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2014年7月1日出版gydF4y2Ba更多信息gydF4y2Ba
背景。gydF4y2Ba丙型肝炎病毒(HCV)感染全世界大约1.7亿人,可能导致慢性感染肝硬化和肝细胞癌。治疗方法是快速的从IFN-α-based疗法IFN-α-free方案,包括直接作用抗病毒药物(DAAs),这在临床试验证明改进的疗效和耐受性。病毒学DAA治疗后复发治疗失败的常见原因;然而,目前尚不清楚为什么发生复发或某些个人是否更容易复发性病毒血症。gydF4y2Ba
方法。gydF4y2Ba我们进行了一项临床试验使用DAA sofosbuvir联合利巴韦林(SOF /单体饭店和执行详细的mRNA表达分析在患者的肝和外周血达到持续病毒学应答(SVR)或复发。gydF4y2Ba
结果。gydF4y2Ba治疗病毒性间隙伴随着IFN-stimulated基因差别迅速对这些(isg)肝脏和血液中,无论治疗结果。配对分析预处理治疗和结束(测试结束)SVR病人的肝活检显示,病毒是伴随着减少表达II和III型干扰素,不料I型干扰素的表达增加gydF4y2BaIFNA2gydF4y2Ba。isg的mRNA表达更高传输结束肝活检的患者比后复发的患者取得了SVR。gydF4y2Ba
结论。gydF4y2Ba这些结果表明,修复我肝内型干扰素信号传输结束可能促进丙肝病毒根除和预防复发在撤军SOF /各类单体。gydF4y2Ba
试验注册。gydF4y2BaClinicalTrials.gov NCT01441180。gydF4y2Ba
资金。gydF4y2Ba校内项目国家过敏症和传染病研究所,国立卫生研究院临床中心和国家癌症研究所;德国研究基金会。gydF4y2Ba
直到最近,根除治疗的慢性丙肝病毒感染需要注射IFN-α配方的使用,通常难以容忍和成功(gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)。IFN-free现在治疗丙肝病毒感染可能与最近发达直接作用抗病毒药物(DAAs)抑制病毒蛋白质的功能如NS3/4A病毒蛋白酶,NS5B RNA聚合酶,NS5A非结构蛋白(gydF4y2Ba1gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba3gydF4y2Ba)。IFN-free DAA丙肝病毒联合疗法是口服方案顺利地容忍,通常引起的快速和持续的病毒抑制所有患者在临床试验(gydF4y2Ba1gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba3gydF4y2Ba)。然而,一些病人治疗失败是因为治疗病毒突破或停药后复发,可能由于未知的宿主因素,赏识病毒抵抗,或病毒宿主(gydF4y2Ba1gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba3gydF4y2Ba)。停药后复发是治疗失败的主要原因与含有SOF的方案,最近批准的丙肝病毒NS5B RNA聚合酶抑制剂(gydF4y2Ba4gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba8gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba
在慢性丙肝病毒感染,持续激活host-mediated肝脏炎症的发生,在一定程度上受内源性干扰素,这种反应被认为有助于导致进行性肝纤维化的病理变化(gydF4y2Ba9gydF4y2Ba)。有3干扰素家庭(类型I, II, III),通过不同的信号受体复合物,但目前尚不清楚,这些家庭的成员把肝反应在慢性丙肝病毒感染(gydF4y2Ba10gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba12gydF4y2Ba)。内源性干扰素反应被激活所有的病人在急性和慢性丙肝病毒感染,但在消除无效的丙肝病毒一旦建立慢性感染(gydF4y2Ba13gydF4y2Ba)。更健壮的preactivation内源性干扰素系统,以mRNA表达isg的肝活检,IFN-α-based方案与治疗失败;预处理研究小组表达水平升高患者有一个外生IFN-α钝化反应和降低实现SVR的几率gydF4y2Ba10gydF4y2Ba,gydF4y2Ba14gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba17gydF4y2Ba)。生物相关的SVR或复发患者接受IFN-free DAA治疗没有被详细研究,以及内源性干扰素系统之间的相关性IFN-free疗法治疗的结果是未知的。gydF4y2Ba
这里我们报告在血液和肝脏基因表达变化IFN-free DAA治疗sofosbuvir联合利巴韦林(SOF /单体饭店在首次治疗,慢性丙肝病毒基因1型患者和描述对治疗结果。试验病人虽然有盛行的传统不宜治疗预测IFN-α-based疗法,包括非裔美国人的种族(83%)和晚期肝纤维化(23%),69%的患者完成这个临床试验获得SVR(定义为没有检测到病毒血清治疗24周后停止),而31%的复发治疗12周内完成(gydF4y2Ba8gydF4y2Ba)。基于微分的治疗效果观察到在这项研究中,我们试图探索生物相关的治疗反应的患者获得SVR和复发。gydF4y2Ba
我们第一次评估肝基因表达的变化与SOF IFN-free治疗期间/各类单体使用肝组织活检获得治疗或在年底之前(测试结束)。微阵列基因表达分析进行配对活检可以从8个病人,其中7人获得SVR和1人复发(补充表1;本文提供在线补充材料;doi:gydF4y2Ba10.1172 / JCI75938DS1gydF4y2Ba)。创新路径分析(IPA) 1%的差异表达基因(补充表2)确定干扰素信号和抗原表达途径是与治疗(图表达下调gydF4y2Ba1gydF4y2BaA)。满足过滤和意义标准的109个基因(图gydF4y2Ba1gydF4y2BaB), 65年被列为isg (gydF4y2Ba18gydF4y2Ba)、内源性干扰素引起的。减少活化在传输结束和预处理是预测型我(gydF4y2BaIFNA2gydF4y2Ba,gydF4y2BaIFNA1gydF4y2Ba,gydF4y2BaIFNB1gydF4y2Ba)、II型(gydF4y2BaIFNGgydF4y2Ba),和III型(gydF4y2BaIFNL1gydF4y2Ba)干扰素(图gydF4y2Ba1gydF4y2BaC)。gydF4y2Ba
微阵列mRNA表达的内源性干扰素信号差别分析显示对这些肝脏SOF /各类单体治疗后。gydF4y2Ba(gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba)最高规范途径被异丙醇作为配对改变在治疗肝脏活组织检查(gydF4y2BangydF4y2Ba= 8)。比率代表的数量被确定的基因差异表达基因在前1%的分配给特定的路径,相对于各自的基因通路总数。截止为这些充实日志的重要性gydF4y2BaPgydF4y2Ba1.3 (gydF4y2BaPgydF4y2Ba= 0.05)。基因表达下调在传输结束相对于预处理粗体所示。(gydF4y2BaBgydF4y2Ba)的热图SOF /各类单体治疗后差异表达的基因。前1%的差异表达基因筛选使用切断> 1.2折的区别和调整gydF4y2BaPgydF4y2Ba< 0.05。基因芯片表达数据被用来创建一个层次聚类的样本使用欧几里德不同测量平均链接。数据从所有8配对肝活检显示。红色表示相对较高的表达。星号表示的数据病人复发。(gydF4y2BaCgydF4y2Ba)异丙醇上游分析细胞因子的激活状态的蛋白质注释出来比较测试结束与预处理活动水平。负gydF4y2BazgydF4y2Ba分数预测不活跃的细胞因子在传输结束而预处理。分数>或< 2被认为是重要的。gydF4y2Ba
定量rt - pcr(存在)的差别分析验证对这些isg的面板,包括成员ISGF3复杂(gydF4y2BaSTAT1gydF4y2Ba,gydF4y2BaSTAT2gydF4y2Ba,gydF4y2BaIRF9gydF4y2Ba),对于感应的研究小组表达类型I / III干扰素(图gydF4y2Ba2gydF4y2Ba和参考文献。gydF4y2Ba12gydF4y2Ba,gydF4y2Ba19gydF4y2Ba)。也表达下调与anti-HCV isg活动(gydF4y2BaIRF1gydF4y2Ba,gydF4y2BaIFIH1gydF4y2Ba,gydF4y2BaIRF7gydF4y2Ba,gydF4y2BaPLSCR1gydF4y2Ba,gydF4y2BaIFIT3gydF4y2Ba,gydF4y2BaTRIM14gydF4y2Ba,gydF4y2BaIFITM1gydF4y2Ba)(gydF4y2Ba11gydF4y2Ba,gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba,gydF4y2Ba21gydF4y2Ba),与抗原呈现相关的基因(gydF4y2BaPSMB8gydF4y2Ba,gydF4y2BaPSMB9gydF4y2Ba,gydF4y2BaHLABgydF4y2Ba,gydF4y2BaB2MgydF4y2Ba),一个研究小组,抑制IFN-α信号和高架在慢性丙肝病毒(gydF4y2BaUSP18gydF4y2Ba)(gydF4y2Ba22gydF4y2Ba趋化因子受体CXCR3)和配体(gydF4y2BaCXCL9gydF4y2Ba,gydF4y2BaCXCL10gydF4y2Ba,gydF4y2BaCXCL11gydF4y2Ba)(图gydF4y2Ba2gydF4y2Ba和裁判。gydF4y2Ba23gydF4y2Ba)。减少复发的病人显示表达式,对于大多数测试isg(图中规模最大的gydF4y2Ba2gydF4y2Ba一个)。gydF4y2Ba
isg的差别存在,伊什确认对这些肝脏活检。gydF4y2Ba(gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba和gydF4y2BaBgydF4y2Baisg)中存在表达分析(gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba)和其他基因(gydF4y2BaBgydF4y2Ba)预处理和测试结束的肝活检的患者获得SVR (gydF4y2BangydF4y2Ba= 7;黑色)和后来复发(gydF4y2BangydF4y2Ba= 1;红色)。基因表达测定采用1总RNA ng /反应,和褶皱的变化是为了测试结束与预处理后表达水平正常化gydF4y2BaGAPDHgydF4y2Ba。显示个人褶皱变化与一组中位数和四分位范围。所有基因显示了意义标准(Wilcoxon配对符号秩测试;gydF4y2BaPgydF4y2Ba认为显著p < 0.05)。(gydF4y2BaCgydF4y2Ba)检测gydF4y2BaIFI44gydF4y2BamRNA表达在预处理和测试结束肝活检,FFPE组织样本中执行4病人:2获得SVR, 1复发(REL)传输结束活检前复发,复发和1测试结束时发现肝活检(活检和复发在测试结束后4周,检测不到病毒载量测试结束后2周)。原始的放大,×40。酒吧规模:100μm。gydF4y2Ba
T细胞激活的基因参与调制(gydF4y2BaCTLA4gydF4y2Ba和gydF4y2BaCD244gydF4y2Ba)、脂质代谢(gydF4y2BaAPOL3gydF4y2Ba,gydF4y2BaMTTPgydF4y2Ba,gydF4y2BaLEPRgydF4y2Ba)和细胞外基质的形成和完整性(gydF4y2BaTIMP1gydF4y2Ba,gydF4y2BaLGALS3gydF4y2Ba,gydF4y2BaLGALS3BPgydF4y2Ba,gydF4y2BaKRT18gydF4y2Ba,gydF4y2BaMYL12AgydF4y2Ba)表达下调(图gydF4y2Ba2gydF4y2BaB和裁判。gydF4y2Ba24gydF4y2Ba),而其他的矩阵表达基因(gydF4y2BaCOL1A1gydF4y2Ba,gydF4y2BaCOL1A2gydF4y2Ba,gydF4y2BaSPP1gydF4y2Ba)和免疫调节基因(gydF4y2BaIL10gydF4y2Ba和gydF4y2BaTGFB1gydF4y2Ba)没有影响(数据未显示)。原位杂交(ISH)在肝活检证实减少研究小组的mRNA转录表达,gydF4y2BaIFI44gydF4y2Ba复发,治疗期间,无论SVR或地位,其次是复活的表情的时候病毒复发(图gydF4y2Ba2gydF4y2BaC和补充图1)。gydF4y2Ba
我们下一个评估治疗血清蛋白水平的选择趋化因子和细胞因子和观察到类似的表达式在基线和治疗期间比较患者取得了SVR和复发(补充表3)。血清IP-10 IFN-inducible细胞因子的水平,蛋白质的产物gydF4y2BaCXCL10gydF4y2Ba基因在肝脏(图表达下调gydF4y2Ba2gydF4y2Ba),与基线病毒载量显著相关(图gydF4y2Ba3gydF4y2Ba)。表达减少快速治疗,无论治疗结果,并增加复发(图gydF4y2Ba3gydF4y2BaB)。病毒动力学和IP-10下降显著相关(图gydF4y2Ba3gydF4y2BaC和表gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)。il - 10和治疗期间IFN-γ小幅下降,而其他大多数蛋白质的表达并没有改变,包括TGF-β1和TIMP1,与肝纤维化(补充表3和裁判。gydF4y2Ba25gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba
快速血清IP-10水平正常化SOF /各类单体治疗和与病毒动力学下降。gydF4y2Ba(gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba)基线病毒载量和血清IP-10蛋白质水平之间的相关性。数据来自患者取得了SVR (gydF4y2BangydF4y2Ba= 28;黑色)或后来复发(gydF4y2BangydF4y2Ba= 14;红色)。通过非参数统计分析是斯皮尔曼相关(gydF4y2BargydF4y2Ba测试包括所有数据。(gydF4y2BaBgydF4y2Ba)血清IP-10蛋白质含量迅速减少治疗,不管结果。结果显示结果(SVR,黑色;复发,红色;gydF4y2BangydF4y2Ba表示)。是单独的测量显示与一组中位数和四分位范围。统计分析与固定效果集团使用混合模型,时间,group-by-time交互显示显著改变随着时间的推移,无论治疗结果(gydF4y2BaPgydF4y2Ba< 0.0001)。模式随着时间的推移,不同治疗效果显著,但这种差异消失如果36周的数据被排除在外。5健康志愿者进行比较所示的数据,但没有统计分析。(gydF4y2BaCgydF4y2Ba)血清IP-10水平基线和治疗期间反映病毒载量的变化。显示在中间值和四分位范围病毒载量(红色)和中间值和95%置信区间IP-10(黑色)。LLOD,降低病毒载量检测极限。见表gydF4y2Ba1gydF4y2Ba进行统计分析。数据来自44个患者可用数据。gydF4y2Ba
评估是否也有类似的基因表达模式变化可以观察到在外围,我们进行微阵列mRNA分析PBMCs之前收集治疗,早期治疗(6尺11寸),在测试结束(24周)和干扰素信号识别明显降低治疗期间(补充图2和表4补充)。PBMCs证实存在分析快速isg的差别和持续对这些其中一些拒绝测试结束白天表达水平(图6尺11寸的治疗gydF4y2Ba4gydF4y2BaA)。没有明显的基因表达差异,治疗结果在治疗期间,但ISG的表达增加复发(补充图3),不像IP-10蛋白质水平,基因表达研究小组的代表,gydF4y2Bamx₁gydF4y2Ba在PBMCs没有与基线病毒载量(图gydF4y2Ba4gydF4y2BaB)。此外,而病毒载量和PBMC表达研究小组均拒绝早期治疗,基因表达变化的大小和病毒动能下降不显著相关(图在一组分析gydF4y2Ba4gydF4y2BaC和表gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba
快速的内源性干扰素信号差别treatment-induced对这些周边血液。gydF4y2Ba(gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba)迅速减少6选择isg PBMCs的基因表达。显示单独的测量(gydF4y2BangydF4y2Ba显示组中位数和四分位范围。线性mixed-effects模型显示在所有6基因的表达显著减少疗程(gydF4y2BaPgydF4y2Ba< 0.0001)。(gydF4y2BaBgydF4y2Ba)gydF4y2Bamx₁gydF4y2Ba基因表达的血液没有与基线病毒载量。数据点从患者获得SVR (gydF4y2BangydF4y2Ba= 22;黑色)和从后复发的患者(gydF4y2BangydF4y2Ba= 10;红色)。通过非参数统计分析是斯皮尔曼相关(gydF4y2BargydF4y2Ba)包括所有数据。(gydF4y2BaCgydF4y2Ba)病毒治疗期间没有与动能下降gydF4y2Bamx₁gydF4y2Ba在PBMCs表达式。显示在中间值和四分位范围病毒载量(红色)和中间值95%的置信区间gydF4y2Bamx₁gydF4y2Ba(黑色)。LLOD,降低病毒载量检测极限。数据来自32个患者可用的数据。见表gydF4y2Ba2gydF4y2Ba进行统计分析。gydF4y2Ba
目前尚不清楚,肝脏和血液中干扰素驱动isg的表达在慢性丙肝病毒感染(gydF4y2Ba11gydF4y2Ba)。为了解决这个问题,我们测量基因表达选择类型的我,II, III干扰素及其受体使用RNA隔绝配对肝脏活检。7病人获得SVR,总表达所有测量干扰素在治疗降低(图gydF4y2Ba5gydF4y2Ba),与观测一致减少研究小组表达式(数字gydF4y2Ba1gydF4y2Ba和gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)。有趣的是,II型干扰素和几个类型III干扰素的表达降低与isg平行,而意外I型干扰素的表达增加(gydF4y2BaIFNA2gydF4y2Ba)或保持不变(gydF4y2BaIFNB1gydF4y2Ba在传输结束(图gydF4y2Ba5gydF4y2BaB)。此外,相对的贡献gydF4y2BaIFNA2gydF4y2Ba和gydF4y2BaIFNB1gydF4y2Ba总测量干扰素表达增加了传输结束(图gydF4y2Ba5gydF4y2BaC)。gydF4y2BaIFNA1gydF4y2Ba表达式中没有检测到任何肝脏样本之前或之后的治疗。虽然gydF4y2BaIFNA2gydF4y2Ba在肝脏基因表达增加疗程,IFN-α2蛋白在所有时间点检测血清中检测不到(补充表3)。在肝脏,IFN-γmRNA表达的受体(gydF4y2BaIFNGR2gydF4y2Ba)和IFN-λ(gydF4y2BaIFNLR1gydF4y2Ba)表达下调,而其他干扰素受体的表达(图未受到影响gydF4y2Ba5gydF4y2BaD)。在病人复发,有一个类似的模式,减少肝II和III型干扰素表达在治疗;然而,的表达gydF4y2BaIFNA2gydF4y2Ba没有检测到测试结束(补充图4),肝III型的相关性,而不是I型干扰素表达在慢性丙肝病毒研究小组表达与先前的发现是一致的(gydF4y2Ba26gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba28gydF4y2Ba),但我们是第一个报告基于纵向肝患者评估一个IFN-free DAA方案。gydF4y2Ba
改变肝脏病人治疗期间的干扰素表达平衡实现SVR。gydF4y2Ba(gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba所有SVR)总干扰素表达减少治疗期间患者(gydF4y2BangydF4y2Ba= 7)。中存在个别干扰素(所示gydF4y2BaBgydF4y2Ba)是使用5 - 15 ng执行每个反应技术复制RNA。相对基因表达的所有测量值的总和干扰素在每个时间点显示为每个病人取得了SVR。(gydF4y2BaBgydF4y2Ba使用5 - 15 ng)中存在个别干扰素进行每反应技术复制RNA。是单独的测量与显示的组中位数和四分位范围7配对肝活检患者取得了SVR。gydF4y2BaPgydF4y2Ba值是由Wilcoxon配对签署等级测试。功能等位基因gydF4y2BaIFNL4gydF4y2Ba(gydF4y2BaIFNL4-ΔGgydF4y2Ba产生IFN-λ4蛋白;ref。gydF4y2Ba31日gydF4y2Ba)只有5所示患者进行这种等位基因。LLOD,降低检测极限。(gydF4y2BaCgydF4y2Ba)相对比总测量池内的个人干扰素干扰素。中位数和四分位范围显示病人实现SVR (gydF4y2BangydF4y2Ba= 7)。gydF4y2BaPgydF4y2Ba值比较测试结束与预处理(Wilcoxon符号秩测试)。(gydF4y2BaDgydF4y2Ba)治疗干扰素受体信使rna表达的变化。数据和分析gydF4y2BaBgydF4y2Ba。gydF4y2Ba
探索的潜在机制gydF4y2BaIFNA2gydF4y2Ba感应,我们进行了免疫组织化学分析血浆DCs(髓)配对活检从12例(gydF4y2BangydF4y2Ba= 9 (SVR);3(复发))。而人类积极控制扁桃体容易检测到pDCs,我们没有发现任何pDCs 12配对预处理和测试结束肝脏活组织检查测试(数据没有显示)。这种消极的发现可能是由于低相对数量的这些细胞在肝组织小型抽样大小的设置提供核心针活检。gydF4y2Ba
虽然我们观察到的快速下降,在研究小组在PBMCs(图表达gydF4y2Ba4gydF4y2Ba),外围干扰素基因表达并没有改变在治疗期间,无论治疗结果,IFN-λ基因的表达并没有检测到PBMCs(图gydF4y2Ba6gydF4y2Ba和数据未显示)。有一个明显的变化在PBMC干扰素受体的基因表达的基因治疗期间(图gydF4y2Ba6gydF4y2BaB)。gydF4y2Ba
Treatment-induced PBMCs干扰素和干扰素受体的表达变化。gydF4y2Ba总RNA从PBMCs 22例(12 SVR,黑色;10复发,红色)干扰素的基因表达分析(gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba)和干扰素受体(gydF4y2BaBgydF4y2Ba)中存在使用2 ng RNA /试验和技术复制。组中位数和四分位范围。一个线性mixed-effects模型用于确定gydF4y2BaPgydF4y2Ba基因表达的改变在治疗的过程中,与重要gydF4y2BaPgydF4y2Ba值显示出来。基因表达的gydF4y2BaIFNL1gydF4y2Ba,gydF4y2BaIFNL2gydF4y2Ba,gydF4y2BaIFNL3gydF4y2Ba,gydF4y2BaIFNL4-ΔGgydF4y2Ba没有发现使用等量的RNA(没有显示)。gydF4y2Ba
在一起,这些结果表明,减少肝内表达II和III型干扰素及其受体的减少肝和血液研究小组表达在丙肝病毒抑制SOF /各类单体。肝的选择性增加gydF4y2BaIFNA2gydF4y2Ba表达式实现SVR的病人建议重新激活的肝I型干扰素信号在传输结束可能是重要的实现良好的治疗效果。gydF4y2Ba
评估这种可能性,我们进行微阵列mRNA表达分析在传输结束未配对肝活检获得来自17个病人获得SVR和8人复发(补充表5),他们收到测试结束前肝活检复发。排名前1%的差异表达基因(补充表6)确定干扰素信号作为一个顶级途径区分SVR和复发,一种干扰素基因表达较低的签名在复发的患者(图测试结束gydF4y2Ba7gydF4y2Ba)。88年的差异表达基因符合筛选标准(补充图5),确定了41 isg (gydF4y2Ba18gydF4y2Ba)。所有干扰素类型(》)预测复发的患者有较低的活动(图gydF4y2Ba7gydF4y2BaB)基因表达分析46 isg进行配对肝脏活组织检查(图gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)表明,在测试结束肝活检,表达gydF4y2BaOAS1gydF4y2Ba,gydF4y2Ba瑞吉gydF4y2Ba,gydF4y2BaUSP18gydF4y2Ba在随后的患者复发较低(图gydF4y2Ba7gydF4y2BaC)。虽然大多数个体基因的表达没有明显差异的结果,结合基因表达分析显示降低总体isg的这组病人复发(图gydF4y2Ba7gydF4y2BaD)。相对表达干扰素或其受体在传输结束肝活检没有相差治疗结果(图gydF4y2Ba8gydF4y2Ba模拟),虽然这种分析是没有预处理肝活检的限制,从而排除纵向变化的评估。gydF4y2Ba
复发的患者较低的表达是干扰素基因在肝脏测试结束。gydF4y2Ba(gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba)最高IPA SVR和复发的患者之间的规范途径不同传输结束肝活检微阵列mRNA表达数据。比率代表基因在前1%的基因差异表达的结果分配给特定的通路,相对于各自的基因通路总数。较低的基因表达在传输结束复发与SVR病人用加粗字体。(gydF4y2BaBgydF4y2Ba)异丙醇上游激活状态预测蛋白质的分析标注为细胞因子在传输结束肝活检,比较SVR和复发的患者。负激活gydF4y2BazgydF4y2Ba分数预测复发的患者较低的激活在测试结束。分数> 2被认为是重要的。(gydF4y2BaCgydF4y2Ba)存在验证选择isg。存在分析是使用2.5执行5 ng RNA /反应。的表达gydF4y2BaIRF9gydF4y2Ba和gydF4y2BaOAS1gydF4y2Ba测量在技术复制(gydF4y2BangydF4y2Ba= 16 (SVR;黑色);8[复发;红色]),而其他测试isg单复制由于样本的局限性(gydF4y2BangydF4y2Ba= 12 (SVR;黑色);8[复发;红色])。统计分析是Mann-Whitney测试。是单独的测量与显示组中位数和四分位范围。(gydF4y2BaDgydF4y2Ba)中存在表达分析46 isg在传输结束从SVR或复发患者肝活检SOF /各类单体治疗。平均相对表达个人isg决心20患者足够的RNA用于分析(gydF4y2BangydF4y2Ba= 12 (SVR);8(复发))。对于每一个研究小组,每个结果组患者的百分比表达高于组中值绘制。gydF4y2Ba
没有区别在干扰素或受体表达之间未配对的结果传输结束肝脏活检。gydF4y2Ba(gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba)总表达干扰素的总和,包括gydF4y2BaIFNA2gydF4y2Ba,gydF4y2BaIFNB1gydF4y2Ba,gydF4y2BaIFNGgydF4y2Ba,gydF4y2BaIFNL3gydF4y2Ba,gydF4y2BaIFNL4-ΔGgydF4y2Ba。(gydF4y2BaBgydF4y2Ba)个人干扰素基因的表达。(gydF4y2BaCgydF4y2Ba)的相对表达个人占总干扰素干扰素基因表达。(gydF4y2BaDgydF4y2Ba)干扰素受体的表达。数据来自SVR (gydF4y2BangydF4y2Ba= 16;黑色)和复发(gydF4y2BangydF4y2Ba= 8;红色)患者在未配对测试结束肝脏活检。2.5所有化验和技术进行重复使用5 ng RNA /反应,除了gydF4y2BaIFNA2gydF4y2Ba(25 ng)。是单独的测量与显示组中位数和四分位范围。的表达gydF4y2BaIFNL1gydF4y2Ba和gydF4y2BaIFNL2gydF4y2Ba没有检测到任何样品。没有gydF4y2BaPgydF4y2Ba值满足标准的意义(gydF4y2BaPgydF4y2Ba< 0.05,Mann-Whitney测试)。gydF4y2Ba
我们组所有的样品(gydF4y2BangydF4y2Ba= 33)3基因变异与丙肝病毒间隙:的intronic rs12979860-C / T (gydF4y2Ba29日gydF4y2Ba,gydF4y2Ba30.gydF4y2Ba),其实rs368234815-TT /ΔG (gydF4y2Ba31日gydF4y2Ba,gydF4y2Ba32gydF4y2Ba)gydF4y2BaIFNL4gydF4y2Ba(UTR)和3′端非翻译区rs4803217-T / GgydF4y2BaIFNL3gydF4y2Ba(补充表1和5和裁判。gydF4y2Ba33gydF4y2Ba)。大部分患者进入研究非裔美国人,他们不太可能有良好的基因型CC, TT / TT和GG rs12979860, rs368234815 rs4803217位点,分别。只有2 8配对活检和4 25未配对的测试结束患者肝活检是有利的gydF4y2BaIFNL4gydF4y2Bars368234815-TT / TT基因型,最强的标记与丙肝病毒间隙在非洲裔美国人(gydF4y2Ba31日gydF4y2Ba,gydF4y2Ba34gydF4y2Ba)。由于这些标记之间的连锁不平衡,高2其他标记的基因型相关。小数量的样品与有利基因型在每个标记不允许我们进一步探索基因表达的变化gydF4y2BaIFNL3gydF4y2Ba和gydF4y2BaIFNL4gydF4y2Ba基因型。gydF4y2Ba
我们目前的结果首次表明,丙肝病毒间隙达到IFN-free治疗期间SOF的DAA方案/各类单体II和III型差别是伴随着肝对这些干扰素,受体,isg。Downregulation isg的发生与治疗相关的病毒抑制和治疗不管结果,因为所有病人达到病毒学抑制疗法。然而,患者获得SVR意外有更高的肝内表达的isg传输结束而复发的患者。表达的增加gydF4y2BaIFNA2gydF4y2Ba,但不是其他类型的干扰素,在配对的肝活检的患者获得SVR建议更高的传输结束研究小组表达式可以由一个增强的I型干扰素反应。通过推理,这些数据显示模型,丙肝病毒引发的肝isg的异常表达和/或II / III型干扰素减少早期治疗期间。经过长时间的病毒抑制SOF /各类单体,更高的激活的研究小组在传输结束可能由I型干扰素诱导表达,这反过来又可以促进消除残余病毒。数据从配对活检可以从只有1病人复发,和没有任何的感应gydF4y2BaIFNA2gydF4y2Ba,符合这个模型。gydF4y2Ba
被认为在其他条件特点是长期免疫刺激,决议的感染和炎症可能是紧随其后的是一段相对免疫抑制(gydF4y2Ba35gydF4y2Ba)。可以想象,能够重建IFN的丙型肝炎患者体内平衡通过测试结束SOF /各类单体更有可能实现一个SVR,而失败的患者恢复体内平衡可能更倾向于病毒复发。这可能占较高的复发率在SOF /前面空反应中观察到的各类单体IFN-α/各类单体治疗(gydF4y2Ba7gydF4y2Ba),通常有一个治疗前升高内源性干扰素反应,因此可能有更高的障碍恢复免疫和干扰素体内平衡。因此,安装一个内生的能力,肝内I型干扰素反应实现SVR可能是重要的,即使IFN-α-free DAA方案。gydF4y2Ba
在本临床试验的病人被随机分为体重依赖型剂量或低剂量的各类单体,低剂量治疗各类单体与治疗的复发风险增加无关bivariable模型的治疗结果,结论的限制小样本的临床研究(gydF4y2Ba8gydF4y2Ba)。因为众所周知,各类单体使主机干扰素的效果,减少肝转氨酶(gydF4y2Ba17gydF4y2Ba,gydF4y2Ba36gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba38gydF4y2Ba),它是可能的,所述干扰素签名可以部分归因于个人间的差异响应各类单体。探索这种可能性,我们现在发现应评估在未来干扰素,RBV-free DAA临床试验。gydF4y2Ba
肝内upregulation IFN-α抑制剂的信号,如gydF4y2BaUSP18gydF4y2Ba,曾被证明在慢性丙型肝炎患者,而III型干扰素信号不受USP18影响蛋白(gydF4y2Ba11gydF4y2Ba,gydF4y2Ba22gydF4y2Ba,gydF4y2Ba39gydF4y2Ba,gydF4y2Ba40gydF4y2Ba)。慢性upregulation抑制剂可以解释的,至少在某种程度上,缺乏临床反应注射IFN-α配方中观察到的一些患者,特别是那些高内生肝isg的表情。的差别在目前的研究中,我们观察到对这些gydF4y2BaUSP18gydF4y2Ba治疗期间(图gydF4y2Ba2gydF4y2Ba),这可能允许恢复内源性IFN-α敏感性。解释越高gydF4y2BaUSP18gydF4y2Ba表达式中观察到测试结束肝活检的患者获得SVR是复杂,USP18参与IFN-α信号抑制,但也是一个研究小组活跃干扰素引起的信号(gydF4y2Ba39gydF4y2Ba)。相对差异在主机对内源性干扰素敏感DAA-induced病毒抑制可以解释协会研究小组表达与治疗效果观察。gydF4y2Ba
最近,不同家庭的相互依存和counterregulation干扰素被描述的设置丙肝病毒感染。例如,IFN-α由pDCs所需表达的IFN-γNK细胞在coculture PBMCs JFH-1 / Huh7.5细胞,这一过程的存在增强单核细胞(gydF4y2Ba41gydF4y2Ba)。NK-derived IFN-γ导致增强的研究小组表达和DC成熟coculture模型(gydF4y2Ba41gydF4y2Ba)。在同一个coculture模型,BDCAgydF4y2Ba+gydF4y2Ba骨髓DCs在PBMCs被发现的主要生产商III型干扰素通过TLR-3-dependent机制(gydF4y2Ba42gydF4y2Ba)。理解细胞特定类型干扰素生产设置在肝脏的DAA治疗是未来研究的一个重要领域,和使用纵向收集肝组织提供一个机会来评估动态细胞数量随时间的变化(gydF4y2Ba14gydF4y2Ba)。在目前的研究中,我们无法检测髓的存在的一个潜在来源gydF4y2BaIFNA2gydF4y2Ba诱导免疫组织化学治疗期间的预处理或测试结束的肝脏。原位分析特定类型细胞干扰素生产被组织有限的可用性,但这种分析应考虑在随后的DAA临床试验作为一种宝贵的工具,调查不同的微分角色先天免疫细胞在肝脏(gydF4y2Ba43gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba
基因型的gydF4y2BaIFNL4gydF4y2Ba变异(intronic rs12979860-C / T,以前被称为gydF4y2BaIFNL3gydF4y2Ba(gydF4y2BaIL28BgydF4y2Ba标记和其实rs368234815-TT /ΔG)和3′UTRgydF4y2BaIFNL3gydF4y2Ba变体(rs4803217-T / G)已经被证明能够影响治疗结果丙肝病毒感染和与肝内研究小组表达,文字记录的稳定性gydF4y2BaIFNL3gydF4y2Ba,平衡的先天免疫系统针对丙肝病毒感染(gydF4y2Ba28gydF4y2Ba,gydF4y2Ba31日gydF4y2Ba,gydF4y2Ba33gydF4y2Ba,gydF4y2Ba44gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba46gydF4y2Ba)。虽然我们这些标记的基因在我们的主题(补充表1和5),良好的发病率gydF4y2BaIFNL3gydF4y2Ba和gydF4y2BaIFNL4gydF4y2Ba基因型太罕见,探索基于宿主基因型微分干扰素调节。此外,虽然高病毒载量和晚期肝脏疾病都与治疗复发的bivariable模型临床试验结果(gydF4y2Ba8gydF4y2Ba),我们缺乏权力的子集患者肝活检探索生物相关测量这些变量的影响。高病毒载量是常见的和先进的肝病患者常见测试结束肝活检可用(补充表1和5)。gydF4y2Ba
我们的研究是独特的,第一次尝试全面分析表达式IFN-free临床试验生物样本的变化。成对肝活检的供应量有限,尤其是在患者复发,杜绝更明确的纵向分析相关的组织表达干扰素的临床结果,我们承认机会的作用影响研究结果,考虑到小样本大小。我们的结论的强度还受到不同的缺失gydF4y2BaIFNA2gydF4y2Ba表达式之间的传输结束肝活检的患者获得SVR和复发;重要的是,纵向变化无法评估这些患者没有预处理组织进行比较。尽管内源性诱导的模式gydF4y2BaIFNA2gydF4y2Ba(配对活检)和更高的传输结束研究小组表达实现SVR的病人(未配对测试结束活检)一直观察,我们没有足够的样品证明缺乏感应gydF4y2BaIFNA2gydF4y2Ba在病人治疗复发。缺乏数据寻址机制治疗复发是一个固有问题的治疗效果,如文中所述,SOF /各类单体、和生物样品,特别是肝脏活检——从复发患者不太可能大量可用。gydF4y2Ba
总之,我们表明,SOF的DAA方案/各类单体,肝干扰素表达谱的变化与治疗相关的结果。的能力恢复肝内I型干扰素信号可能是生物重要的根除残余病毒在长时间的设置与IFN-free治疗丙肝病毒抑制。知识的表达变化干扰素系统的组件可以帮助确定治疗患者的最佳时间,特别是在资源有限的环境中,一个概念,在将来的研究中。丙肝病毒疗法的发展从IFN-based DAA-only方案,我们的研究培养主持人的角色在决定优惠待遇的结果在慢性感染患者SOF /各类单体。gydF4y2Ba
临床试验和样品分析gydF4y2Ba
60首次治疗,慢性丙肝病毒基因1型患者治疗SOF(每天400毫克;由基提供科学)和低(每日600毫克)或体重依赖型剂量(< 75公斤,400毫克和600毫克QAM女王;> 75公斤,600毫克)各类单体24周,如前所述(gydF4y2Ba8gydF4y2Ba)。10试验第1部分中登记的患者接受开放标签SOF和体重依赖型剂量治疗各类单体。50名患者参加第2部分被随机分配接受SOF低或体重依赖型剂量各类单体。等离子体丙肝病毒RNA水平测量使用中存在丙肝病毒化验(Abbott),量化的下限(LLOQ) 12国际单位/毫升的下限检测(LLOD) 3国际单位/毫升。肝活检组织病理学评估nonblinded的方式由一个病理学家进行活检和上演的时候Knodell组织学活动指数(Knodell-HAI)和申请评分系统(gydF4y2Ba47gydF4y2Ba,gydF4y2Ba48gydF4y2Ba)。选择临床样本选择生物分析基于可用性和治疗结果。AST和ALT测定在临床实验室的美国国立卫生研究院临床中心。gydF4y2Ba
RNA分离和微阵列gydF4y2Ba
成对的肝脏活检。gydF4y2Ba核心肝活检获得与18-gauge针经皮的就放在RNAlater (Ambion)和存储在-80°C到处理。总RNA提取与TissueRuptor RNeasy工具包(试剂盒)的列消除残余DNA DNAseI消化(试剂盒)。微阵列表达分析使用50 - 100 ng总RNA进行放大,生物素化的,人类基因组和杂化Affymetrix u - 219数组,由超过530000个探针36000多个记录,使用GeneAtlas个人微阵列系统(Affymetrix)。基因表达结果规范化使用RMA方法,没有识别技术离群值。没有探头组显著差异表达水平被确定使用双向方差分析有多个测试修正的错误发现率(罗斯福)升压法(gydF4y2Ba49gydF4y2Ba)。一个提升等级次序的方法是实现个人平等因素的褶皱变化,探头设计,信号强度高于背景,gydF4y2BaPgydF4y2Ba值为每个调查。1%的差异表达基因用于异丙醇。基因与褶皱变化> 1.2的一个子集,未经调整的gydF4y2BaPgydF4y2Ba< 0.05为表示选择的层次聚类热图。gydF4y2Ba
预处理肝活检在开始治疗之前1.2年了,和测试结束活检得到10天内完成治疗,但之前血清学的复发。研究小组名称确定使用Interferome v2.0数据库(gydF4y2Ba18gydF4y2Ba)考虑人类和老鼠的基因,没有过滤应用于搜索条件。异丙醇的分子激活途径是用于预测激活细胞因子的状态,和值> 2被认为是重要的(gydF4y2Bahttp://ingenuity.force.com/ipa/IPATutorials?id=kA2500000008ZBCCA2gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba
PBMCs。gydF4y2Ba收集血液样本或在入学之前,治疗后11天内启动,测试结束。病人的样本实现SVR被用于分析(gydF4y2BangydF4y2Ba= 4[0]天;6(天6尺11寸);12(24周))。PBMCs被聚蔗糖梯度从全血分离收集和当天resuspended RPMI中含10% FCS在液态氮和7.5% DMSO存储。冷冻细胞获救在37°C和PBS + 10% FCS洗两次,和总RNA提取使用Ambion PureLink RNA设备与列DNAseI治疗。微阵列分析如上使用Affymetrix u - 219数组,和排序列表生成1%的差异表达基因。gydF4y2Ba
测试结束肝脏活检。gydF4y2Ba肝活检中收集RNAlater如上解冻,然后在三均质gydF4y2BazolgydF4y2Ba(Thermofisher科学)使用FastPrep绿色赖氨酸矩阵(MP生物医学),结合200μl 1-bromo-3-chloropropane (Sigma-Aldrich),并在4°C 16000离心机gydF4y2BaggydF4y2Ba15分钟。RNA-containing水相是通过Qiashredder列(试剂盒)在21000年gydF4y2BaggydF4y2Ba为2分钟。RNA提取使用RNeasy 96装备根据制造商的建议,包括对列DNAseI治疗。RNA质量决定在2100年生物分析仪(安捷伦科技)使用安捷伦RNA 6000 Pico工具包。平均RNA数量完整性肝活检样本(RIN)值为7.0,从4.1到8.3不等。DNA微阵列探针合成使用Ovation Pico WTA系统(Nugen Inc .)和用于杂交Affymetrix GeneChip人类基因第2.0位数组,覆盖40716 RefSeq记录。基因表达结果归一化,是由一个基因列表排序方法如上所述的成对的肝脏活检。gydF4y2Ba
加入号码。gydF4y2Ba微阵列数据存入地理(加入。GSE51699)。gydF4y2Ba
中存在gydF4y2Ba
选择基因的表达分析与预先设计或定制(用于执行gydF4y2BaIFNL3gydF4y2Ba和gydF4y2BaIFNL4gydF4y2Ba;ref。gydF4y2Ba31日gydF4y2Ba)TaqMan化验单独或组合成专门设计的96孔板或384 -微流控牌(生命技术)。总RNA分离出肝或PBMCs反向转录使用随机引物和高容量cDNA逆转录酶工具包(技术)。1 - 25 ng RNA用于每一个存在的反应。Taqman表达式分析运行与技术复制除外。基因表达是决定基于40 Ct PCR循环。统计分析,检测不到表达被分配的最小可检测水平与Ct 40。的表达gydF4y2BaGAPDHgydF4y2Ba作为一个内生控制,gydF4y2BaGAPDHgydF4y2Ba所有样本被Ct值分布在20到25之间,没有明确组样品之间的差异。相对目标归一化的表达gydF4y2BaGAPDHgydF4y2Ba计算表达式(ΔCt) CtgydF4y2BaGAPDHgydF4y2Ba- - - - - - CtgydF4y2Ba目标gydF4y2Ba,转换和显示相对于gydF4y2BaGAPDHgydF4y2Ba表达式2gydF4y2BaΔCtgydF4y2Ba。ΔΔCt值,用来计算表达式之间的样品或样本组的变化,计算ΔCtgydF4y2Ba样品一个gydF4y2Ba——ΔCtgydF4y2Ba示例BgydF4y2Ba2,然后转换成褶皱变化gydF4y2Ba-ΔΔCtgydF4y2Ba。肝脏和血液中个体的相对表达干扰素也计算百分之一的总测量干扰素([2的总和gydF4y2BaΔCtgydF4y2Ba每个干扰素/总2gydF4y2BaΔCtgydF4y2Ba所有测量的干扰素)×100)。表达反应在96孔板上运行7500实时PCR系统(干扰素和受体)。384 - 7900微流控卡片是运行在ht快速实时PCR系统(技术)。gydF4y2Ba
信使rna伊什gydF4y2Ba
肝活检标本被加工成formalin-fixed,石蜡包埋(FFPE)核心/ NIH临床中心的协议。成对预处理和测试结束核4例为分析:选择2获得SVR, 1测试结束后复发肝脏活组织检查,1有一个测试结束肝活检的时候复发(活检和复发都是4周后测试结束后检测不到丙肝病毒RNA测试结束后2周)。RNA的伊什gydF4y2BaIFI44gydF4y2Ba信使rna是2.0手动执行使用RNAscope FFPE试剂盒(先进细胞诊断)(gydF4y2Ba50gydF4y2Ba)。RNAscope探针设计特定于地区跨越核苷酸序列187 - 1170的gydF4y2BaIFI44gydF4y2Ba信使rna (NM_006417)。短暂,5-μm组织部分是之前用热量和蛋白酶预处理与目标寡核苷酸探针杂交。预处理是修改标准条件增加沸腾时间从15到30分钟(gydF4y2Ba50gydF4y2Ba)。前置放大器,放大器和HRP-labeled寡核苷酸顺序被杂化,其次是显色沉淀发展轻拍。每个样本质量控制了RNA完整性还有一个RNAscope探头B (gydF4y2BaPPIBgydF4y2Ba)RNA(积极控制)和非特异性背景调查的细菌gydF4y2Ba衣冠楚楚的gydF4y2BaB RNA(负控制)。特定的RNA染色信号被确认为棕色,有小点的点。样本与吉尔的苏木精复染色,brightfield获得图像徕卡SCN400数字幻灯片扫描仪使用×40目的。gydF4y2Ba
免疫组织化学gydF4y2Ba
BDCA2免疫组织化学(也称为CD303)来识别与anti-BDCA2 pDCs进行鼠标单克隆抗体(克隆10 e6.1;微孔)的配对从12例(肝活检gydF4y2BangydF4y2Ba= 9 (SVR);3(复发))。FFPE幻灯片deparaffinized和受到抗原检索的压力锅柠檬酸缓冲(pH值9)。抗体稀释1:10 0,然后申请在室温下2小时,chromagen检测介导Dako想象+和民建联10分钟。人类并发扁桃体进行积极的控制。gydF4y2Ba
基因分型gydF4y2Ba
基因分型的gydF4y2BaIFNL4gydF4y2Ba变体rs12979860-T / C和rs368234815-TTΔG(最初指定为ss469415590)使用基因组DNA样本和专门设计的执行TaqMan化验如前所述(gydF4y2Ba31日gydF4y2Ba,gydF4y2Ba32gydF4y2Ba)。rs4803217-T / G与专门设计的基因分型TaqMan化验:底漆,CTGTGTGTCTGACCCTTCCG;反向引物,TCCTGGAGGTGAGTTGGATTTAC;T等位基因探针,CAATAAATTAAGgydF4y2Ba一个gydF4y2BaCAAGTGGCTA(维克,MGB);探究等位基因G, ATAAATTAAGgydF4y2BaCgydF4y2BaCAAGTGGCTA (FAM MGB)。试验验证了桑格测序人类基因组单体型图样本。所有标记都使用相同的实验条件如前所述的基因(gydF4y2Ba31日gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba
病毒动力学建模gydF4y2Ba
纵向血清病毒载量和分析获得病毒动力学模型如前所述(gydF4y2Ba8gydF4y2Ba)。血清IP-10蛋白质水平之间的相关性和PBMCgydF4y2Bamx₁gydF4y2Ba基因表达与病毒动力学参数(损失阻断病毒感染细胞和药物疗效的生产)测定。gydF4y2Ba
细胞因子和趋化因子ELISAgydF4y2Ba
全血是允许在不锈钢管凝离心1700前至少60分钟gydF4y2BaggydF4y2Ba15分钟。在无菌条件下血清收集和整除之前冻结在-80°C。解冻后,血清离心机,享年1450岁gydF4y2BaggydF4y2Ba10分钟,上层清液用于ELISA。执行定量与多路复用(趋化因子9-plex,促炎9-plex)或single-plex (IFN-α2a、TIMP-1 TGF-β1)化验(中尺度发现)。Plate-to-plate可变性集中样本用于标准化的实验。所有样本作为技术重复运行,平均被用于数据分析。gydF4y2Ba
统计数据gydF4y2Ba
Mann-Whitney或Wilcoxon配对符号秩测试是用于2组比较,和一个线性mixed-effects模型用于多组纵向比较与固定效果集团(SVR对复发),时间,和组/时间交互。一个重要集团/时间相互作用表明,两组有不同的模式。一个类变量用于时间允许任意一组内平均时间模式。除了固定的影响总结平均组反应随着时间的推移,该模型满足随机的,针对病人的偏差在拦截和时间效应。相关性是由非参数评估斯皮尔曼等级相关。Spotfire S + 8.2 (TIBCO)和Prism 6.0软件(GraphPad)被用于统计分析和数据报告。gydF4y2BaPgydF4y2Ba值小于0.05被认为是重要的。gydF4y2Ba
研究批准gydF4y2Ba
所有病人提供书面或口头知情同意NIAID /国家卫生研究院的机构审查委员会批准之前加入这项研究。gydF4y2Ba
我们感谢迈克尔•Proschan京秦,杰夫斯金纳统计援助。我们感谢基科学提供sofosbuvir。这个项目已经在部分联邦基金资助的校内项目国家过敏症和传染病研究所,美国国家癌症研究所(合同编号。HHSN261200800001E),分工的国家癌症研究所癌症流行病学和遗传学,和美国国立卫生研究院临床中心。这项研究也支持部分由德国研究基金会(DFG)临床研究单位KFO 129。gydF4y2Ba
通信地址:Shyamasundaran Kottilil, NIH / NIAID 10中心驱动,建设10个房间11 n204贝塞斯达,美国马里兰州20892。电话:301.435.0936;电子邮件:gydF4y2BaSKottilil@niaid.nih.govgydF4y2Ba。gydF4y2Ba
利益冲突:gydF4y2Ba约翰McHutchison员工基科学sofosbuvir制造商。gydF4y2Ba
参考信息:gydF4y2Ba中国投资。gydF4y2Ba2014,124 (8):3352 - 3363。doi: 10.1172 / JCI75938。gydF4y2Ba