使用宏基因组方法确定人类口腔原生菌群的抗生素耐药潜力gydF4y2Ba

摘要gydF4y2Ba

对微生物群落中编码抗生素耐药性的基因的流行率和身份的研究通常只在该群落中可培养的成员上进行。然而，通过采用宏基因组方法进行此类研究，可以将目前尚不能培养的生物体包括在内。在这项研究中，从三组20名成年人中制备了四个口腔微生物的宏基因组文库，并筛选耐抗生素克隆。4个文库中均存在对四环素和阿莫西林耐药的克隆，3个文库中存在对庆大霉素耐药的克隆。克隆中编码四环素抗性的基因经鉴定为阳性gydF4y2Ba春节gydF4y2Ba(M),gydF4y2Ba春节gydF4y2Ba(O),gydF4y2Ba春节gydF4y2Ba(问),gydF4y2Ba春节gydF4y2Ba(W),gydF4y2Ba春节gydF4y2Ba37,gydF4y2Ba春节gydF4y2Ba(A)然而，在所有三组被调查的个体中只检测到前三种。gydF4y2Ba

简介gydF4y2Ba

人类的口腔中蕴藏着庞大而多样的微生物群，在这些菌群中可能存在700多个细菌类群中的任何一种(gydF4y2Ba威尔逊,2005gydF4y2Ba)．很明显，与许多天然微生物群落一样，存在的微生物中有很大一部分(高达50%)尚未被培养(gydF4y2Ba坦纳gydF4y2Baet al。gydF4y2Ba,1994年gydF4y2Ba)．因此，为了避免这一问题，人们对使用分子方法(如宏基因组学)来研究口腔菌群的组成和功能(gydF4y2BaDiaz-TorresgydF4y2Baet al。gydF4y2Ba,2003年gydF4y2Ba；gydF4y2Ba邓肯,2003gydF4y2Ba；gydF4y2Ba坂本gydF4y2Baet al。gydF4y2Ba,2005年gydF4y2Ba)．口腔菌群的一个重要特征是它能成为耐抗生素微生物的蓄水池(gydF4y2Ba沃克,1996gydF4y2Ba；gydF4y2Ba罗伯茨,1998gydF4y2Ba；gydF4y2Ba准备好了gydF4y2Baet al。gydF4y2Ba,2003年gydF4y2Ba)．口腔细菌很容易到达身体的其他部位(通过吞咽和通过血液)，也可以传播给其他人(咳嗽，接吻等)。因此，耐抗生素口腔细菌有机会通过社区迅速传播，并将其耐药基因转移到其他细菌物种。几乎所有关于耐抗生素口腔细菌流行率的调查都仅仅基于可培养菌群，因此没有考虑到这些复杂菌群中大量尚未培养的细菌(gydF4y2BaPreusgydF4y2Baet al。gydF4y2Ba,1995年gydF4y2Ba；gydF4y2Ba沃克,1996gydF4y2Ba；gydF4y2Ba罗伯茨,1998gydF4y2Ba；gydF4y2Ba准备好了gydF4y2Baet al。gydF4y2Ba,2003年gydF4y2Ba)．为了克服这个问题，我们使用了宏基因组方法来识别成人口腔菌群中编码抗生素耐药性的基因的存在。这涉及到从这些个体唾液和菌斑中存在的总DNA中生成表达库，并筛选产生的克隆对抗生素的耐药性。gydF4y2Ba

材料和方法gydF4y2Ba

病人和抽样gydF4y2Ba

唾液和菌斑样本来自三组参加伊士曼牙科医院正畸牙科诊所的健康成人。每个小组由20人组成。所有的个体都很健康，没有任何口腔疾病。此外，这些患者在过去的3个月内没有接受过任何抗生素治疗。在无菌容器中收集唾液样本(2ml)。用无菌拭子采集菌斑样本，用无菌纸点从4个不同部位采集龈缘菌斑样本;两种样品均加入4ml的林格氏溶液中，并与唾液样品混合。每组20名患者的斑块/唾液样本汇集在一起，提供三组斑块和唾液的组合。gydF4y2Ba

宏基因组文库的制备与筛选gydF4y2Ba

在3500℃下离心分离法分别收集三组血小板/唾液样本中的细菌gydF4y2BaggydF4y2Ba， 4°C放置10分钟。在无菌盐水中轻轻清洗三颗细菌球。三批细胞中的每批都按照下面的描述进行处理。每批细胞制备两个等分体，根据制造商的说明，从其中一个等分体中使用纯革兰氏阳性DNA分离方案提取DNA，从另一个等分体中使用纯革兰氏阴性DNA分离方案提取DNA。提取的DNA随后被汇集在一起。为制备用于文库构建的DNA, 0.2 mL DNA(浓度为250 ng mLgydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba})使用超声波均质器(IKA-WERKE)，以80%的功率在冰上超声5 s。用2u mg的浓度处理DNA的末端gydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}将100 μL的绿豆核酸酶(Promega)在37℃下浸泡1 h，产生钝端。用琼脂糖凝胶电泳分离得到的DNA片段，从凝胶中切割800 ~ 3000 bp的片段，用Qiagen琼脂糖纯化试剂盒进行纯化。为了在克隆到TOPO-XL载体之前生成3’-A悬垂物，DNA片段在75°C下以1 U mg的浓度培养1小时gydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}的gydF4y2BaTaqgydF4y2BaDNA聚合酶(Bioline)的最终体积为1 × 100 μLgydF4y2BaTaqgydF4y2Ba包含2毫米dATP的缓冲区。在连接到载体之前，使用Qiagen PCR纯化试剂盒纯化DNA。DNA连接到TOPO-XL，随后转化成gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2BaTOP10细胞按照制造商的协议进行。然后对每个文库进行筛选，寻找对四环素、庆大霉素或阿莫西林具有耐药性的克隆。菌落选择在含50 μg mL的Luria-Bertani (LB)琼脂板上gydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}卡那霉素(载体编码)和四环素、庆大霉素或阿莫西林，浓度分别为10、15和10 μg mLgydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}分别从耐药菌株中分离到质粒DNAgydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2Ba菌落使用Qiagen Miniprep试剂盒。质粒被重新转化成gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2Ba并进行筛选，以确认插入的DNA是产生抗性的原因。gydF4y2Ba

在TOPO-XL中构建了三个宏基因组文库(每批样品一个)。使用EpiFOS Fosmid试剂盒(epiccentre)从第三批样品中构建了第四个文库——这允许更大的插入尺寸，因此有可能识别产生耐药性决定因素的生物体。EpiFOS利用了一种新策略，克隆随机剪切，末端修复的DNA。因此，2.5 μg基因组DNA在水剪切装置(GeneMachine USA)中被剪切，该装置利用水动力剪切力将DNA链碎片gydF4y2BacgydF4y2Ba．40 kb的碎片。通过运行脉冲场凝胶电泳(PFGE;Bio-Rad FIGE Mapper电泳系统)具有制造商推荐的用于分离10-100 kb DNA的电压和斜坡时间。为了产生钝端，5 '磷酸化的DNA插入物，使用末端修复酶Mix和10 × Buffer, dNTPs和ATP进行端修复反应，由epiccentre提供。根据制造商的协议进行结扎反应和fosmid包装。fosmid文库以包装好的fosmid克隆的效价为基础，然后将稀释的噬菌体颗粒与EPI细胞(epiccentre)混合，37℃吸附20分钟，每10 μL稀释的噬菌体颗粒与100 μL细胞的比例混合。fosmid克隆选择在含有12 μ mL的Luria-Bertani (LB)琼脂板上gydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}氯霉素，37°C孵育过夜。在含有四环素、庆大霉素和阿莫西林浓度分别为10、15和10 μg mL的LB板上筛选耐氯霉素克隆gydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba},分别。gydF4y2Ba

4个文库被复制到96孔的微量滴定板中，冷冻介质，保存在−80℃。gydF4y2Ba

四环素耐药克隆的最低抑菌浓度(MICs)gydF4y2Ba

使用琼脂稀释技术测定每个四环素耐药克隆的MIC。根据NCCLS推荐，使用0.5 Macfarland标准对接种物进行标准化，并使用多点接种器(Mast Diagnostics, Bootle, UK)在添加5%去纤维马血并包含一系列四环素浓度的等敏琼脂平板(Oxoid)上接种。在37°C好氧培养24 h后，四环素抑制可见生长的最高稀释倍数为MIC。gydF4y2Ba金黄色葡萄球菌gydF4y2BaNCTC 6571和IsoSensitest肉汤(Oxoid)分别作为阳性和阴性对照。gydF4y2Ba

四环素耐药基因的鉴定gydF4y2Ba

如前所述，采用PCR方法鉴定四环素耐药基因(gydF4y2Ba阿明诺夫gydF4y2Baet al。gydF4y2Ba,2001年gydF4y2Ba；gydF4y2BaVilledieugydF4y2Baet al。gydF4y2Ba,2003年gydF4y2Ba)．用于鉴定各种基因的引物见gydF4y2Ba表1gydF4y2Ba．对于最近发现的gydF4y2Ba春节gydF4y2Ba(37)基因，标准pcr采用以下特异性引物:Tet37F, 5 ' -AGGGATATTGGTTGGAGA-3 ';Tet37R 5“-ATCAGTCTCATATTTCGACA-3”。所有PCR产物均用正向引物XLF-2 (5 ' -CGC CAG TGT GAT GGA TAT-3 ')和反向引物XL-2R (5 ' -TAG AAT ACT CAA GCT ATG C-3 ')进行测序。使用pCC1/pEpiFOS lp -2反向测序引物(5 ' TACGCCAAGCTATTTAGGTGAGA 3 ')对Fosmid克隆进行部分测序。gydF4y2Ba

根据制造商的说明，在应用生物系统(Applied Biosystems, Foster City, CA)的310型基因分析仪或373型DNA测序仪(AB Biosystems)上使用ABI PRISM BigDye终结者循环测序协议进行测序反应。DNA序列分析使用DNAMAN 5.2.2版本程序(Lynnon Biosoft)。相似性分析是通过GenBank的Advance Blast项目进行的(美国国家卫生研究院国家生物技术信息中心，华盛顿特区)，并使用欧洲生物信息学研究所(gydF4y2Bahttp://www.ebi.ac.uk/gydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

结果gydF4y2Ba

在TOPO-XL载体中产生了三个包含唾液/斑块样本中细菌DNA的独立文库。这些库中的平均插入大小为3 kb，最大的插入为gydF4y2BacgydF4y2Ba．7 kb。为了获得更大的插入大小(平均大小=40 kb)，还从fosmid中的第三批样本中制备了第四个库。对四环素和阿莫西林耐药的克隆均在各文库中检测到，而对庆大霉素耐药的克隆仅在1、2和4文库中检测到(gydF4y2Ba表2gydF4y2Ba)．四环素耐药克隆是每个文库中最常见的耐药类型。单株抗四环素克隆的mic范围为4 ~ 30 μg mLgydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}而四环素的MICgydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2Ba仅携带TOPO-XL为1 μg mLgydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}．在所有四个文库中，编码四环素耐药性的基因包括gydF4y2Ba春节gydF4y2Ba(M),gydF4y2Ba春节gydF4y2Ba(O)和gydF4y2Ba春节gydF4y2Ba(问)(gydF4y2Ba表3gydF4y2Ba)．在1号文库中，一个编码对四环素耐药性的新基因(gydF4y2Ba春节gydF4y2Ba37)经鉴定(gydF4y2BaGillespiegydF4y2Baet al。gydF4y2Ba,2002年gydF4y2Ba)，而在#3和#4库中gydF4y2Ba春节gydF4y2Ba(W)和gydF4y2Ba春节gydF4y2BaA(D)也被检测到。此外，还包含了库#3gydF4y2Ba春节gydF4y2Ba(一)。gydF4y2Ba

表4gydF4y2Ba展示了四个文库中检测到的四环素抗性决定因子的身份以及最接近的四环素抗性克隆序列同源性。gydF4y2Ba

讨论gydF4y2Ba

本研究的目的是确定是否可以使用宏基因组方法来确定大量成年人口腔菌群中编码对三种不同种类抗生素代表性成员的耐药基因的存在。进一步的目标是确定那些负责赋予四环素耐药性的基因。克隆和表达一个微生物群落的基因组DNA有很大的潜力来评估和获取一个群落的所有遗传能力，包括那些居住在目前还不能培育的分类单元(gydF4y2Ba现在,2004gydF4y2Ba)．尽管许多研究报告了宏基因组方法的应用，以确定微生物群落产生抗生素的能力，但很少有人使用该技术来确定微生物群落固有的抗生素耐药性(gydF4y2BaGillespiegydF4y2Baet al。gydF4y2Ba,2002年gydF4y2Ba；gydF4y2BaMoreiragydF4y2Baet al。gydF4y2Ba,2004年gydF4y2Ba)．gydF4y2BaRiesenfeld。(2004)gydF4y2Ba从土壤样品中检出9个对氨基糖苷类抗生素耐药的无性系和1个对四环素耐药的无性系。此外,gydF4y2BaDiaz-Torres。(2003)gydF4y2Ba报道了一种新型四环素耐药性决定因子的鉴定，gydF4y2Ba春节gydF4y2Ba(37)，在一个从人类口腔菌群中制备的宏基因组文库中。gydF4y2Ba

在这项研究中，我们从三组20名成年人的本地口腔菌群中准备了宏基因组文库，并对它们进行了耐抗生素克隆的筛选。每个文库中都有对四环素和阿莫西林具有耐药性的克隆，其中三个文库中也有对庆大霉素具有耐药性的克隆。我们在这些克隆中鉴定了一些编码四环素耐药的基因，发现主要编码核糖体保护蛋白-的基因gydF4y2Ba春节gydF4y2Ba(M),gydF4y2Ba春节gydF4y2Ba(O),gydF4y2Ba春节gydF4y2Ba(Q)和gydF4y2Ba春节gydF4y2Ba(W).其他检测到的基因是gydF4y2Ba春节(gydF4y2Ba一)和gydF4y2Ba春节gydF4y2Ba(37gydF4y2Ba）gydF4y2Ba．文库中抗四环素克隆的比例高得惊人。然而，对这些克隆的测序显示，许多是编码核糖体蛋白质或人类蛋白质的基因，这些基因通过有待建立的机制使宿主对四环素产生耐药性。被调查的三组口腔微生物的四环素耐药基因谱非常相似，所有组都有耐药性gydF4y2Ba春节gydF4y2Ba(M),gydF4y2Ba春节gydF4y2Ba(O)和gydF4y2Ba春节gydF4y2Ba(Q).在对第一组个体中出现的四环素抗性基因进行基于培养的分析中，发现了更多种类的基因(gydF4y2BaVilledieugydF4y2Baet al。gydF4y2Ba,2003年gydF4y2Ba)．因此，除了gydF4y2Ba春节gydF4y2Ba(M),gydF4y2Ba春节gydF4y2Ba(O)和gydF4y2Ba春节gydF4y2Ba(Q)，检测到以下基因:gydF4y2Ba春节gydF4y2Ba(W),gydF4y2Ba春节gydF4y2Ba(年代)gydF4y2Ba春节gydF4y2Ba(左),gydF4y2Ba春节gydF4y2Ba(一)和gydF4y2Ba春节gydF4y2Ba(K).这暗示了某些四环素抗性基因的表达可能存在问题gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2Ba．事实上，我们有数据可以证明这一点。gydF4y2Ba

核糖体蛋白的产生结合和保护核糖体免受四环素的作用，是革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌对四环素耐药的一种常见机制(gydF4y2Ba斯皮尔,1992gydF4y2Ba；gydF4y2Ba罗伯茨,1996gydF4y2Ba)．到目前为止，已经描述了编码核糖体保护蛋白的9类基因:gydF4y2Ba春节gydF4y2Ba(M),gydF4y2Ba春节gydF4y2Ba(O),gydF4y2Ba春节gydF4y2BaB (P),gydF4y2Ba春节gydF4y2Ba(问),gydF4y2Ba春节gydF4y2Ba(年代)gydF4y2Ba春节gydF4y2Ba(W),gydF4y2Ba春节gydF4y2Ba(T)gydF4y2Ba春节gydF4y2Ba(32)和gydF4y2Ba春节gydF4y2Ba(36)，其中最常见的是gydF4y2Ba春节gydF4y2Ba(美元)(gydF4y2Ba乔普拉和罗伯茨，2001年gydF4y2Ba)．这些基因成功的原因之一是它们通常包含在接合转座子中，而接合转座子的宿主范围非常广(gydF4y2Ba罗伯茨,2005gydF4y2Ba)．四环素的酶促失活由两个功能相似的决定因子编码:gydF4y2Ba春节gydF4y2Ba(X)和gydF4y2Ba春节gydF4y2Ba(37)。的gydF4y2Ba春节gydF4y2Ba(X)基因分离自厌氧肠gydF4y2Ba拟杆菌gydF4y2Ba转座子(gydF4y2Ba斯皮尔gydF4y2Baet al。gydF4y2Ba, 1991年gydF4y2Ba),而gydF4y2Ba春节gydF4y2Ba(37)克隆自口腔宏基因组(gydF4y2BaDiaz-TorresgydF4y2Baet al。gydF4y2Ba,2003年gydF4y2Ba)．这两种基因产物在氧和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)的存在下对四环素进行了化学修饰。然而，到目前为止，还没有开展过评估这两个基因分布的调查。对四环素产生耐药性的第三个机制是通过产生外排蛋白。它们由不同的四环素抗性基因编码，gydF4y2Ba春节gydF4y2Ba(一)gydF4y2Ba春节gydF4y2Ba(I)多见于革兰氏阴性菌和gydF4y2Ba春节gydF4y2Ba(K)和gydF4y2Ba春节gydF4y2Ba(L)广泛分布于革兰氏阳性菌中。来自革兰氏阴性菌的外排基因通常与大型质粒相关，其中大多数是接合的，而来自革兰氏阳性菌的外排基因通常在较小的可传递质粒上发现(gydF4y2Ba乔普拉和罗伯茨，2001年gydF4y2Ba；gydF4y2Ba罗伯茨,1996gydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

对人类可培养口腔菌群的研究表明，最常遇到的负责四环素耐药性的基因是gydF4y2Ba春节gydF4y2Ba(M),gydF4y2Ba春节gydF4y2Ba(O),gydF4y2Ba春节gydF4y2Ba(Q)和gydF4y2Ba春节gydF4y2Ba(W) (gydF4y2Ba拉克鲁瓦和沃克，1995年gydF4y2Ba；gydF4y2BaOlsvikgydF4y2Baet al。gydF4y2Ba,1994年gydF4y2Ba，gydF4y2Ba1995gydF4y2Ba；gydF4y2Ba兰开斯特gydF4y2Baet al。gydF4y2Ba,2003年gydF4y2Ba；gydF4y2BaVilledieugydF4y2Baet al。gydF4y2Ba,2003年gydF4y2Ba)．有趣的是，在本研究的所有四个宏基因组文库中，这三个基因是唯一检测到的四环素耐药编码基因。这项研究的结果表明，可以使用宏基因组方法来确定微生物群落的抗生素耐药潜力，包括来自目前尚未培养的生物体的耐药潜力，也可以确定负责这种耐药的基因。gydF4y2Ba

确认gydF4y2Ba

该项目由医学研究理事会拨款G9900875资助。gydF4y2Ba

参考文献gydF4y2Ba