Ba4gydF4y2Ba]。事实上,假阳性CD-specific血清学是常见的即使在个体基因容易CD,因为他们携带主要组织相容性复合体(MHC)二类基因对人类白细胞抗原(HLA) dq2·5, HLA dq2·2和/或HLA dq8 [gydF4y2Ba5gydF4y2Ba]。因此,可能会有很多病人严格避免面筋谁会更适合其他疗法(gydF4y2Ba6gydF4y2Ba]。同时,CD的并发症如骨质疏松症可能不是解决患者在其他真正有CD,但之后GFD而不是小肠组织学证实。在这两种情况下,患者GFD往往不愿恢复谷蛋白所必需的数周或数月引起血清学和组织学复发为了确认CD [gydF4y2Ba7gydF4y2Ba]。gydF4y2Ba

之前我们的观察,为期3天的口腔面筋挑战动员gluten-reactive T细胞,它被认为T细胞循环血液中没有反映gluten-reactive的特异性T细胞在肠道gydF4y2Ba8 - 10gydF4y2Ba]。随后,隔夜干扰素(IFN) -γ酶联immunospot有关酶联免疫斑点)(化验和MHC-peptide多聚体使用新鲜分离外周血单核细胞(PBMC)提供了详细的抗原决定基的理解层次结构和CD4 T细胞的表型循环在CD患者6天后开始口服蛋白挑战[gydF4y2Ba10 - 12gydF4y2Ba]。gydF4y2Ba

检测血液中T细胞特定的immunodominant gluten-derived抗原表位提出了作为CD[诊断工具gydF4y2Ba13gydF4y2Ba,gydF4y2Ba14gydF4y2Ba]。事实上,一些试验平台测量抗原T细胞已进入临床实践。例如,酶联免疫吸附试验(ELISA)有关酶联免疫斑点检测IFN-γ或和monokine (IFN-γ-inducible protein-10, IP-10)释放在全血或PBMC孵化与抗原肽可以用于诊断gydF4y2Ba结核分枝杆菌gydF4y2Ba感染(gydF4y2Ba15 - 19gydF4y2Ba]。gydF4y2Ba

作为概念证明,我们试图测试等离子体水平是否IFN-γ或IP-10口服后在全血收集面筋挑战然后孵化immunodominant肽或醇溶蛋白可以区分CD患者与其他患者采用了GFD。gydF4y2Ba

材料和方法gydF4y2Ba

参与者和临床过程gydF4y2Ba

知情同意是获得所有的参与者。这项研究是人类研究伦理委员会批准的皇家墨尔本医院(2003·009)和沃尔特和伊莱扎霍尔医学研究所的(03/04)。CD受试者招募广告的腹腔维多利亚和塔斯马尼亚岛。受试者从他们的饮食,因为他们认为各种排除面筋消化麸质和全身症状,但没有CD (non-CD对照组),被杰西卡Biesiekierski博士提到,胃肠病学,莫纳什大学,盒子山。入学率从2009年7月到2010年9月,开放,从2011年4月到10月。志愿者实现连续进入标准都被登记了。进行招聘和临床方面的临床研究单位在皇家墨尔本医院。受试者中都是白种人和描述gydF4y2Ba表1gydF4y2Ba。所有受试者完成了研究。gydF4y2Ba

包含在研究中要求受试者被诊断出患有乳糜泻,声称严格GFD至少6个月,或最近被诊断CD从他们的饮食,但不排除面筋或没有CD,但报道不良症状后谷蛋白摄入,遵循一个严格的GFD 6个月或更长时间。受试者只包括如果他们biopsy-proven CD符合ESPGHAN(儿科胃肠病学的欧洲社会,肝病和营养)标准(gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba]。对照组后GFD包括只有他们评估之前CD和小肠正常组织学虽然在“正常”的饮食或他们不具备hla DQ2·5 DQ2·2或DQ8基因型。使用免疫抑制剂是一种排斥。gydF4y2Ba

血血清学和细胞因子释放化验了早上(d0)和前6天(d6)后开始面筋的挑战,或在未经处理的CD患者GFD开始之前。血液被运送在实验室环境温度,在那里收到的1 h内集合。安德森口服蛋白最初描述的挑战gydF4y2Ba等gydF4y2Ba。(gydF4y2Ba10gydF4y2Ba,发生在第一天上午(d1)第三天(d3)。症状日记完成每天从d1 d6,科目记录症状和分级在三分李克特量表(轻微、中等和严重之分)。所有受试者通过电话访谈后的4 - 6周内症状面筋的挑战。gydF4y2Ba

血清学和HLA打字gydF4y2Ba

血清转谷氨酰胺酶(tTG-IgA) deamidated麦胶蛋白肽(文章)免疫球蛋白(Ig)和DGP-IgG评估商业套件(发票708760、704525和704520;圣地亚哥INOVA诊断、钙、美国)的临床诊断实验室(Gribbles-Healthscope,克莱顿,澳大利亚)。等位基因编码的存在hla DQ2·5 DQ2·2和DQ8决心leucocyte-derived DNA使用两个以前报道的方法之一[gydF4y2Ba21gydF4y2Ba,gydF4y2Ba22gydF4y2Ba]。gydF4y2Ba

抗原gydF4y2Ba

两个合成肽,包含两个重叠的抗原表位(DQ2·5-glia-α1a /α2和DQ2·5-glia-ω1 /ω2)custom-synthesized至少95%纯度经高效液相色谱法(HPLC)和液相色谱-光谱(Pepscan Lelystad,荷兰)gydF4y2Ba23gydF4y2Ba]。肽是溶解在二甲亚砜(DMSO)(σD2650)(σ,圣路易斯,密苏里州,美国)100毫克/毫升然后稀释5毫克/毫升磷酸盐(PBS)。的最大DMSO浓度与血液或孵化项目PBMCs v / v 0·1%。醇溶蛋白(# 101778;ICN生物医学,极光,哦,孕育了美国)在10倍超额胰凝乳蛋白酶(σ# C3142)在碳酸氢铵(pH值8)4 h在37°C,然后煮15分钟。蛋白质浓度的醇溶蛋白水解物确定使用BioRad蛋白质测定染料试剂# 500 - 0006方法(BioRad、大力神、钙、美国)。脱氨基醇溶蛋白水解物的豚鼠肝转谷氨酰胺酶(σT5398)如前所述执行gydF4y2Ba10gydF4y2Ba,gydF4y2Ba13gydF4y2Ba]。gydF4y2Ba

全血培养和IFN-γIP-10 ELISAgydF4y2Ba

细胞因子释放化验进行在一个专门的学术沃尔特和伊莱扎大厅研究所免疫学实验室由单一,训练研究生研究生(n . o),他并没有失明的诊断对象。新鲜肝素化全血(1毫升)添加到cryotubes(1毫升NUNC Cryotube, # 377224;鲁开德、丹麦)含有缩氨酸,deamidated chymotrypsin-digested醇溶蛋白(醇溶蛋白,100μg /毫升),或破伤风类毒素(10 LFU /毫升;CSL,澳大利亚墨尔本)。Cryotubes倒大力10倍,确保混合抗原的血液。在37°C孵化后24 h,样本离心机,享年1000岁gydF4y2BaggydF4y2Ba在室温下10分钟(RT)。等离子体是收集和储存在−80°C到分析。gydF4y2Ba

血浆IFN-γ水平d0和d6 ELISA测定一式三份;96 -好平底的聚苯乙烯板(NUNC Maxisorb # 442404)被涂上一层100μl捕获抗体2μg /毫升(1-D1K,与PBS稀释1:50 0;Mabtech, Nacka链,瑞典)和孵化一夜之间在4°C,然后洗两次与PBS和孵化1 h RT 200μl屏蔽解决方案[PBS / 0·05%渐变20/1%牛血清白蛋白(BSA)]。阻塞的解决方案是丢弃和100μl Mabtech重组人类IFN-γ或100μl测试样本稀释1:2 ELISA稀释剂(Mabtech # 3652 - d2)被添加到个别井。在4°C隔夜孵化后,井与PBS / 0·05%洗五次渐变20。100生物素化的检测抗体的μlμg /毫升(Mabtech 7-B6-1-biotin稀释1:1000 PBS / 0·05%渐变20/0·1% BSA)被添加到每个和孵化1 h在沿井洗,然后100μl streptavidin-horseradish过氧化物酶(Mabtech稀释1:1000 PBS / 0·05%渐变20/0·1% BSA)被添加到每个好,孵化1 h rt,最后,化验是发达与100年μl四甲基联苯胺(三甲)衬底10分钟rt, hgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba所以gydF4y2Ba_4gydF4y2Ba2米(50μl)被用来阻止解决方案。自动ELISA读者(Multiskan上升,热Labsystems,芬兰)是用来测量吸光度在450 nm,和IFN-γ水平测定用标准曲线。gydF4y2Ba

血浆IP-10水平在d6 ELISA测定一式三份(BD OptEIA 550926;美国BD生物科学,圣何塞,CA)与制造商的少量修改协议;96孔板(NUNC Maxisorb 442404)被涂上一层100μl捕获抗体(51 - 27321 e)稀释摘要在PBS和孵化一夜之间在4°C。盘子洗了三次与PBS包含渐变20 0·05%,然后封锁了PBS / 10%胎牛血清(FCS) 1 h rt,阻塞的解决方案是丢弃,然后100μl标准或样品稀释1:20或1:10在PBS / 10% FCS被添加到个别井。在4°C隔夜孵化后,井被洗的五倍以上,100μl检测器的解决方案是添加到每个和孵化1 h rt,探测器解决方案包括两个检测抗体(51 - 27322 e稀释1:1000)和streptavidin-horseradish过氧化物酶共轭(51 - 27326 e稀释摘要)FCS在PBS / 10%。井洗上面的7倍和100μl三甲衬底的解决方案是添加在黑暗中30分钟的rt, HgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba所以gydF4y2Ba_4gydF4y2Ba2米(50μl)被用来阻止解决方案。吸光度测量如前所述。gydF4y2Ba

有关酶联免疫斑点试验IFN-γgydF4y2Ba

PBMC肝素化全血分离收集使用Ficoll-Paque d6 +(通用电气医疗集团)和密度梯度离心法在50毫升Leucosep™管(格瑞恩Labortechnik, Kresmuster,奥地利)。在PBS洗了三次之后,PBMC resuspended完全RPMI补充10% heat-inactivated汇集人类血清(澳大利亚红十字会血液服务,墨尔本,澳大利亚),2毫米GlutaMAX™(gydF4y2BaGibcogydF4y2Ba表达载体,卡尔斯巴德、钙、美国),100μM修改鹰的介质(MEM)非必需氨基酸(gydF4y2BaGibcogydF4y2Ba、表达载体)和50μM 2-mercaptoethanol(σ)。一夜之间有关酶联免疫斑点试验IFN-γ(Mabtech)使用96孔板(MSIP-S45-10;美国微孔,贝德福德,MA)进行如前所述[gydF4y2Ba10gydF4y2Ba,gydF4y2Ba13gydF4y2Ba]。简单地说,0·5×10gydF4y2Ba^6gydF4y2Ba镀PBMCs每口井都为每个条件和开发的斑点在37°C孵化后24 h。捕获和检测anti-IFN-γ抗体(分别1-D1K和7-B6-1)是一样的用于检测的ELISA IFN-γ血浆从全血。Phytohaemagglutinin-P (PHA;σ)作为阳性对照的最终浓度2·5μg /毫升,因为它更一致的有关酶联免疫斑点试验比IFN-γ破伤风类毒素。每一个抗原进行了一式三份。Spot-forming单位(学院)在个别井数有关酶联免疫斑点读者使用一个自动化(有关酶联免疫斑点读者援助系统;援助Autoimmun Diagnostika GmbH, Strassberg,德国)和结果表示为每10个学院gydF4y2Ba^6gydF4y2BaPBMC。gydF4y2Ba

统计分析gydF4y2Ba

数据分析使用GraphPad棱镜版本5·0 (GraphPad软件、圣地亚哥、钙、美国)。克鲁斯卡尔-沃利斯检验是用来计算之间的差异有关酶联免疫斑点,IFN-γIFN-γELISA和IP-10 ELISA反应之间的组织。细胞因子测定反应使用斯皮尔曼秩相关测试。确切概率法是用来比较的比例科目症状和症状治疗CD和控制之间的关系。意义了gydF4y2BaPgydF4y2Ba< 0·05)。gydF4y2Ba

的诊断性能分析比较使用接受者操作特征(ROC)曲线分析和曲线下面积(AUC)分析利用MedCalc软件(gydF4y2Bahttp://www.medcalc.orggydF4y2Ba),根据汉利和麦克尼尔的方法gydF4y2Ba24gydF4y2Ba]。否决了antigen-dependent IFN-γ和IP-10估计使用MedCalc和理想的假阳性率(0%)。结果分级"正面",如果反应的克分子数相等的肽鸡尾酒DQ2·5-glia-α1a /α2 DQ2·5-glia-ω1 /ω2(肽组合)或醇溶蛋白高于所选截止,不论积极的控制响应;“负面”如果反应肽组合或醇溶蛋白低于所选截止,不不定;和“不定”,如果反应肽组合或醇溶蛋白是消极和积极控制反应也是负的。gydF4y2Ba

对肽的反应,醇溶蛋白和积极控制评估背景减法后的反应(Nil /无抗原)。测试样品和IFN-γIP-10水平达到或超过上限的量化赋值等于最大的标准。最终结果提出有关酶联免疫斑点值均值ELISA和三个复制等离子体或PBMC样本。对全血化验,质量控制是由interassay变异系数(CV)使用简历的公式=(标准差(他)/意味着)×100。Interassay变异性有关酶联免疫斑点试验没有评估,因为这需要冷冻PBMCs的使用,并提供信息的可变性分析和低温贮藏和细胞解冻。gydF4y2Ba

结果gydF4y2Ba

为期3天的谷蛋白的临床反应和耐受性的挑战gydF4y2Ba

所有受试者能够完成协议,为期三天的挑战和不需要任何医疗干预(gydF4y2Ba表2gydF4y2Ba)。一个non-CD主题和两个CD主题报道恶心和呕吐的第一天的挑战。之间没有显著差异的数量CD 27岁(21)和non-CD科目17(15)报告症状在面筋的挑战。引起的症状已经完全解决的挑战d6在12 21症状的CD和15 non-CD对照组症状之一。后续的所有症状参与者后4 - 6周完成面筋挑战确认决议challenge-associated症状。gydF4y2Ba

血清学在为期3天的谷蛋白是稳定的挑战gydF4y2Ba

血清学调查结果并没有改变d0和d6之间在任何科目。所有non-CD控制受试者血清反应阴性的tTG-IgA, DGP-IgA和DGP-IgG (gydF4y2Ba表1gydF4y2Ba),但八治疗CD主题显示轻度或中度海拔至少在一个CD-specific血清学测试。边缘海拔在血清学d0五治疗CD受试者在一个测试中被发现(tTG-IgA 22个单位在一个DGP-IgA 20 - 30单位3和DGP-IgG 36单位;正常范围0-20单位),一个CD主题tTG-IgA适度上升,在82户,和另一个显示海拔DGP-IgA(62单元)和DGP-IgG(32个单位)。另一个主题在所有三个边缘至中等水平升高血清学测试,但声称遵循严格GFD(62年tTG-IgA DGP-IgA 27, DGP-IgG 20单位)。相比之下,所有四个未经处理的hla dq2·5gydF4y2Ba^+gydF4y2BaCD受试者血清反应阳性的tTG-IgA而三DGP-IgA升高,和三个异常DGP-IgG一致持续的谷蛋白暴露。gydF4y2Ba

抗原为最大优化gydF4y2Ba体外gydF4y2BaIFN-γ反应gydF4y2Ba

当我们和其他人已经表明,有关酶联免疫斑点是一种有效的工具来评估IFN-γgluten-specific T细胞反应(gydF4y2Ba12gydF4y2Ba,gydF4y2Ba25gydF4y2Ba),我们试图评估和比较的性能使用全血ELISA-based格式可以在临床实践中实现的,它的诊断gydF4y2Ba结核分枝杆菌gydF4y2Ba感染(gydF4y2Ba26gydF4y2Ba]。细胞因子释放的孵化条件选择化验是改编自那些用于整个血液细胞因子释放测试批准的诊断gydF4y2Ba结核分枝杆菌gydF4y2Ba感染(QuantiFERON-TB金;Cellestis、Chadstone、澳大利亚),它利用三个血液采集管每1毫升血液anti-coagulated孵化没有添加剂作为消极的控制,或与PHA积极控制,或与测试肽。在这项研究中,有关酶联免疫斑点试验被认为是IFN-γ参考标准。在我们的手中,有关酶联免疫斑点试验使用IFN-γ17 mer肽包括DQ2·5-glia-α1a /α2抗原表位是定性重复使用同一个捐赠者的PBMC收集后在第6行和第7天开始口服面筋的挑战,也当同一个捐赠者是重新6 - 12个月后gydF4y2Ba13gydF4y2Ba]。gydF4y2Ba

有关酶联免疫斑点试验IFN-γELISA和利用相同的抗体对(gydF4y2Ba10gydF4y2Ba,gydF4y2Ba11gydF4y2Ba,gydF4y2Ba13gydF4y2Ba]。反应的大小有关酶联免疫斑点和全血IFN-γELISA IFN-γ释放化验了DQ2·5-glia-α1a /α2或DQ2·5-glia-ω1 /ω2肽相似在六个治疗hla DQ2·5gydF4y2Ba^+gydF4y2BaCD d6科目(gydF4y2Ba图1gydF4y2Ba)。有一个趋势的克分子数相等的混合物DQ2·5-glia-α1a /α2或DQ2·5-glia-ω1 /ω2肽(肽混合物)诱发更强IFN-γ反应比独自肽。的大小反应了肽组合类似于chymotrypsin-digested, deamidated醇溶蛋白(醇溶蛋白)的有关酶联免疫斑点和ELISA IFN-γ,但在三个6例对麦胶蛋白的反应也发现之前面筋的挑战。在血液收集从hla dq2·5 d6gydF4y2Ba^+gydF4y2BaCD,孵化与肽组合刺激血浆IFN-γ水平与学院密切相关的有关酶联免疫斑点(IFN-γgydF4y2BangydF4y2Ba= 27个;gydF4y2BargydF4y2Ba= 0·839,gydF4y2BaPgydF4y2Ba< 0·0001)(gydF4y2Ba图2一个gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

面筋peptide-stimulated生产IFN-γIP-10是特定的治疗乳糜泻后的挑战gydF4y2Ba

没有不确定的或丢失的结果在任何治疗的27个CD和17 non-CD GFD后对照组。治疗CD组,IFN-γ全血混合ELISA反应肽显著d6面筋后挑战大于d0,相比没有抗原(gydF4y2Ba图3gydF4y2Ba)。反应的醇溶蛋白治疗CD患者d6均明显高于无抗原控制,但d0的区别和d6没有达到统计学意义(gydF4y2Ba图3gydF4y2Ba)。IFN-γ反应gluten-derived肽高于负控制中没有检测到未经处理的CD患者(数据未显示)。non-CD学科之间没有显著差异反应肽组合或醇溶蛋白d0和d6 (gydF4y2Ba图3 bgydF4y2Ba)。此外,等离子体的亚组分析显示IFN-γ水平全血后孵化与肽混合物或醇溶蛋白之间没有不同hla dq2·5gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba和hla dq2·5gydF4y2Ba^−gydF4y2Banon-CD对照组d0或d6。支持这些发现,也观察到类似的结果d6样品当IP-10水平测量与IFN-γ血浆从全血(gydF4y2Ba图3 c, dgydF4y2Ba)。IFN-γ和IP-10水平在等离子体全血孵化与抗原也密切相关的有关酶联免疫斑点反应IFN-γ使用相同的血液样本(PBMCgydF4y2Ba图3 e, fgydF4y2Ba)。符合IFN-γ全血ELISA,之间有紧密的相关性IP-10全血ELISA和有关酶联免疫斑点测量后面筋IFN-γ挑战和刺激与肽混合物(gydF4y2Ba图2 bgydF4y2Ba)(gydF4y2BangydF4y2Ba= 25治疗CD;gydF4y2BargydF4y2Ba= 0·822,gydF4y2BaPgydF4y2Ba< 0·0001)。IFN-γ之间的相关性或IP-10全血有关酶联免疫斑点用醇溶蛋白作为抗原ELISA和IFN-γ并不像使用混合肽(gydF4y2BangydF4y2Ba= 27治疗CD;gydF4y2BargydF4y2Ba= 0·444,gydF4y2BaPgydF4y2Ba< 0·05gydF4y2BangydF4y2Ba= 25治疗CD;gydF4y2BargydF4y2Ba= 0·372,gydF4y2BaPgydF4y2Ba< 0·05)。gydF4y2Ba

等离子体水平的IFN-γ和IP-10孵化后全血与破伤风类毒素相似的处理和未经处理的CD和non-CD科目,并影响面筋挑战(gydF4y2Ba图3gydF4y2Ba和未经处理的未显示)。平均破伤风toxoid-stimulated IFN-γ全血反应在治疗CD d6主题是27倍肽(70 pg / ml)混合。全血孵化后意味着等离子IP-10水平与破伤风类毒素(8100 pg / ml),肽(9900 pg / ml)和醇溶蛋白(5400 pg / ml)都是水平接近或量化的限制之外IP-10 ELISA。gydF4y2Ba

这些发现显示IFN-γ分泌和IP-10刺激gydF4y2Ba体外gydF4y2Ba孵化的血液immunodominant麦胶蛋白肽或醇溶蛋白区分hla dq2·5 d6面筋后挑战gydF4y2Ba^+gydF4y2BaCD患者GFD从未经处理的hla dq2·5gydF4y2Ba^+gydF4y2BaCD,从non-CD对照组GFD后,non-CD控制是否阳性hla dq2·5。gydF4y2Ba

blood-based细胞因子释放的性能分析在GFD CD患者gydF4y2Ba

为了确定的诊断性能IFN-γIP-10释放化验在这个探索性研究,ROC曲线分析采用减法后没有抗原反应(gydF4y2Ba图4gydF4y2Ba)。分析、CD科目GFD后被认为是“疾病”的情况下,和hla dq2·5gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba和hla dq2·5gydF4y2Ba^−gydF4y2Banon-CD对照组GFD后被认为是“十几例。没有统计上显著的差异的AUC细胞因子释放化验使用或醇溶蛋白作为抗原肽组合。然而,AUC IFN-γ全血ELISA使用醇溶蛋白作为抗原(0·72,95%可信区间(CI): 0·56-0·85)明显低于相应的试验使用混合肽(0·96,95%置信区间CI: 0·85 - 0·99) (gydF4y2BaPgydF4y2Ba< 0·05)。得到了类似的结果比较的AUC IP-10释放试验用醇溶蛋白作为抗原(0·79,95%置信区间CI: 0·63 - 0·90)和混合肽(0·99,95%置信区间CI: 0·90 - 1·0) (gydF4y2BaPgydF4y2Ba< 0·05)。相比之下,之间没有统计上的显著差异的AUC有关酶联免疫斑点使用IFN-γ醇溶蛋白(0·81,95%置信区间CI: 0·66 - 0·92)或混合肽(0·93,95%置信区间CI: 0·81 - 0·99) (gydF4y2BaPgydF4y2Ba> 0·05)。gydF4y2Ba

积极的否决测试估计使用ROC曲线分析在antigen-dependent价值观和理想的假阳性的否决肽混合物和醇溶蛋白作为抗原。使用这些碎屑所示的敏感性和特异性gydF4y2Ba表3gydF4y2Ba。gydF4y2Ba

理想的假阳性的否决也被评估。值得注意的是,四个六个理想的假阳性的碎屑被MedCalc计算相同,表明这些化验的截止已经优化的假阳性率0%。全血IFN-γ和IP-10 elisa和有关酶联免疫斑点使用肽与新鲜PBMC IFN-γ混合产生敏感性的26日,48个和19%,分别高于醇溶蛋白利用的时候。为IP-10全血使用肽混合ELISA,理想的假阳性截止较高检出率较低(92%,95%置信区间CI: 74·0 - 99·0)。对于IFN-γ全血ELISA使用醇溶蛋白作为抗原,理想的切断假阳性较高,大大降低检出率(11%,95%置信区间CI: 2·4-29)。gydF4y2Ba

IFN-γELISA使用的敏感性和特异性肽组合并不显著影响进行ROC曲线分析时的十几例,包括只有六个hla dq2·5gydF4y2Ba^+gydF4y2Banon-CD对照组,而不是所有17个non-CD科目。持续的谷蛋白消费保持疾病活动和与CD-specific血清学升高有关,进一步探索亚组分析non-CD相比,只有那些CD受试者血清反应阴性的tTG-IgA, DGP-IgA和DGP-IgG (gydF4y2BangydF4y2Ba= 19 CD和gydF4y2BangydF4y2Ba= 16 non-CD对照组)。在这个场景中,有关酶联免疫斑点在d6 IFN-γIP-10全血ELISA和肽混合物产生的诊断敏感性为89%(95%置信区间CI: 66 * 8 - 98 * 7), 100%(95%置信区间CI: 81·5 - 100)和95%(95%置信区间CI: 73 * 9 - 99 * 8),分别;特异性分别为100%(95%置信区间:79·4 - 100)IFN-γELISA,和94%(95%置信区间CI: 69 * 7 - 99 * 8)有关酶联免疫斑点。IP-10 ELISA和敏感的细胞因子释放化验用醇溶蛋白作为抗原都低于69%,特异性为88%(95%置信区间CI: 61 * 7 - 98 * 4) IFN-γELISA和100%(95%可信区间:79·4 - 100)有关酶联免疫斑点。IP-10 ELISA和综上所述,这些研究结果支持的高敏感性和特异性细胞因子释放化验使用肽将孵化与血液收集治疗乳糜泻病人后的挑战。gydF4y2Ba

最后,ROC曲线分析在24 CD和16 non-CD对照组评估如果增量反应肽之间的混合d0和d6 IFN-γ全血ELISA是一个更好的预测比反应CD d6。敏感性为83%(95%置信区间CI: 62·6 - 95·2)和特异性为94%(95%置信区间CI: 69 * 7 - 99 * 8)之间的增量响应d0 d6,仅略低于d6反应(gydF4y2Ba表3gydF4y2Ba)。总之,这些结果表明,评估全血的血浆IFN-γ孵化与肽组合足以区分hla dq2·5gydF4y2Ba^+gydF4y2BaCD患者后GFD和non-CD科目GFD之后,他们是否携带hla dq2·5。gydF4y2Ba

全血测定的重现性和IFN-γIP-10 ELISA检测高gydF4y2Ba

因为升高反应gluten-derived肽在全血ELISA开始后被发现,只有在d6面筋挑战和化验需要新鲜血液,这是不可能的,以评估样本来自同一病人在不同的日子确定interassay变异。因此,我们决定全血测定的重现性与一个血液样本从六个CD捐助者在d6分为三个独立的全血实验(共18全血化验)。与肽混合物或醇溶蛋白刺激后,血浆浓度IFN-γELISA测定的复制,和简历计算(gydF4y2Ba表4gydF4y2Ba)。全血的interassay变异实验12·8%时使用醇溶蛋白肽混合物和16·9%。gydF4y2Ba

评估IFN-γ和IP-10 ELISA interassay可变性,血浆样品与外部的限制水平的量化分配较低或上限量化一些IP-10结果(例如4000)。就会生成一个简历的0时,他们不包括在内。因此,并不是所有的CD和non-CD对照组加入到研究包括在每个分析(右列,gydF4y2Ba表4gydF4y2Ba)。CVs是不到12%的治疗CD主题和non-CD对照组当计算通过个人简历的意思是使用三种复制清单上的每一个项目(gydF4y2Ba表4gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

讨论gydF4y2Ba

可靠的罕见的检测抗原T细胞对翻译至关重要的T细胞免疫学领域的诊断,治疗和预防疫苗。虽然抗原T细胞检测用于监控新疫苗和免疫疗法,临床诊断测试测量抗原T细胞一直局限于慢性感染,如gydF4y2Ba结核分枝杆菌gydF4y2Ba和巨细胞病毒感染gydF4y2Ba27gydF4y2Ba]。原则上,T细胞诊断可能与T细胞介导的自身免疫性疾病相关,但致病性T细胞的频率在血液或低于检测水平,即使是最敏感的化验。gydF4y2Ba

我们最初的观察,口服蛋白挑战动员gluten-reactive T细胞频率很容易检测到有关酶联免疫斑点,IFN-γ复制了几组(gydF4y2Ba10 - 13gydF4y2Ba,gydF4y2Ba25gydF4y2Ba]。这种“现实生活”抗原的挑战重新激活记忆T细胞反应提供了第一个明确的T细胞表位层次人类T细胞介导的疾病(gydF4y2Ba11gydF4y2Ba]。在当前的研究中我们使用前后血液收集面筋的挑战,测试反应抗原蛋白质和肽和比较三个试验设计允许高效检测hla dq2·gluten-reactive T细胞特定的5gydF4y2Ba^+gydF4y2BaCD患者。gydF4y2Ba

在这个探索性研究,只有病人始终显示检测T细胞反应蛋白肽口服蛋白挑战后hla dq2·5gydF4y2Ba^+gydF4y2BaCD GFD后科目。谷蛋白的挑战之前,这些患者区别non-CD科目后GFD和未经处理的CD科目。IFN-γIP-10释放化验有关酶联免疫斑点和/或使用ELISA格式与血液收集后面筋挑战进行同样的检测gluten-reactive T细胞。在这些分析中,两个合成肽的混合物包含immunodominant hla dq2·5-restricted gluten-derived抗原表位能够提供足够的抗原刺激,实现高灵敏度和特异性hla dq2·5gydF4y2Ba^+gydF4y2BaCD。gydF4y2Ba

目前的概念验证研究仅限于hla dq2·5gydF4y2Ba^+gydF4y2BaCD患者因为这个基因型是发现在90%的病人和T细胞表位的影响层次被gluten-reactive T细胞hla dq2·5gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba病人是守恒的,很好理解(gydF4y2Ba11gydF4y2Ba,gydF4y2Ba28gydF4y2Ba]。的身份和相对重要性gluten-derived肽被T细胞分离从CD患者不携带hla dq2·5也不是定义为hla dq2·5gydF4y2Ba^+gydF4y2BaCD。gydF4y2Ba

目前尚不清楚,谷蛋白本身引起胃肠道症状的患者没有CD但是选择避免含谷蛋白的食物(gydF4y2Ba6gydF4y2Ba),但口服蛋白挑战3天被证实CD患者同样容忍和控制患者排除饮食蛋白,因为他们用各种消化系统和相关系统的症状。然而,如果测试大型前瞻性招募病人军团,口服蛋白可能挑战甚至3天可能不会容忍因为观察到当前组志愿者自愿同意吃面筋。幸运的是,口头面筋挑战3天不会引起绒毛萎缩或重大建筑中断在CD患者小肠粘膜组织学缓解(gydF4y2Ba14gydF4y2Ba]。gydF4y2Ba

BrottveitgydF4y2Ba等gydF4y2Ba。最近评估潜在的fluorescence-activated细胞分选仪(流式细胞仪)的分析利用MHC类II-peptide四聚体检测DQ2·5-glia-α1a和DQ2·5-glia-α2 epitope-specific T细胞在血液后三天谷蛋白挑战CD患者的诊断后GFD [gydF4y2Ba14gydF4y2Ba]。本研究中描述的细胞因子释放化验以及四聚物进行分析,这是85%的敏感和100%的特定hla dq2·5gydF4y2Ba^+gydF4y2BaCD (gydF4y2Ba14gydF4y2Ba]。最近,这些发现在CD患者使用MHC四聚体也被复制从美国gydF4y2Ba29日gydF4y2Ba]。gydF4y2Ba

当前的研究突出了整个blood-based IFN-γIP-10释放化验有关酶联免疫斑点检测的罕见一样有效gluten-specific T细胞。有关酶联免疫斑点是一个健壮且敏感的测定IFN-γ罕见的检测抗原T细胞并用于临床试验,但需要血液被运送到一个中央设备和专业技术能力(gydF4y2Ba30 -gydF4y2Ba]。输送新鲜血液会导致降低T细胞功能和引入了一个被假阴性(测试的风险gydF4y2Ba33gydF4y2Ba]。当翻译的诊断gydF4y2Ba结核分枝杆菌gydF4y2Ba感染,现场全血直接进入专门的孵化gydF4y2Ba结核分枝杆菌gydF4y2Baantigen-stimulation管之后,测量等离子体IFN-γELISA已经证明是实用和已经批准的诊断gydF4y2Ba结核分枝杆菌gydF4y2Ba感染(gydF4y2Ba15 - 17日gydF4y2Ba]。gydF4y2Ba

作为一个潜在的诊断检测hla dq2·5gydF4y2Ba^+gydF4y2BaCD患者GFD后,全血细胞因子释放化验似乎是敏感的和具体的。另一个好处是在当前诊断测试执行已经GFD后,病人的动员gluten-reactive CD到血液中的T细胞特定需要口服蛋白挑战只有3天,而不是所需的数周或数月基于异常小肠组织学诊断。gydF4y2Ba

确认gydF4y2Ba

作者要感谢志愿者参与本研究的帮助杰西卡Biesiekierski博士和腹腔维多利亚和塔斯马尼亚岛的支持志愿者招聘、技术援助和亚当Girardin先生。n . o .被墨西哥墨西哥奖学金支持科学技术理事会(CONACyT);j . T.-D。是由一个NHMRC研究生医学奖学金;m·h·格兰特被一个NHMRC项目支持;和r·p·a·沃尔特和伊莉莎的伊恩•麦凯联谊厅墨尔本研究所和健康。支持的工作是腹腔澳大利亚,NHMRC项目拨款406656号,NHMRC独立研究机构基础设施支持方案批准号361646年和维多利亚州政府运营基础设施支持。gydF4y2Ba

作者的贡献gydF4y2Ba

n . O。:main investigator, acquisition, analysis and interpretation of the data, statistical analysis, manuscript preparation; J. T.-D.: study concept and design, analysis and interpretation of the data, statistical analysis, manuscript preparation; M. H.: study design, analysis and interpretation of the data, revision of the manuscript; R. P. A.: study concept and design, supervision of the study, statistical analysis, revision of the manuscript. All authors approved the final version of the manuscript. Guarantor of the article: Dr Robert Anderson.

披露的信息gydF4y2Ba

j . T.-D。和r . p . a .共同发明人的专利属于使用谷蛋白肽在治疗,诊断和无毒蛋白;都是股东Nexpep ImmusanT企业有限公司和r . p . a .,公司(美国)。r . p . a .首席科学官和j . T.-D。是ImmusanT顾问有限公司充分披露是提供给所有的参与者。gydF4y2Ba

引用gydF4y2Ba