拟杆菌vulgatus和拟杆菌dorei减少肠道微生物脂多糖生产和抑制动脉粥样硬化
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文摘
背景:
人们越来越认识到肠道微生物群发挥关键作用在动脉粥样硬化性心血管疾病的发展。以前,我们报道,丰富的属拟杆菌降低患者的冠状动脉疾病(CAD) CAD与冠心病危险因素的患者,比或健康志愿者。然而,目前尚不清楚,以及特定的肠道细菌导致动脉粥样硬化的进展。
方法:
我们招募了CAD患者和控制没有CAD患者冠心病危险因素。然后我们比较肠道微生物组成在粪便样本使用16 s核糖体RNA基因测序与微分检测物种丰度在两组之间。随后,我们使用atherosclerosis-prone老鼠研究机制这样的物种和动脉粥样硬化之间的关系。
结果:
人类粪便16 s核糖体RNA基因测序显示大量的显著降低拟杆菌vulgatus和拟杆菌dorei在CAD患者。证实了这个重要的微分丰度定量聚合酶链反应。强饲法与生活b . vulgatus和b . dorei减毒atherosclerosis-prone小鼠动脉粥样硬化病变的形成,明显改善内毒素后通过减少肠道微生物脂多糖生产,有效地抑制促炎的免疫反应。此外,CAD患者粪便脂多糖含量明显高于与大量的负相关b . vulgatus和b . dorei。
结论:
我们转化研究成果确定一个未知的特定的肠道细菌和动脉粥样硬化之间的关系。治疗与生活b . vulgatus和b . dorei可能有助于预防冠心病。
临床试验注册:
URL:https://upload.umin.ac.jp/cgi-open-bin/ctr_e/ctr_view.cgi?recptno=R000018051。唯一标识符:UMIN000015703。
临床的角度来看
什么是新的吗?
分析肠道微生物在患者冠状动脉疾病(CAD)显示了一个相对损耗拟杆菌vulgatus和拟杆菌dorei相比之下,没有CAD与冠心病危险因素控制。
强饲法与生活b . vulgatus和b . dorei减少粪便和血浆脂多糖在载脂蛋白水平和防止动脉粥样硬化E-deficient老鼠。
CAD患者粪便脂多糖含量明显高于没有CAD与控制。
临床意义是什么?
拟杆菌治疗可能作为一种新颖的和有吸引力的治疗策略,抑制lipopolysaccharide-induced CAD的炎症反应。
介绍
增加识别的肠道微生物群及其在宿主代谢和免疫作用促进了前所未有的兴趣发展肠道microbiota-related对许多疾病的诊断和治疗靶点。下一代测序技术和multiomics方法微生物世界的极大地扩展我们的知识。越来越多的证据表明强烈的肠道微生物群之间的关系和心血管疾病的进展,而且我们之前报道的这样一个关系首次冠状动脉疾病(CAD)。1,2三甲胺(TMA)和TMA N-oxide,肠道微生物群膳食磷脂酰胆碱的代谢产物,是已知的与心血管疾病有关,尤其是与动脉粥样硬化过程。3,4metagenome-wide协会研究表明,肠道微生物酶生产TMA浓缩在CAD患者与健康对照组相比。5这一发现支持了令人鼓舞的前景,防止通过肠道微生物群调制CAD是可行的。然而,最近的临床试验表明矛盾的结果表明鱼类消费量大幅增加循环TMA N-oxide水平,突显出实质性的限制在当前的理解饮食和肠道微生物群之间的关系管理TMA N-oxide生产。6
属拟杆菌包括一些主要的肠道细菌在人类已知保持健康的肠道生态系统中一个重要的角色。7个人分为菌群3,却能合成更多形成的特点是低水平的拟杆菌,8症状性动脉粥样硬化的发生率更高。1,9此外,拟杆菌大量被发现降低动脉粥样硬化患者缺血性中风和短暂性脑缺血发作。10符合这些观察,我们之前的研究使用terminal-restriction片段长度多态性分析证实的丰富拟杆菌比专注降低CAD患者冠心病危险因素患者或健康志愿者。1,2总的来说,这些发现强烈建议之间的关系拟杆菌和计算机辅助设计。然而,目前尚不清楚具体拟杆菌物种都和他们的确切作用在CAD。11
CAD是全球发病率和死亡率的主要原因,尽管广泛使用他汀类药物治疗在过去的十年。12本研究的目标是确定元素可以作为目标的肠道微生物群的小说,对预防CAD廉价的治疗策略。为了实现这一目标,我们首先执行16 s rRNA (rRNA)基因sequencingto比较或没有CAD患者肠道菌群,我们发现大量的拟杆菌vulgatus和拟杆菌dorei在CAD患者减少。随后,我们进行了一系列的分析澄清underlyingmechanisms链接这些atherosclerosis-prone老鼠拟杆菌物种的动脉粥样硬化。
方法
的数据支持本研究的发现可以从相应的作者以合理的要求。序列数据被存放在BioProject加入链接。PRJDB6472 DNA数据央行(Bank of Japan) BioProject数据库(http://trace.ddbj.nig.ac.jp/bioproject/index_e.html)。
招聘的CAD患者和控制
登记所有参与者提供书面知情同意,这项研究是根据指导方针进行的《赫尔辛基宣言》。本研究经神户大学的伦理委员会批准(批准号1595)和注册的大学医院医疗信息网络(试验注册临床试验注册中心。UMIN000015703)。
三十CAD和30控制没有CAD患者冠心病危险因素被招募了神户大学医院在2014年10月和2015年7月之间。样本大小计算使用R软件(= 0.9,= 0.05显著性水平,平均差= 6,SD = 7;每组30 n =)。集团与CAD包括旧稳定心绞痛和心肌梗死患者左心室射血分数保留(> 40%)接受经皮冠状动脉介入或冠状动脉搭桥手术≥6个月在本研究之前。急性冠脉综合征患者被排除在外。单或多血管疾病的定义主要冠状动脉血管的数量显示在诊断冠状动脉狭窄> 75%。
30个病人没有CAD与冠心病危险因素,如高血压、糖尿病、血脂异常,但是没有现在或过去的冠状动脉或其他血管疾病的历史,被招募,年龄和性别匹配的对照组。所有病人没有CAD住院治疗心房颤动、心房扑动等室上性心动过速,高血压或糖尿病。冠状动脉或其他血管疾病的历史被定义为记录血管疾病,症状表明心绞痛、异常心电描记法表明旧心肌梗死或心绞痛,或者异常胸部x射线胶片。
系统性疾病患者,包括肝脏疾病、肾脏疾病(血清肌酐水平> 2.0 mg / dL),胶原蛋白疾病或恶性肿瘤,被排除在研究之外。用抗生素治疗的患者也被排除在外。糖尿病被定义为glycohemoglobin含量> 6.5%(每个国家的迹象glycohemoglobin标准化程序),使用口服降糖药或胰岛素治疗的使用。高血压被定义为血压> 140/90毫米汞柱或使用抗高血压药物。血脂异常被定义为低密度脂蛋白胆固醇水平> 140 mg / dL,甘油三酸酯水平> 150 mg / dL,或使用antidyslipidemic药物/日本发行的动脉粥样硬化学会的指导方针。13
DNA提取、16 s rRNA基因简化和焦磷酸测序(人类粪便样本)
收集粪便样本,而参与者,因此消费医院住院饮食> 1天。从人类粪便样本中提取DNA基因研究实验室是由日本公司根据先前建立过程。14 - 16
部分的16 s rRNA基因(V3-V4地区342 - 806年的对应位置大肠杆菌编号系统)聚合酶链reaction-amplified使用我们的非简并通用引物为342 f - 806 r。一套引物的详细描述和聚合酶链反应条件是可用的。17添加后测序适配器,扩增子测序(250 - bp配对)豆类生物公司使用一个Illumina公司MiSeq平台(Illumina公司公司)根据制造商的协议。
创建细菌组成的矩阵,我们使用10.0.240 USEARCH版本。18我们之前的协议也被用于选择高质量的16 s rRNA基因扩增子序列使用Trimmomatic生成190.33版本主要参数:17落后:17 AVGQUAL: 25 MINLEN: 100。剩下的读取是USEARCH的加工使用-fastq_mergepairs命令,使用默认参数。接下来,我们将使用Tagcleaner底漆地区序列没有20.0.16版本,与参数-tag5 CTACGGGGGGCAGCAG -mm5 3 -tag3 AGATACCCCGGTAGTCC毫米33 -nomatch 3。切除后的引物,序列N被使用一个内部的python脚本。删除PhiX读,我们使用USEARCH -filter_phix命令。最后,我们使用USEARCH命令删除短序列-sort_by_length,参数-minseqlength 300。最后,我们生成操作分类单位(OTU)表使用UPARSE算法(-fastx_uniquecomand和otu_cluster命令参数-minsize 1)。21每个OTU代表序列的注释使用RDP细菌属分类器2.12版本,引导值≥0.5。22此外,我们标注每个代表序列的每个OTU参考数据库席尔瓦生活树项目版本12323使用BLASTN版本2.2.25,身份阈值≥97%,覆盖≥80%。
预测功能分析基于16 s rRNA的肠道微生物群的基因序列
辣子鸡构造使用粪便样本的原始数据读取。加入2 paired-end读,我们使用fastq-join软件默认的选项。嵌合序列与usearch6.1删除。24辣子鸡在97%相似性阈值选择的绿色基因数据库QIIME 1.8.0管道。25肠道微生物群的功能分析基于KEGG Orthology数据库(京都基因和基因组的百科全书)26是使用PICRUSt 1.1.1执行。27识别KEGG模块的显著差异意味着相对表达式进行了利用宏基因组资料的统计分析(邮票2.1.3)软件。28脂多糖(LPS)生物合成途径地图(map00540)被引用http://www.kegg.jp/kegg/kegg1.html26与许可。
动物
所有载脂蛋白E-deficient对C57BL / 6小鼠的背景。所有的老鼠被安置在一个特定的无菌动物设施神户大学理工学院。动物喂养正常食物(克丽)和水随意在一个严格的12小时光/暗周期。六个小鼠随机分为3组:对照组的小鼠与培养基填喂法,那些生活拟杆菌组强饲法与生活b . vulgatus和b . dorei和那些heat-killed拟杆菌集团与heat-killed填喂法b . vulgatus和b . dorei剂量为2.5×109100 cfu /μLb . vulgatus和b . dorei每周5次。根据指南的所有实验动物实验实际上在神户大学医学院(指导方针。P160701)。
文化和准备b . vulgatus和b . dorei
b . vulgatus(8482号;美式文化)和集合b . dorei(17855号;德意志Sammlung冯Mikroorganismen)在Difco-reinforced培养厌氧梭菌的培养基(218081号;BD生物科学)37°C。厌氧室(腼腆的实验室产品)包含10%的股份有限公司2,10% H2,80% N2是用于所有厌氧微生物的步骤。b . vulgatus和b . dorei在121°C heat-killed(治疗持续时间,15分钟)。热处理的成功证实了没有镀heat-killed细菌的增长。
粪便上层清液的制备
相同的人类粪便样本用于测量有限合伙人和16 s rRNA基因测序。老鼠从16-week-old控制和收集粪便样本拟杆菌治疗小鼠在24小时后口服填喂法。粪便上层清液得到根据先前描述的协议做了一些调整。29日,30.短暂,粪便样本悬浮在无菌PBS的浓度为1 g / 10毫升(人类)或50毫克每500μL(老鼠)和涡温和,以避免破坏细菌细胞。在3000转离心15分钟后,收集上清液,消毒过滤通过0.45 -μm通过0.22 -μm过滤器过滤refiltration紧随其后,灭活15分钟在90°C,并存储在−80°C。
分析有限合伙人在等离子体和粪便浮在表面的水平
等离子体和粪便LPS水平测定使用鲎变形细胞溶解产物测定(没有。k50 - 643 j;Lonza Inc)根据制造商的指示。等离子体是稀释10倍,粪便上层清液稀释000倍于pyrogen-free水和灭活15分钟在90°C。有限合伙人在pyrogen-free玻璃管进行测量,埃普多夫管,和盘子。
统计分析
统计分析使用R软件,版本3.1.0 JMP版本10 (SAS研究所),棱镜(GraphPad软件)7.0版本。Shapiro-Wilk测试被用来确定数据是正态分布。结果意味着±SEM或平均数±标准差来表示的正态分布数据,和中位数±四分位范围(25日第75百分位数)为非正态的分布式数据。两组之间的差异的重要性是使用2-tailed学生的评估t正态分布数据的测试或Mann-Whitney U测试为非正态的分布式数据。Fisher精确检验或χ2测试是用于比较分类变量。所有测试的值P< 0.05被认为是显示统计学意义。发现两个参数之间的联系的强度和方向,斯皮尔曼等级相关系数的计算。单向方差分析是用来检测3组之间的显著差异。的问使用Benjamini-Hochberg值计算方法调整P多个值比较。集群的数据从30 CAD患者和30控制在属级执行,详细描述了其他地方。31日Shannon-Wiener指数计算使用素食包R软件。主成分分析是使用无条件转移指令执行。
结果
肠道微生物在CAD患者
我们招募了30 CAD患者和30岁——和sex-matched控制没有CAD与冠心病危险因素,如高血压、糖尿病、血脂异常。然后我们进行了详细的比较肠道微生物概要文件在粪便样本中使用16 s rRNA基因测序。参与者所示的基线特征表1。α多样性,拟杆菌门/壁厚菌门比,革兰氏阳性和革兰氏阴性菌株比率2组之间没有显著差异(图1一个和1 c)。分析肠道微生物研究参与者的资料,样本聚集成3集群在属级,根据过程遵循在以前的报告(图1 d)。8,31日每个集群的特点是高的一个特定种类如下:拟杆菌在集群1中,普氏菌在集群2,Faecalibacterium,瘤胃球菌属,或双歧杆菌在集群3 (图1 e)。控件没有CAD明显更有可能被归类到集群1,而一些CAD患者分为集群(图1 f)。CAD患者之间的综合比较和控制方面的丰富的属平均提供了相对丰度> 0.1%表我的在线数据补充。我们发现属的相对丰度拟杆菌明显降低患者的CAD与控制(图1 g)。肠道微生物属的关联与临床指标所示图我在线数据补充。主坐标分析显示两组不同的大量的肠道微生物的主要物种,如CAD患者显示相对损耗b . vulgatus和b . dorei和浓缩Faecalibacterium prausnitzii和普氏菌copri(图1 h)。考虑到先前的报告显示丰富的属较低拟杆菌患者动脉粥样硬化,1,9,10我们关注的拟杆菌物种,b . vulgatus和b . dorei。因为这两个物种16 s rRNA相似序列模式,32我们不能使用我们的方法区分它们。这些物种已经涉及抗炎反应33是2属中最丰富的物种拟杆菌在16 s rRNA基因测序分析(图1我)。因此我们设计了一个小鼠模型涉及atherosclerosis-prone小鼠的填喂法b . vulgatus和b . dorei确认这些物种和动脉粥样硬化之间的因果关系,阐明其潜在机制。我们也证实了显著减少大量的b . vulgatus和b . dorei在CAD患者定量聚合酶链反应(图1 j和表二世在在线数据补充)。
| 变量 | 控制没有CAD (n = 30) | CAD患者(n = 30) |
|---|---|---|
| 年龄、y | 62.9±6.8 | 63.6±7.2 |
| 性别,男 | 23 (77) | 27 (90) |
| BMI,公斤/米2 | 24.8±4.1 | 25.1±2.8 |
| 住院,d | 13.5±12.1 | 9.1±6.2 |
| 血压、毫米汞柱 | ||
| 收缩压 | 123.1±18.1 | 122.2±12.9 |
| 舒张压 | 68.9±10.5 | 67.7±8.4 |
| 实验室数据 | ||
| AST, U / L | 22.9±5.6 | 27.8±13.7 |
| ALT, U / L | 23.2±11.6 | 27.3±17.1 |
| 包子,mg / dL | 16.2±4.4 | 14.9±3.7 |
| 肌酐,mg / dL | 0.94±0.26 | 0.87±0.16 |
| T-Cho, mg / dL | 183.1±34.9 | 162.2±27.7* |
| 高密度脂蛋白胆固醇,mg / dL | 52.4±13.8 | 50.8±19.2 |
| 低密度,mg / dL | 113.8±35.7 | 91.9±26.1__ |
| TG, mg / dL | 145.6±73.6 | 150.3±75.7 |
| 糖化血红蛋白、NGSP % | 6.55±1.30 | 6.35±0.86 |
| CRP, mg / dL | 0.15±0.20 | 0.09±0.09 |
| 粪便SCFAs nmoL /µg | ||
| 醋酸 | 54.74±22.05 | 49.54±24.19 |
| 丙酸 | 19.95±12.50 | 16.35±8.85 |
| 异丁酸 | 1.65±1.24 | 1.99±1.93 |
| N奶油的酸 | 9.76±7.09 | 9.16±7.77 |
| 异戊酸 | 1.10±0.97 | 1.46±1.49 |
| N戊酸 | 1.91±1.44 | 1.90±1.24 |
| 甲酸 | 2.15±6.33 | 1.04±1.92 |
| 吸烟史 | 21 (70) | 23 (77) |
| 当前吸烟者 | 4 (13) | 4 (13) |
| 过去的历史 | ||
| 糖尿病 | 12 (40) | 11 (37) |
| 血脂异常 | 18 (60) | 28 (93)__ |
| 高血压 | 23 (77) | 26日(87年) |
| 药物 | ||
| ACE-I / ARB | 17 (57) | 16 (53) |
| 抗糖尿病的 | 11 (37) | 9 (30) |
| 抗凝和抗血小板 | 17 (57) | 30 (100)‡ |
| β-Blocker | 9 (30) | 16 (53) |
| 钙通道阻滞剂 | 14 (47) | 19 (63) |
| PPI / H2受体 | 13 (43) | 29日(97)‡ |
| 他汀类药物 | 12 (40) | 27 (90)‡ |
图1所示。肠道微生物改变患者或无冠状动脉疾病(CAD)。V3-V4地区细菌16 s rrna测序的粪便样本30控制病人(没有CAD但风险因素)和30 CAD患者。一个Shannon-Wiener指数在家庭和属的水平。B拟杆菌门,厚壁菌门(BF)比例。C,比革兰氏阳性(GP)革兰氏阴性菌株(GN)。D,参与者被分为3集群基于genus-level丰富的肠道微生物群。E跨集群,每个主要的分布属。单向方差分析是用来比较每个属cross-cluster分布。F、分布控制和CAD患者在每个集群。的χ2测试是用来比较3组。G,相对丰富的属拟杆菌(总肠道微生物群的比例)的控制和CAD患者。H,主坐标分析物种水平进行比较物种在人类肠道微生物群的分布。只在主坐标分析物种更大的重量。我相对丰富的拟杆菌总属的物种(百分比拟杆菌在控制和CAD患者。J相对丰富的b . vulgatus和b . dorei(总肠道微生物群的比例)评估定量聚合酶链反应。b . dorei表明拟杆菌dorei;b . vulgatus,拟杆菌vulgatus;f . prausnitzii,Faecalibacterium prausnitzii;p . copri,普氏菌copri;和电脑,主成分。Mann-Whitney U测试是用来确定两组之间的统计学意义(一个通过C,G,J)。数据显示为中等±四分位范围(25日第75个百分位)(一个通过C,E,G,J)。*P< 0.05;__P< 0.01;‡P< 0.001。
强饲法与生活b . vulgatus和b . dorei减少动脉粥样硬化斑块的形成
以确定的影响b . vulgatus和b . dorei对动脉粥样硬化的发展,流行女载脂蛋白E-deficient老鼠对待生活b . vulgatus和b . dorei通过口服填喂法为10周每周5次。控制老鼠只有一辆车(培养基)根据相同的协议。年龄在16周,小鼠安乐死,和一些分析来评估动脉粥样硬化。与控制的老鼠相比,老鼠强饲法与生活拟杆菌显示显著降低病变大小在主动脉根和en脸分析胸腹的主动脉(图2一个和2 b)在体重没有显著差异(图2 f)、血浆胆固醇水平(图2 g),或血浆葡萄糖水平(数据没有显示)。此外,免疫组织化学染色形态学分析,其次是主动脉粥样硬化病变窦显示显著减少巨噬细胞和CD4细胞+小鼠t细胞积累填喂法与生活拟杆菌与控制(图2 c和二维)。随后,我们进行了定量逆转录-聚合酶链反应检测评估的mRNA表达免疫细胞标记和趋化因子和趋化因子受体在小鼠主动脉粥样硬化。的mRNA表达几个proatherogenic免疫细胞标记和趋化因子和趋化因子受体与生活减少老鼠强饲法拟杆菌(图2 e)。这些结果表明,生活的补充b . vulgatus和b . dorei通过口服填喂法减少斑块炎症,减轻动脉粥样硬化病变的形成。
图2。生活b . vulgatus和b . dorei通过改善内毒素减弱动脉粥样硬化病变。六个女载脂蛋白E-deficient- - - - - -老鼠对待生活b . vulgatus和b . dorei或车辆(控制)在16周的年龄被杀。一个显微照片,代表油红O染色和动脉粥样硬化病变区域的定量分析主动脉窦(8到9样品每组)。黑条代表200μm。B显微照片,代表油红O染色法和定量分析主动脉粥样硬化斑块面积的每组样本(7 - 9)。白色的酒吧是1.5毫米。C有代表性的巨噬细胞荧光染色法和定量分析主动脉窦MOMA-2-positive染色的每组样本(7)。黑条代表100μm。D代表部分和CD4的定量分析+T细胞在主动脉窦(8到9样品每组)。黑条代表50μm。E动脉粥样硬化动脉,mRNA水平。数据规范化的管家Gapdh基因。老鼠体内的相对表达水平(对待生活拟杆菌相对于对照小鼠)所示一个热图(每组4 - 5样品)。F、体重变化的实验周期每组)(8到9个样本。G、比较血浆血脂水平(8到9样品每组)。H,血浆LPS水平量化通过鲎变形细胞溶解产物分析(每组5样品)。我通过细胞因子、血浆细胞因子水平量化珠阵列(4 - 5样品每组)。b . dorei表明拟杆菌dorei;b . vulgatus,拟杆菌vulgatus;欧盟,内毒素单位;高密度脂蛋白,高密度脂蛋白胆固醇;IL,白介素;干扰素干扰素;磅,对待生活b . vulgatus和b . dorei;低密度脂蛋白、低密度脂蛋白胆固醇;有限合伙人,脂多糖;T-Cho,总胆固醇;TG,甘油三酸酯;和肿瘤坏死因子,肿瘤坏死因子。2-tailed学生的t测试使用(一个通过D,F通过我)。数据显示为均值±SEM (一个通过D,F通过我)。*P< 0.05。
生活拟杆菌治疗改善内毒素和系统性炎症
内毒素是导致全身炎症导致天然免疫与适应性免疫的中断和动脉粥样硬化的发展。34-36事实上,与控制老鼠相比,拟杆菌治疗小鼠显著降低血浆LPS水平(图2 h)和低血浆proatherogenic细胞因子的水平,如白介素(IL) 2、IL - 4、IL - 6, IL-17A interferon-γ,肿瘤坏死factor-α(图2我)。因为LPS刺激细胞通过TLR4和移植costimulatory分子抗原递呈细胞,37我们进一步研究了这些细胞因子的来源通过流式细胞术测定脾细胞。我们发现CD11b的百分比高F4/80高巨噬细胞,CD11b高Ly6G高中性粒细胞,CD11c高树突细胞两组之间没有显著差异(图活动花絮在线数据补充),但老鼠强饲法拟杆菌表现出减少的表达主要组织相容性复合体II类和CD86 costimulatory分子,以及增加表达coinhibitory分子程序性死亡ligand-1和程序性死亡ligand-2脾CD11c高树突状细胞(IIB图在线数据补充)。符合更高的树突状细胞表型tolerogenicity, CD4细胞的数量+T细胞也低拟杆菌治疗小鼠(图IIC在线数据补充)。老鼠强饲法与生活拟杆菌较低的数量效应CD44吗高CD62L低CD4+T细胞和CD4细胞比例显著提高+CD25+Foxp3+调节性T细胞,细胞内水平较高的CTLA4 (图IID和国际教育协会的在线数据补充),表明免疫平衡转向抑制。综上所述,这些数据表明,系统性先天免疫细胞激活的抑制和Th1-driven炎症参与动脉粥样硬化的发病机制是造成的生活拟杆菌treatment-induced减少血浆LPS浓度。
强饲法与生活拟杆菌改变肠道微生物生产有限合伙人
我们下一个检查肠道微生物组成。16 s rRNA基因测序的老鼠粪便样本显示改变肠道微生物群组成,以应对填喂法与生活b . vulgatus和b . dorei(在线数据补充图iii a和希望)。的拟杆菌门/壁厚菌门革兰氏阴性菌株比率比,革兰氏阳性,粪便含水量在三组之间没有显著性差异图IIIC、IIID IIIG在线数据补充)。拷贝数的16 s rDNA每克粪便中显著增加小鼠接受生活拟杆菌相比之下,控制老鼠(图IIIE在线数据补充)。丰富的b . vulgatus和b . dorei在粪便相当高的生活拟杆菌-gavaged老鼠(图IIIF在线数据补充)。重要的是要注意,细菌基因功能的预测基于使用PICRUSt 16 s rRNA基因序列27透露了一些功能多样性的3组按照肠道微生物群组成的差异(图IIIH在线数据补充)。尽管TMA合成相关基因的表达(CutC, CutD各组之间没有差别,在LPS生物合成相关基因的表达,尤其是LpxA和LpxD,参与脂类的生物合成和脂质结构的构成基本酰基转移酶(图3 b),38,39显著降低小鼠填喂法与生活拟杆菌(图3一和3 c,图4在在线数据补充)。因此,我们测量粪便LPS水平作为结肠LPS浓度的指标由肠道微生物群。令人惊讶的是,粪便LPS水平显著降低小鼠填喂法与生活拟杆菌比在控制老鼠(图3 d)。因此,内毒素在活减毒拟杆菌-gavaged老鼠(图2 h)。粪便LPS水平以及动脉粥样硬化斑块在主动脉窦(P= 0.74)和血浆LPS水平(P= 0.93)在heat-killed拟杆菌填喂法小鼠没有减少与控制老鼠(P每组)= 0.92)(6样本。
图3。改变肠道微生物脂多糖(LPS)生物合成治疗后生存拟杆菌。一个,有限合伙人在16-week-old生物合成载脂蛋白E-deficient老鼠对待生活拟杆菌或车辆(控制)根据使用PICRUSt 16 s rrna测序的数据分析。对于每一个基因参与脂类的生物合成,其相对表达式(小鼠接受生活拟杆菌相对于在控制老鼠)标注在热图(6样品每组)。基因没有参与有限合伙人生物合成基于KEGG Orthology数据库(京都基因和基因组的百科全书)标记N / A。B脂质结构大肠杆菌。LpxA和LpxD构成了至关重要,早期脂酰基转移酶的生物合成。C,在LPS生物合成相关基因的表达预测使用PICRUSt(6样品每组)。D、粪便LPS水平从3独立实验量化通过鲎变形细胞溶解产物分析。2-tailed学生的t测试是用来检测两组之间的显著差异(一个,C,D)。欧盟表示内毒素单位;磅,对待生活拟杆菌vulgatus和拟杆菌dorei。数据表示为均值±SEM (C,D)。*P< 0.05;‡P< 0.001。有限合伙人生物合成途径地图(map00540)引用http://www.kegg.jp/kegg/kegg1.html与许可。的脂质结构从一篇文章获得了许可。33
生活拟杆菌在Vivoand体外治疗加强紧密连接形成
鉴于肠漏随后改变肠道微生物群组成促进内毒素和动脉粥样硬化,35我们下一个调查是否活着拟杆菌治疗会影响肠道紧密连接渗透率。老鼠强饲法与生活拟杆菌显示降低肠道通透性异硫氰酸荧光素葡聚糖(图VA在线数据补充),明显高于紧密连接的mRNA表达的基因Zo1(图VB和表3的在线数据补充),反映在更高的平均荧光强度的ZO-1冒号(图中VC在线数据补充)。因为有限合伙人TLR4-dependent方式肠道通透性增加,40,41我们刺激人类大肠癌HT29细胞腺癌显示,响应通过TLR4有限合伙人,老鼠的粪便上层清液。与体内的结果相一致的是,我们观察到的表达水平明显高于ZO-1(信使rna和蛋白质)HT29细胞刺激与粪便上层的生活拟杆菌治疗小鼠比细胞刺激与粪便上层清液控制老鼠(图VD和在线数据补充)。这些结果表明,肠道microbiota-induced结肠LPS浓度的变化可以直接影响紧密连接调控paracellular渗透率。
生活拟杆菌抑制肠道免疫反应
我们以前报道,可预防动脉粥样硬化的调制肠道免疫力。42,43老鼠强饲法与生活拟杆菌有大幅降低mRNA的表达Cd11c,Cd80,促炎细胞因子在结肠。此外,该mRNA的表达Ccr7移民,这是至关重要的抗原递呈细胞在肠道固有层肠系膜淋巴结(mln),44显著降低小鼠的结肠中强饲法拟杆菌(图通过VIB,表3的在线数据补充)。Flow-cytometric mln显示分析拟杆菌-gavaged小鼠显著降低CD11c丰富高细胞,以及显著降低TLR4的表达主要组织相容性复合体II级,并在CD11c CD80高细胞,而CD4的数量+T细胞CD4和几个标记+T细胞没有明显变化(图维克和VIF的在线数据补充)。细胞因子mRNA表达mln往往降低小鼠的对待生活拟杆菌(图中收取和表3的在线数据补充)。进一步,我们获得TLR4-knockdown携带原始细胞的RNA转染。我们发现,与控制携带RNA转染,促炎细胞因子的分泌IL-1β,白介素、肿瘤坏死factor-α显著低于原始细胞刺激与粪便上层的生活拟杆菌比原始细胞治疗小鼠粪便处理上层清液从控制老鼠。原始细胞转染Tlr4携带RNA分泌的促炎细胞因子水平显著低于原始细胞转染与控制携带RNA (图VIH在线数据补充)。总的来说,这些发现表明,结肠LPS浓度调节结肠炎症通过有限合伙人/ TLR4-dependent信号。
CAD患者粪便LPS水平增加
最后,为了进一步研究CAD发病率之间的关系和肠道微生物有限合伙人在人类的生产,我们预计肠道微生物功能和测量粪便LPS水平在同一样本用于16 s rRNA基因测序。尽管的表达LpxA和LpxD没有CAD患者之间的差异和控制,的表达吗LpxM收益率hexa-acylated脂质(一个强大的TLR4受体激动剂),往往是高集团与CAD (图4一和4 b)。值得注意的是,在CAD患者粪便LPS水平明显高于控制(图4 c)。有趣的是,丰富的属拟杆菌往往是与粪便LPS水平负相关(r =−0.227,P= 0.0838)。情节与粪便LPS水平和丰富的b . vulgatus和b . dorei在CAD患者(红点)显示两个参数之间显著负相关(r =−0.541,P= 0.002)(图4 d)。这些结果强烈支持的想法b . vulgatus和b . dorei调节肠道微生物生产的有限合伙人,他们的活动会影响CAD患者动脉粥样硬化的进展。
图4。肠道微生物脂多糖(LPS)生产或没有CAD患者。肠道微生物功能和粪便LPS水平在同一样本用于16 s rRNA基因测序。一个基因的表达,参与脂质生物合成根据16 s rRNA使用PICRUSt测序的数据分析。对于每一个基因参与脂类的生物合成,其相对表达式(在CAD相对于控制)绘制在一个热图(每组30样品)。基因没有参与脂质生物合成基于KEGG Orthology数据库(京都基因和基因组的百科全书)标记N / A。B基因的表达,参与有限合伙人根据16 s rRNA生物合成测序数据分析使用PICRUSt(每组30样品)。2-tailed学生的t测试是用来检测两组之间的显著差异。C,粪便LPS水平量化通过鲎变形细胞溶解产物分析。Mann-Whitney U测试是用来确定意义。数据显示为中等±四分位范围(25日第75个百分位)。D之间,斯皮尔曼等级相关系数计算粪便LPS水平和相对丰度拟杆菌vulgatus(b . vulgatus),拟杆菌dorei(b . dorei)。CAD表明冠状动脉疾病。*P< 0.05。有限合伙人生物合成途径地图(map00540)引用http://www.kegg.jp/kegg/kegg1.html与许可。
讨论
越来越多的证据表明,肠道微生物群在动脉粥样硬化的发展中扮演着重要角色。尽管最新metagenome-wide协会研究已经提供了一个描述CAD患者的粪便微生物群概要5的临床影响这些描述性的数据尚不清楚,因为一个特定的肠道microbiota-based目标防止CAD尚未出现。在这里,我们发现大量的b . vulgatus和b . dorei较低的肠道微生物组CAD患者,口服填喂法与生活b . vulgatus和b . dorei可以减少粪便和血浆LPS浓度和防止小鼠动脉粥样硬化(图七世在在线数据补充)。
b . vulgatus和b . dorei属的优势种是吗拟杆菌在人类肠道微生物群。重要的是要注意,有限合伙人化合物五,tetra-acylated脂质拟杆菌物种结构hexa-acylated有限合伙人的截然不同E.scherichia杆菌和引起降低TLR4反应。33出于这个原因,我们最初假设这些抗炎的影响b . vulgatus和b . dorei有限合伙人会抑制免疫反应和预防动脉粥样硬化与生活填喂法后b . vulgatus和b . dorei。在目前的研究中,我们报告说,填喂法b . vulgatus和b . dorei大大减少结肠LPS浓度后肠道微生物变化和确认相关的保护作用抑制小鼠的免疫反应。此外,我们发现粪便LPS水平更高的低丰度的患者b . vulgatus和b . dorei。这一发现表明,大量的b . vulgatus和b . dorei有一个直接影响人类肠道微生物合成有限合伙人。考虑到有限合伙人内容每个细胞是已知的大幅变化甚至在相同的应变,因为细菌可以根据环境条件适应有限合伙人的生产,45我们相信,b . vulgatus和b . dorei可能改善肠道环境,为肠道细菌提供良好的生活条件和有限合伙人对细菌产生有益影响生产。
有限合伙人后TLR4表达增加曝光剂量依赖性的方式,和TLR-mediated树突状细胞激活和成熟上调主要组织相容性复合体和costimulatory分子,以及细胞因子的生产和T细胞激活。37我们证明了生活拟杆菌治疗减少TLR4的表达和激活和成熟的标记,如主要组织相容性复合体II级,CD80、CD86, CD11c高树突细胞在gut-draining mln。相似的表型变化PD-L1表达的增加和PD-L2在脾脏树突细胞观察。尽管我们不能完全证明因果关系,我们认为增加耐受性树突状细胞的表型在mln或脾脏被怀疑迁移进入血液,并与先前报道得减毒动脉粥样硬化病变的形成密切相关。42,43,46此外,鉴于TLR4的参与和无菌炎症趋化因子受体,它是有趣的假设生活后循环LPS水平下降拟杆菌治疗可以减少TLR4的表达,CCR7 CCL17, CCL21主动脉,导致更少的巨噬细胞和CD4细胞+T细胞积聚在动脉粥样硬化斑块。
我们还表明,活下去拟杆菌治疗加强肠道屏障。尽管有限合伙人大肠杆菌TLR4-dependent方式肠道通透性增加,40,41结肠LPS浓度在肠道通透性的影响迄今为止尚未全面调查。我们首次展示ZO-1表达式在小鼠结肠明显高于对待生活拟杆菌和表达水平明显高于ZO-1 HT29细胞刺激与粪便浮在表面的生活拟杆菌治疗的老鼠。尽管我们没有阐明分子机制ZO-1的规定,我们的研究提供了第一个证据,结肠LPS浓度由肠道微生物群有助于肠道屏障力量在体内和体外。
从临床的角度来看,我们的研究结果为进一步研究铺平道路研究肠道微生物有限合伙人生产CAD的预防和管理。尽管越来越多的了解患者的肠道微生物群的CAD,很难得出失调在动脉粥样硬化的定义,因为每个肠道微生物信息取决于年龄,性别,当地的食物或生活方式,和许多其他因素。我们的研究表明,粪便LPS水平可能作为一种新颖的失调标记,尽管有限合伙人的类型和免疫原性无法确定。鉴于肠道microbiota-derived有限合伙人和系统性内毒素参与的出现和发展不仅动脉粥样硬化,而且许多普遍的疾病,如炎症性肠病、肥胖及相关代谢疾病,和非酒精性脂肪肝炎47-49我们的研究表明,拟杆菌治疗可能作为一种新颖的和有吸引力的治疗策略,抑制炎性反应等疾病。一篇文章已经报道说b . vulgatus防止大肠杆菌在无菌的全身结肠炎IL-2-deficient老鼠。50
目前的研究时,应考虑有几个限制解释结果。首先,分析了肠道微生物组16 s rRNA测序分析。在物种系统发育较低功率水平和可怜的歧视性的权力属。此外,肠道微生物分析CAD患者是一个单中心研究相对较少的患者。此外,因为我们没有完成冠状动脉造影的控制没有CAD,有可能是患者亚临床CAD在对照组。这些限制意味着我们没有完全阐明肠道微生物组成CAD的特点;然而,16 s rRNA测序分析帮助寻找候选人,转化为动物实验。第二,我们量化水平有限合伙人通过鲎变形细胞溶解产物分析。虽然鲎变形细胞溶解产物化验是有限合伙人的金标准试验测量,它无法测量有限合伙人免疫原性的影响拟杆菌有限合伙人的结构和功能。第三,我们没有完全阐明动脉粥样硬化的机制保护老鼠LPS浓度降低。除此之外,大部分的占主导地位的肠道微生物群的相对丰度在小鼠和人类有很大的不同。进一步的研究是必要的来支持我们的数据之间的因果关系,确定粪便LPS浓度和动脉粥样硬化斑块的形成。第四,我们只填喂法执行b . vulgatus和b . dorei。对预防CAD可能存在更有效的菌株。
总之,我们发现肠道细菌物种参与人类CAD和用小鼠模型澄清之间的因果关系b . vulgatus和b . dorei和动脉粥样硬化。
确认
我们的研究参与者,感谢医务人员配合收集粪便样本。我们感谢Tetsuya Hara Shigeyasu津田,行长Oshita Mitsumasa绒,渡边Koichi Emi Ichiyanagi, Yukiko竹内,Emiko吉田的优秀的技术支持。我们也承认Kodama孝宏创建图形抽象和Toshitaka katada Odamaki技术讨论。
的资金来源
这项工作受到了日本促进社会科学KAKENHI批准号。24591114 (T.Y.), 16 k09516 (T.Y.)和17 k09497 (K.H.),日本社会循环转化研究基金会(K.H.), Uehara纪念基金会(K.H.) Suzuken纪念基金会(n),武田科学基金会(含硝酸钠和T.Y.), Senshin医学研究基金会(T.Y.),益力多生物科学研究基金会(T.Y.),兵库县科技协会(T.Y.和K.H.),三岛的Kaiun纪念基金会(式样),和Kondou金恩医学基金会(T.Y.)。
披露的信息
一个也没有。
脚注
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