广告
研究文章免疫学免费获取|10.1172 / JCI123360
1生物化学与分子生物学,
2格鲁吉亚癌症中心、佐治亚医学院、奥古斯塔、乔治亚州,美国。
3查理·诺伍德VA医学中心、奥古斯塔、乔治亚州,美国。
4免疫学,罗斯威尔公园综合癌症中心,布法罗,纽约,美国。
5发育生物学,国家儿童健康和人类发展研究所,美国马里兰州贝塞斯达国立卫生研究院。
通信地址:Kebin刘,生物化学与分子生物学、佐治亚医学院、奥古斯塔、乔治亚州30912,美国。电话:706.721.9483;电子邮件:kliu@augusta.edu。
1生物化学与分子生物学,
2格鲁吉亚癌症中心、佐治亚医学院、奥古斯塔、乔治亚州,美国。
3查理·诺伍德VA医学中心、奥古斯塔、乔治亚州,美国。
4免疫学,罗斯威尔公园综合癌症中心,布法罗,纽约,美国。
5发育生物学,国家儿童健康和人类发展研究所,美国马里兰州贝塞斯达国立卫生研究院。
通信地址:Kebin刘,生物化学与分子生物学、佐治亚医学院、奥古斯塔、乔治亚州30912,美国。电话:706.721.9483;电子邮件:kliu@augusta.edu。
1生物化学与分子生物学,
2格鲁吉亚癌症中心、佐治亚医学院、奥古斯塔、乔治亚州,美国。
3查理·诺伍德VA医学中心、奥古斯塔、乔治亚州,美国。
4免疫学,罗斯威尔公园综合癌症中心,布法罗,纽约,美国。
5发育生物学,国家儿童健康和人类发展研究所,美国马里兰州贝塞斯达国立卫生研究院。
通信地址:Kebin刘,生物化学与分子生物学、佐治亚医学院、奥古斯塔、乔治亚州30912,美国。电话:706.721.9483;电子邮件:kliu@augusta.edu。
1生物化学与分子生物学,
2格鲁吉亚癌症中心、佐治亚医学院、奥古斯塔、乔治亚州,美国。
3查理·诺伍德VA医学中心、奥古斯塔、乔治亚州,美国。
4免疫学,罗斯威尔公园综合癌症中心,布法罗,纽约,美国。
5发育生物学,国家儿童健康和人类发展研究所,美国马里兰州贝塞斯达国立卫生研究院。
通信地址:Kebin刘,生物化学与分子生物学、佐治亚医学院、奥古斯塔、乔治亚州30912,美国。电话:706.721.9483;电子邮件:kliu@augusta.edu。
1生物化学与分子生物学,
2格鲁吉亚癌症中心、佐治亚医学院、奥古斯塔、乔治亚州,美国。
3查理·诺伍德VA医学中心、奥古斯塔、乔治亚州,美国。
4免疫学,罗斯威尔公园综合癌症中心,布法罗,纽约,美国。
5发育生物学,国家儿童健康和人类发展研究所,美国马里兰州贝塞斯达国立卫生研究院。
通信地址:Kebin刘,生物化学与分子生物学、佐治亚医学院、奥古斯塔、乔治亚州30912,美国。电话:706.721.9483;电子邮件:kliu@augusta.edu。
1生物化学与分子生物学,
2格鲁吉亚癌症中心、佐治亚医学院、奥古斯塔、乔治亚州,美国。
3查理·诺伍德VA医学中心、奥古斯塔、乔治亚州,美国。
4免疫学,罗斯威尔公园综合癌症中心,布法罗,纽约,美国。
5发育生物学,国家儿童健康和人类发展研究所,美国马里兰州贝塞斯达国立卫生研究院。
通信地址:Kebin刘,生物化学与分子生物学、佐治亚医学院、奥古斯塔、乔治亚州30912,美国。电话:706.721.9483;电子邮件:kliu@augusta.edu。
1生物化学与分子生物学,
2格鲁吉亚癌症中心、佐治亚医学院、奥古斯塔、乔治亚州,美国。
3查理·诺伍德VA医学中心、奥古斯塔、乔治亚州,美国。
4免疫学,罗斯威尔公园综合癌症中心,布法罗,纽约,美国。
5发育生物学,国家儿童健康和人类发展研究所,美国马里兰州贝塞斯达国立卫生研究院。
通信地址:Kebin刘,生物化学与分子生物学、佐治亚医学院、奥古斯塔、乔治亚州30912,美国。电话:706.721.9483;电子邮件:kliu@augusta.edu。
1生物化学与分子生物学,
2格鲁吉亚癌症中心、佐治亚医学院、奥古斯塔、乔治亚州,美国。
3查理·诺伍德VA医学中心、奥古斯塔、乔治亚州,美国。
4免疫学,罗斯威尔公园综合癌症中心,布法罗,纽约,美国。
5发育生物学,国家儿童健康和人类发展研究所,美国马里兰州贝塞斯达国立卫生研究院。
通信地址:Kebin刘,生物化学与分子生物学、佐治亚医学院、奥古斯塔、乔治亚州30912,美国。电话:706.721.9483;电子邮件:kliu@augusta.edu。
1生物化学与分子生物学,
2格鲁吉亚癌症中心、佐治亚医学院、奥古斯塔、乔治亚州,美国。
3查理·诺伍德VA医学中心、奥古斯塔、乔治亚州,美国。
4免疫学,罗斯威尔公园综合癌症中心,布法罗,纽约,美国。
5发育生物学,国家儿童健康和人类发展研究所,美国马里兰州贝塞斯达国立卫生研究院。
通信地址:Kebin刘,生物化学与分子生物学、佐治亚医学院、奥古斯塔、乔治亚州30912,美国。电话:706.721.9483;电子邮件:kliu@augusta.edu。
1生物化学与分子生物学,
2格鲁吉亚癌症中心、佐治亚医学院、奥古斯塔、乔治亚州,美国。
3查理·诺伍德VA医学中心、奥古斯塔、乔治亚州,美国。
4免疫学,罗斯威尔公园综合癌症中心,布法罗,纽约,美国。
5发育生物学,国家儿童健康和人类发展研究所,美国马里兰州贝塞斯达国立卫生研究院。
通信地址:Kebin刘,生物化学与分子生物学、佐治亚医学院、奥古斯塔、乔治亚州30912,美国。电话:706.721.9483;电子邮件:kliu@augusta.edu。
2018年11月5日出版更多信息
肿瘤细胞逃避免疫系统通过多种不同的机制,包括抗肿瘤效应的抑制T细胞通过检查点中的互动。此外,研究表明,阻止这些检查点通路可以重振抗肿瘤免疫力,从而促使无数检查站免疫疗法的发展,其中一些现在被批准用于治疗多种类型的癌症。然而,只有一小部分患者达到承诺长期抑制检查站,结果表明额外的未知的肿瘤导致免疫抑制通路的存在。在这期的江森自控克里门和他的同事描述了一个额外的T细胞抑制癌症通路。IRF8,差别特别,作者证明对这些分子的行列式凋亡抵抗,骨桥蛋白在肿瘤细胞中止镇压,进而结合其生理激活T细胞受体CD44和抑制其活化。这些结果表明,骨桥蛋白可能作为另一个免疫检查点,可以作为目标的数量扩张患者应对免疫抑制剂治疗检查站。
Michael r . Shurin
尽管突破免疫抑制剂检查站(ICI)免疫疗法,并不是所有的人类癌症应对ICI免疫治疗,大部分患者反应类型的癌症不应对当前ICI免疫疗法。这一临床难题表明附加免疫检查站存在。我们报告,干扰素调节因子8 (IRF8)不足导致损伤的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)激活和同种异体移植物肿瘤宽容。嵌合体小鼠的然而,分析竞争重建WT IRF8-KO骨髓细胞以及小鼠IRF8缺陷只有在T细胞表明IRF8没有内在作用在细胞毒性T淋巴细胞激活。IRF8充当一个阻遏的骨桥蛋白(OPN),生理配体对T细胞CD44, CD11b+Ly6C罗Ly6G+骨髓细胞和OPN作为一个强有力的T细胞抑制。IRF8绑定到Spp1启动子在结肠上皮细胞,抑制OPN表达和结肠癌癌展出IRF8降低,增加OPN表达。OPN的表达升高与降低人类结肠癌癌相关患者的生存。我们的数据表明,骨髓和肿瘤cell-expressed OPN作为免疫抑制T细胞的活化作用和检查站赋予宿主肿瘤免疫耐受。
CD8+细胞毒性T淋巴细胞(ctl)宿主适应性免疫系统的核心组件。一个典型的CD8+T细胞免疫反应从T细胞受体(TCR)识别同源抗原肽MHC类我提出的分子。细胞之间的交互和antigen-MHC类我复杂,配合costimulatory信号由costimulatory受体之间的相互作用对T细胞CD28和costimulatory配体B7.1和/或B7.2抗原呈递细胞(apc),诱发CD8+T细胞激活(1- - - - - -3)。然而,T细胞介导细胞毒性必须备用破坏正常细胞和维持自我耐受性,这是通过几种corepressive机制并通过receptor-ligand CD8之间的相互作用+T细胞和装甲运兵车。主要corepressive受体,程序性细胞死亡蛋白1 (PD-1),与程序性细胞死亡蛋白配体1 (PD-L1)和/或PD-L2表达的抗原呈递细胞(4- - - - - -6),导致CD28和TCR脱磷酸化和镇压的T细胞激活(4,7- - - - - -9)。此外,CTLA-4 LAG-3, TIM-3也充当corepressive受体抑制慢性激活效应T细胞(10)。这些corepressive受体从而函数作为免疫检查站CD8期间保持平衡+T细胞的适应性免疫反应。
ctl是主要的免疫细胞,消除肿瘤(11,12)。一方面,通过肿瘤特异性ctl识别肿瘤细胞的抗肿瘤抗原的免疫反应和抑制肿瘤的发展。然而,肿瘤细胞经常发起反击由多个机制包括抗原表达,主要和获得性耐药机制,进而关闭tumor-reactive ctl在肿瘤微环境(13- - - - - -16)。因此,肿瘤细胞劫持corepressive receptor-based免疫检查点机制来抑制tumor-reactive ctl避免免疫排斥反应(17- - - - - -20.)。基于这种机制,免疫抗体抑制剂阻止CTLA-4和PD-1 / PD-L1免疫检查点已经开发和持久的功效在许多类型的人类癌症(显示21- - - - - -23)。然而,并非所有的人类癌症免疫疗法应对这些ICI和大部分的病人反应癌症也不积极回应。这一临床难题表明可能存在其他免疫抑制肿瘤细胞毒性t淋巴细胞功能检查点被拒绝。我们旨在测试这个假说,发现干扰素调节因子8 (IRF8)函数的阻遏骨桥蛋白(OPN)表达和损失CD11b IRF8表达式+Ly6C罗Ly6G+髓细胞和结肠癌肿瘤细胞导致高架OPN的表达,作为强大的T细胞抑制。我们的数据表明,IRF8调节T细胞激活通过抑制OPN表达,和骨髓肿瘤细胞使用沉默IRF8表达上调OPN的表达,功能为免疫抑制细胞毒性T淋巴细胞激活检查站促进肿瘤宿主免疫耐受和肿瘤免疫逃避。
老鼠IRF8零容忍同种异体移植物肿瘤。4 t1肿瘤细胞,小鼠肿瘤细胞系的BALB / c起源,是orthotopically注入WT C57BL / 6小鼠的乳腺和IRF8淘汰赛(IRF8-KO) C57BL / 6小鼠的起源。4 t1肿瘤增长最初WT C57BL / 6小鼠,但很快被拒绝后2周内肿瘤移植(图1中,A和B)。令人惊讶的是,4 t1肿瘤继续生长,形成相对较大的肿瘤在所有IRF8-KO老鼠(图1中,A和B)。
IRF8对肿瘤排斥抗原CD8至关重要+T细胞激活。(一个)BALB / c mouse-derived乳房癌4 t1细胞(1×104细胞/鼠标)注入的乳腺WT (C57BL6 / J,n= 4)和IRF8-KO (C57BL / 6,n= 3)老鼠。老鼠牺牲一天26和解剖检查肿瘤的存在。WT, IRF8-KO老鼠的形象代表。红色箭头指示的位置4 t1肿瘤。右边的面板显示了比例的小鼠肿瘤。的代表图片1所示3个独立的实验。(B随着时间的推移)肿瘤生长监测。每一行代表一个老鼠的肿瘤生长动力学。(C- - - - - -E)WT (n= 4)和IRF8-KO (n= 4)小鼠接种卵肽,紧随其后的是一个提高与同一肽政权14天后。外周血收集提升和沾MHCII - 7天后,CD8和卵子tetramer-specific抗体。MHCII- - - - - -CD8+细胞被封闭的卵巢四聚物+细胞。天真的C57BL / 6小鼠作为消极和闸门控制(C)。scatter-area FSC-A,前进。显示代表块一双WT IRF8-KO老鼠从1和2独立实验(D)。四聚物的+CD8+T细胞是量化(E)。(FWT C57BL / 6和IRF8-KO BM细胞过继转移到致命辐照C57BL / 6受体小鼠重新创建嵌合体小鼠IRF8缺陷只在造血细胞。妄想WT (n= 4)和IRF8-KO (n= 3)小鼠在接种疫苗一个- - - - - -COVA-specific CD8和分析+T细胞。显示从一对老鼠代表情节。(GOVA-specific CD8)量化+T细胞在WT和IRF8-KO嵌合体小鼠。
缺乏代抗原CD8 IRF8-deficient老鼠+T细胞。同种异体移植物排斥反应是由宿主T细胞(24)。因此上面的观察表明,IRF8不足可能导致IRF8-KO小鼠T细胞功能缺陷(25)。为了验证这个假设,我们利用卵白蛋白(OVA)肽免疫系统来确定IRF8函数体内抗原T细胞反应。WT IRF8-KO小鼠接种疫苗和卵子激活CD8肽+T细胞。正如所料,WT老鼠对卵子生成OVA-specific CD8肽强劲+T细胞(图1中,汉英)。相比之下,IRF8-KO小鼠表现出明显反应生成OVA-specific CD8降低+T细胞(图1中,D和E)。互补的方法然后被验证这一发现。IRF8-KO IRF8缺陷只有在造血细胞嵌合体小鼠,并控制WT与卵子嵌合体小鼠接种疫苗。WT嵌合体小鼠的反应有效地确定OVA-specific CD8的一代+T细胞(图1 f)。符合IRF8-KO观察到的老鼠,IRF8-KO嵌合体小鼠还生成OVA-specific CD8明显减少+T细胞(图1中,F和G)。我们的数据表明,全球删除Irf8在老鼠身上导致缺乏抗原CD8的一代+T细胞体内。
IRF8-deficient CD8+T细胞CD44嗨记忆T细胞表型。确定为什么IRF8-deficient CD8细胞机制+T细胞不能被激活抗原在体内,我们执行流仪结果CD8细胞表面标记+T细胞比较WT IRF8-KO老鼠和识别之间的CD44水平明显不同2人口(图2中,A和B)。CD44的子集的百分比嗨细胞CD8明显更高+T细胞在淋巴器官IRF8-KO老鼠与WT小鼠相比图2 c)。
IRF8缺陷增加CD44嗨CD8+记忆T细胞。(一个)外周血细胞染色与僵尸紫排除死细胞和活细胞CD4的进行了分析+和CD8+T细胞。scatter-width SSC-W,一边。(B从WT)收集LN和脾细胞(n= 3)和IRF8-KO (n= 3)老鼠。CD8+细胞在封闭的一个进一步分析CD44吗嗨细胞与CD62L参考。代表块1所示的老鼠。(C)CD8的百分比+CD44嗨细胞所示一个被量化。
IRF8调节骨髓细胞OPN的表达。CD44是已知的与不同的配体,这是至关重要的细胞功能(26,27)。上述观察CD44 IRF8不足导致显著提高嗨CD8+小鼠T细胞表明CD44可能导致CD8的不足+T细胞激活。为了验证这个假设,我们首先分析了主要的表达水平在脾细胞CD44配体。透明质酸的主要配体被认为是CD44 (28)。定量聚合酶链反应(qPCR)总脾细胞的分析表明,主要的基因编码酶的表达水平的透明质酸代谢途径,包括Has1,Has2,Has3,Hyal1,Hyal2,Hyal3,Hyal5WT之间,没有显著的不同和IRF8-KO老鼠(补充图1;本文提供在线补充材料;https://doi.org/10.1172/JCI123360DS1)。OPN matricellular分泌蛋白质,还充当CD44生理配体(29日)。qPCR分析显示,总从IRF8-KO小鼠脾细胞OPN的表达了超过10倍高于WT脾细胞(图3一)。确定什么类型的细胞OPN表达、脾细胞细胞染色为B细胞OPN与表面染色(CD19), T细胞(CD3)和骨髓细胞(CD11b和Gr1一起)。浇注OPN+细胞表明OPN的95%左右+细胞CD11b+Gr1一起+在IRF8-KO老鼠。因此,我们认为这些OPN+细胞主要是CD11b+Gr1一起+髓系细胞(图3 b)。IRF8-KO老鼠OPN水平显著升高+比WT小鼠骨髓细胞(图3 c)。
IRF8压制OPN表达髓细胞的表达。(一个)从总RNA制备脾脏WT (n= 3)和IRF8-KO (n= 3)小鼠和分析通过qPCR OPN mRNA水平。(BWT)脾细胞(n= 3)和IRF8-KO (n= 3)老鼠沾CD19 - CD3 - CD11b,和Gr1-specific马伯,紧随其后的是细胞OPN的染色。OPN的+显示CD11b细胞被封闭+Gr1一起+从IRF8-KO小鼠骨髓细胞(左面板)。在这些CD11b OPN蛋白水平+Gr1一起+髓细胞显示在右面板。(C)OPN+细胞总脾细胞WT (n= 3)和IRF8-KO (n= 3)老鼠所示B被量化。(D)从IRF8-GFP小鼠脾细胞沾Ly6G——Ly6C-specific马伯。Ly6C嗨Ly6G+和Ly6C罗Ly6G- - - - - -细胞被覆盖的GFP强度。老鼠代表块1所示3(左面板)。GFP+Ly6C细胞嗨Ly6G+和Ly6C罗Ly6G- - - - - -细胞被量化,给出了正确的面板。(E)脾细胞沾Ly6C——Ly6G-specific马伯,紧随其后的是细胞内染色OPN-specific抗体。的Ly6C嗨Ly6G+和Ly6C罗Ly6G- - - - - -细胞被封闭和分析OPN表达水平。老鼠代表块1的3。OPN的+细胞Ly6C嗨Ly6G+和Ly6C罗Ly6G- - - - - -细胞被量化,给出了正确的面板。
互补的方法被用来进一步确定IRF8和OPN之间的关系。IRF8-GFP记者小鼠骨髓细胞(30.)分析了GFP强度(代孕IRF8蛋白质水平的标志)和OPN表达水平。CD11b+Ly6C罗Ly6G+骨髓细胞GFP- - - - - -髓系细胞(图3 d),有一个更高的百分比和OPN水平+比GFP细胞+CD11b+Ly6C嗨Ly6G- - - - - -髓系细胞(图3中,D和E)。因此,IRF8表达水平呈负相关,OPN在生理条件下表达水平。
OPN可以抑制T细胞的活化作用在体外。IRF8-KO小鼠有明显的观察CD44的比例更高嗨CD8+比WT小鼠T细胞,CD11b OPN表达水平显著提高+Gr1一起+IRF8-KO小鼠骨髓细胞比WT老鼠,表明CD44-OPN轴可能抑制CD8+T细胞激活。为了验证这个假设,我们培养的T细胞的重组OPN蛋白和分析T细胞增殖。事实上,OPN蛋白可以抑制CD8地+T细胞的活化和增殖能力剂量依赖性的方式(图4中,A和B)。符合抑制T细胞增殖,OPN可以抑制T细胞体外IFN-γ生产(图4 c)。确定OPN可以抑制T细胞的激活,我们分析了T细胞活化标记。OPN CD69下降+CD8+T细胞刺激(早在2小时后图4 d)。同样,CD25和PD-1-expressing CD8的水平+T细胞也减少了OPN (图4 d)。综上所述,这些数据表明OPN CD11b中高度表达+Ly6C罗Ly6G+髓细胞和CD8充当有效的抑制+T细胞激活。
OPN可以抑制T细胞的活化作用在体外。(一个)CD3+从WT小鼠脾脏T细胞与CFSE标记和培养板涂有anti-CD3(0.8μg /毫升)和anti-CD28(10μg /毫升)马伯,OPN在指定的浓度为3天。然后沾CD8-specific马伯,CD8细胞+分析了T细胞对CFSE强度。CFSE标记,如果细胞被用作控制。代表数据的细胞从老鼠1的3所示。(B)CFSE强度所示一个被量化为分裂指数。(C)CD3+T细胞培养板涂有anti-CD3(0.8μg /毫升)和anti-CD28(10μg /毫升)马伯,OPN在指定的浓度为3天一式三份。文化上层清液收集和测量IFN-γELISA的蛋白质水平。数据从B和C分析了使用1路的方差分析,Dunnett测试多个比较。(D)CD3+T细胞培养板涂有anti-CD3(0.8μg /毫升)和anti-CD28(10μg /毫升)马伯的免疫球蛋白(5μg /毫升)或OPN(1μg /毫升和5μg /毫升,分别)。细胞被收集在指定的时间点,沾CD69、CD25、PD-1,和CD8-specific马伯,并通过流式细胞术分析。数据意味着±SD。意义使用双向方差分析的计算图基的测试。
IRF8调节抗原CD8+cell-extrinsic T细胞激活的机制。以上的观察,IRF8-KO老鼠缺乏对疫苗产生抗原CD8的回应+T细胞并在CD11b OPN表达水平升高+Ly6C罗Ly6G+IRF8-KO小鼠骨髓细胞表明IRF8可能调节CD8+T细胞反应抗原cell-extrinsic的方式。为了验证这个假设,我们分析了抗原CD8+T细胞反应竞争混合骨髓(BM)嵌合体。嵌合小鼠移植生成的混合物Irf8- / -(CD45.2+)从WT SJL BM细胞和BM细胞(B6.SJL -Ptprca Pepcb/ BoyJ)句话捐助者(CD45.1+)辐照F1句(CD45.1接受者+CD45.2+)(补充图2)。因为BM IRF8-KO BM包含一个更高层次的CD11b+Gr1一起+比WT小鼠骨髓细胞,细胞注入的数量Irf8- / -和WT动物在调整比例(2:1混合Irf8- / -/ WT) (31日)。我们首先分析了发展成熟的T细胞移植后8周。虽然据报道,CD4的总数+和CD8+T细胞不IRF8-KO之间明显不同,WT小鼠淋巴器官(32),Irf8- / -BM细胞表现出竞争劣势在WT BM CD4细胞+和CD8+T细胞成熟。的水平Irf8- / -CD4+和CD8+比WT CD4 T细胞显著降低+和CD8+T细胞在混合BM嵌合体(图5中,A和B)。我们重复这个竞争激烈的混合BM嵌合体实验5:1的比例Irf8- / -/ WT,还观察到的水平Irf8- / -CD4+和CD8+比WT CD4 T细胞显著降低+和CD8+T细胞在混合BM嵌合体。此外,与WT和IRF8-KO老鼠,没有显著差异与WT CD44表达水平Irf8- / -CD8+T细胞在混合BM嵌合体BM细胞移植后8周(图5中,C和D)。
IRF8调节抗原CD8+T细胞的分化和激活cell-extrinsic的方式。(一个)竞争混合BM嵌合体是由过继转移SJL (CD45.1+WT整个细胞Irf8- / -BM细胞致命辐照C57BL / 6×SJL) F1 (CD45.1接受者+CD45.2+)。外周血细胞收集从WT IRF8-KO混合BM嵌合体小鼠,沾CD45.1, CD45.2, CD4 -,和CD8-specific马伯,并通过流式细胞术分析。显示代表块表型的WT (CD45.1)和IRF8-KO CD4 (CD45.2)+和CD8+T细胞在混合BM嵌合体。(B)CD4+和CD8+细胞WT (CD45.1)和IRF8-KO (CD45.2)所示一个被量化。(C从WT)血细胞,IRF8-KO混合BM嵌合体小鼠沾CD45.1, CD45.2, CD8, CD44和CD62L-specific马伯。CD8+T细胞是封闭的CD45.1和CD45.2细胞。WT IRF8-KO CD8+细胞CD44的进行分析嗨和CD62L+细胞。老鼠代表块1的3所示。(DCD44的百分比嗨WT CD8细胞+和IRF8-KO CD8+T细胞是量化。(EWT (CD45.1)和IRF8-KO (CD45.2)混合BM嵌合体小鼠接种卵肽,紧随其后的是一个提高与卵子肽14天后。外周血收集提升和沾MHCII - 7天后,CD8和卵子tetramer-specific抗体。MHCII-CD8+细胞被封闭的卵巢四聚物+细胞。显示代表块OVA-specific WT IRF8-KO CD8+T细胞。(F)WT和IRF8-KO CD8+OVA-specific T细胞所示E被量化。
接下来,混合BM嵌合体与卵子肽疫苗接种方案。使用相同的分析策略在WT IRF8-KO老鼠(图1),CD8+T细胞MHC II级- - - - - -细胞群被进一步封闭进CD45.1+(WT)和CD45.2+(Irf8- / -)细胞(图5 e)。卵子的分析+细胞表明,虽然Irf8- / -CD8+这些T细胞处于低水平,Irf8- / -CD8+T细胞应对疫苗WT CD8一样有效+T细胞在相同的主机(图5 e)。没有显著差异的百分比OVA-specific WTIrf8- / -CD8+T细胞(图5 f)。
抗原CD8+T细胞分化和同种异体移植物肿瘤宽容是独立于内在IRF8在T细胞功能。互补的方法被用来加强我们上面发现代抗原CD8的不足+小鼠T细胞在IRF8-KO不是由于内在IRF8函数。我们开发了一个小鼠模型与IRF8缺陷只有在T细胞(IRF8-TKO)。与IRF8-KO老鼠,IRF8-TKO老鼠也有类似的CD44嗨CD8+T细胞表型WT (Lck-cre+ / -Irf8+ / +)小鼠(图6)。此外,没有显著差异OPN的百分比+CD11b+Gr1一起+骨髓细胞。CD11b OPN蛋白水平+Gr1一起+髓细胞也不是IRF8-TKO和WT老鼠之间明显不同(图6 b)。符合正常的CD44和OPN表达模式,IRF8-TKO老鼠对卵子肽疫苗接种的相似程度WT老鼠OVA-specific CD8的一代+T细胞(图6中,C和D)。
小鼠IRF8缺陷只有在T细胞表现出在一代的抗原CD8没有缺陷+T细胞并拒绝同种异体移植物肿瘤。(一个)收集血液细胞从WT (Lck-cre+ / -Irf8+ / +,n= 7)和IRF8-TKO (n= 4)老鼠。与CD8细胞被染色,CD44-specific马伯,流式细胞术分析。CD8+和CD44嗨细胞被量化。列:意思是;酒吧:SD。(B从WT)脾细胞收集(Lck-cre+ / -Irf8+ / +,n= 7)和IRF8-TKO (n= 4)沾CD11b——Gr1-specific马伯,紧随其后的是细胞内与OPN-specific马伯染色。的CD11b+Gr1一起+细胞被封闭和分析OPN的百分比+细胞(左面板)和OPN MFI(右面板)。(C)WT (Lck-cre+ / -Irf8+ / +,n= 4)和IRF8-TKO (n= 3)小鼠接种卵肽,紧随其后的是一个提高与卵子肽14天后。外周血收集提升和沾MHCII - 7天后,CD8和卵子tetramer-specific抗体。MHCII-CD8+细胞被封闭的卵巢四聚物+细胞。显示是OVA-specific CD8的代表性的情节+T细胞在WT IRF8-TKO老鼠。(D)WT和IRF8-KO CD8+OVA-specific T细胞所示C被量化。(E)4 t1细胞(1×104细胞/鼠标)注入到乳腺BALB / c (n= 3)和IRF8-TKO (C57BL / 6,n= 4)老鼠。老鼠牺牲一天26和解剖检查肿瘤的存在。是一个代表图像显示4 t1肿瘤的BALB / c和4 t1 tumor-challenged IRF8-TKO老鼠。红色箭头指示的位置4 t1肿瘤。黄色区域表示缺乏肿瘤注射区域。右边的面板显示了比例的小鼠肿瘤。(F随着时间的推移)肿瘤生长监测和肿瘤生长动力学,提出了在左边面板中。每一行代表一个老鼠的肿瘤生长动力学。在31天肿瘤大小肿瘤注射后呈现在右侧面板中。
确定IRF8-TKO老鼠容忍一个同种异体移植物肿瘤,肿瘤4 t1细胞被注入IRF8-TKO老鼠。4 t1肿瘤细胞也注入WT BALB / c小鼠作为自体肿瘤控制。正如所料,4 t1肿瘤增长积极同系的BALB / c小鼠(图6 e)。但是,与观察到的容忍IRF8-KO小鼠同种异体移植物4 t1肿瘤(图1),IRF8-TKO老鼠拒绝了同种异体移植物4 t1肿瘤完全(图6 f)。综上所述,这些数据表明IRF8调节抗原CD8+T细胞激活和同种异体移植物肿瘤cell-extrinsic地宽容,和骨髓cell-expressed OPN可能抑制CD8+T细胞激活体内。
IRF8也压制在结肠上皮细胞OPN的表达。上述调查结果确定OPN的有力抑制T细胞和IRF8作为CD11b阻遏OPN的表达功能+Ly6C罗Ly6G+骨髓细胞。除了在髓细胞如CD11b沉默+Ly6C罗Ly6G+髓系细胞(图3中,D和E),IRF8常常是沉默在结肠癌细胞DNA甲基化(33),它提出了一个可能性,肿瘤细胞也可以使用沉默IRF8表达式作为一种机制移植OPN在肿瘤微环境细胞毒性t淋巴细胞活化。为了验证这个假设,我们利用一个自发azoxymethane-dextran元明粉(AOM-DSS)结肠癌小鼠模型。正常结肠组织和结肠肿瘤被qPCR收集和分析。正如预期的那样,IRF8显著下调在结肠肿瘤组织与正常结肠(相比图7)。CD11b观察相符+Ly6C罗Ly6G+髓细胞,OPN表达显著调节肿瘤组织与正常结肠体内(相比图7 b)。正常结肠上皮细胞有一个高水平的IRF8蛋白质,但是IRF8蛋白质在结肠肿瘤细胞检测不到(图7 c)。符合结肠肿瘤组织OPN mRNA水平升高(图7 b),OPN蛋白水平明显高于血清AOM-DSS-induced结肠肿瘤的老鼠相比患肿瘤小鼠(图7 d)。
IRF8功能的转录阻遏OPN在结肠上皮细胞。(一个和B)总RNA分离小鼠结肠(n= 5)和AOM-DSS-induced结肠癌癌(n= 3)组织和分析qPCR IRF8 (一个)和OPN (B)的表达水平。每个点代表数据从一个鼠标。使用非参数Mann-Whitney重要性决定U测试。(C)结肠组织(c1和c2)患肿瘤IRF8-GFP记者老鼠(n= 3)和肿瘤组织(c3) AOM-DSS-induced结肠肿瘤小鼠(n= 3)收集分析GFP共焦显微镜下强度。酒吧规模:100μM (c1和c3)和20μM (c2)。显示出每组的代表形象。(D)血清收集从患肿瘤(n= 6)和AOM-DSS-induced结肠肿瘤(n= 5)小鼠和ELISA分析OPN蛋白水平。(E)Spp1启动子的结构显示2假定ISRE共识序列元素。芯片扩增区域菌进行基因也表示。+ 1表示Spp1基因转录起始位点。(F)分析了正常小鼠结肠组织芯片使用免疫球蛋白(负控制)和anti-IRF8抗体。的Spp1promoter-specific qPCR-amplified区域是显示在顶部面板。输入DNA芯片qPCR被规范化。(G)CD3+T细胞刺激在anti-CD3 anti-CD28-coated板3天。核提取物的准备和分析通过使用EMSA IRF8绑定Pdcd1启动子ISRE共识序列DNA探针(补充表1)。Anti-IRF8抗体被用来识别IRF8-DNA复合物。免疫球蛋白作为消极的控制。红色箭头指向IRF8 -Pdcd1ISRE DNA复合物。(H)核提取准备从正常小鼠结肠和孵化2 ISRE DNA探针所示D。的标记Pdcd1ISRE DNA探针(冷探测器)是用于表示数量(折叠标签Spp1ISRE探针)的竞争Spp1投注到某个没头脑阔爷调查。绿色箭头点IRF8-DNA复杂。
IRF8函数作为转录激活或抑制因子根据其相关因素和目标基因启动子的共识序列(蛋白质34)。我们分析了鼠标Spp1干扰素刺激基因启动子和识别2假定的IRF8共识响应元素(ISRE1和ISRE2) (图7 e)。分析正常结肠组织的染色质免疫沉淀反应(芯片)发现IRF8协会与染色质ISRE共识序列Spp1启动子区域(图7 f)。作为补充方法,电泳迁移率改变分析(EMSA)被用来确定IRF8绑定的2假定的ISRE元素Spp1启动子。IRF8-specific抗体没有supershift IRF8-DNA复合物在核提取物结肠。确定具体的结肠上皮细胞IRF8蛋白质complex-DNA交互,我们使用冷DNA探针竞争的方法。包含ISRE后果的DNA探针序列元素的老鼠Pdcd1启动子(补充表1)与核提取物激活CD3孵化+T细胞。两个protein-DNA复合物被发现和anti-IRF8抗体取代(图7 g这个DNA探针),表明IRF8绑定。我们下一个使用Pdcd1启动子ISRE-containing DNA探针的竞争Spp1启动子ISRE调查。两个主要protein-DNA复合物时发现结肠核提取孵化了Spp1ISRE1 ISRE2 DNA探针(图7 g)和冷Pdcd1ISRE DNA探针竞争掉2 protein-DNA复合物(图7 h)。这些观察结果确定IRF8蛋白质ISRE元素的结合Spp1启动子在结肠上皮细胞抑制OPN的表达。
OPN是人类结肠癌病人外围和升高与降低针对疾病的生存。确定上述结果可以被转换到人类结肠癌患者,结肠癌的mRNA表达数据集提取和匹配正常组织的癌症基因组图谱(TCGA)数据集。IRF8表达水平显著下调在人类结肠癌癌与正常结肠,而OPN表达显著调节人类结肠癌癌与正常结肠(相比图8)。OPN是一种分泌蛋白,因此可能在病人外围OPN蛋白水平可能较高。为了验证这个假设,我们分析了患者血清标本健康的捐赠者和结肠癌。正如所料,OPN在血清蛋白水平明显高于结肠癌患者与健康的捐赠者(图8 b)。我们确定OPN是CD8的有力抑制+T细胞(图4中,A和B)和CD8+T细胞是主机的主要适应性免疫细胞癌症免疫监视作用。因此高架OPN可能减少主机癌症免疫监视作用促进肿瘤进展。为了验证这个假设,我们分析了OPN表达水平和结肠癌病人的临床结果。事实上,kaplan meier生存分析表明OPN表达水平呈负相关,结肠癌患者生存时间(图8 c)。确定人类CD8 OPN抑制+T细胞的激活,人类T细胞激活anti-CD3马伯没有或重组人类OPN蛋白的存在。分析表明OPN显著地抑制人类CD8细胞扩散+T细胞增殖的浓度5μg /毫升(图8,D和E)。符合减少核扩散,OPN也显著地抑制由人类CD8 IFN-γ分泌+T细胞(图8 f)。综上所述,我们的数据表明OPN是人类CD8的抑制剂+T细胞和OPN表达是人类结肠癌升高并分泌到边缘。OPN促进人类结肠癌进展。
OPN是人类结肠癌癌和高架负与患者生存。(一个)IRF8和OPN mRNA表达数据集在正常结肠和结肠癌癌组织表示,TCGA从数据库提取和比较。(B)血清从健康的捐赠者和结肠癌患者,收集和分析供ELISA OPN蛋白水平。每个点代表从1捐赠者或病人血清OPN蛋白水平。(C)OPN mRNA表达水平在人类结肠癌患者从TCGA的数据库中提取和分析kaplan meier生存分析。(D)CD3+人类T细胞纯化从健康的捐赠者,与CFSE标记,和培养板涂有anti-CD3(1μg /毫升)马伯,OPN在指定的浓度为3天。然后沾CD8-specific马伯,CD8细胞+分析了T细胞对CFSE强度。CFSE-labeled和如果细胞被用作控制。代表数据的细胞从1 5捐助者所示。(E)CFSE强度所示D被量化为分裂指数。数据从5健康献血者(HD1-HD5)所示。(F人类CD3)+T细胞培养板涂有anti-CD3(1μg /毫升)马伯,OPN在指定的浓度为3天。文化上层清液收集和测量IFN-γELISA的蛋白质水平。4数据显示健康的捐赠者。统计每个治疗的意义E和F由方差分析,决定使用Dunett测试多个比较。
T细胞活化,尤其是从天真的休息阶段过渡的功能效应阶段CD8 T细胞+细胞毒性T细胞,需要标记基因表达的变化,这是由T特异性转录因子(35)。除了良好的T-box转录因子(T-bet)和eomesodermin (加工)(36,37),IRF8最近成为调节CD8的另一个关键的转录因子+T细胞的活化和分化(38)。IRF8先前被标识为一个lineage-specific髓系细胞分化转录因子。零突变的小鼠IRF8展览大规模CD11b积累+Gr1一起+不成熟的髓细胞,揭示IRF8骨髓形成(的一个重要的角色32)。通过抑制粒细胞IRF8调节骨髓细胞分化发育、促进分化的单核细胞的细胞如树突状细胞和巨噬细胞(39- - - - - -43)。IRF8造血细胞分化和激活函数已经被扩展到其他造血细胞,包括B、NK细胞和T细胞(25,31日,41,43- - - - - -56)。然而,IRF8函数T细胞显然是组织和特定疾病(25,30.,38,46,53,57)。机制的底层IRF8功能调节T细胞活化在很大程度上是未知的。这里,我们确定内在IRF8函数不需要T细胞的激活,这IRF8调节T细胞激活通过抑制OPN的表达在髓细胞和肿瘤细胞。
IRF8是一个重要的lineage-specific髓系细胞分化转录因子(41),IRF8不足导致受损髓系细胞分化,包括CD8α血浆树突细胞(髓样)+传统的DCs和CD103+DCs (39,40,49,58)。IRF8-KO老鼠缺乏效应T细胞的生成和实验在实验性自身免疫性脑脊髓炎移植物抗宿主病(GVHD)小鼠模型(57,59),但底层机制是未知的。在这项研究中,我们观察到IRF8-KO老鼠不响应产生抗原特异效应CD8抗原刺激+T细胞。因此,可能缺IRF8可能降低装甲运兵车损害宿主免疫反应产生抗原T细胞体内。分析装甲运兵车IRF8-KO老鼠透露,尽管一些apc的子集的水平下降,IRF8-KO老鼠仍有大量传统DCs的水平,CD8αDCs, CD8a+DCs (补充图3)。此外,IRF8-KO Th17细胞的小鼠表现出增强的扩张和发展更严重的炎症实验结肠炎小鼠(46),这表明IRF8-KO老鼠有功能装甲运兵车和能够产生效应T细胞。因此,尽管IRF8不足可能会降低某些APC人群的水平,减少水平的装甲运兵车不大可能CD8的障碍的主要原因+T细胞的活化作用和对同种异体移植物免疫耐受肿瘤挑战IRF8-KO老鼠。
IRF8不是幼稚T细胞中表达,但迅速诱导T细胞受体(TCR)刺激和γc-cytokine (30.,59),暗示IRF8在T细胞的活化和分化中的作用。事实上,IRF8废除天真CD8敲门+T细胞分化的效应细胞实验移植物抗宿主病小鼠模型(59)。此外,在小鼠模型的实验性自身免疫性脑脊髓炎,而所有WT老鼠对髓少突细胞糖蛋白(MOG),肽疫苗接种和显示明显迹象的实验性自身免疫性脑脊髓炎IRF8-KO老鼠没有任何反应的迹象MOG疫苗接种和完全没有效应T细胞抗实验性自身免疫性脑脊髓炎(57)。在这项研究中,我们观察到IRF8-KO老鼠容忍一个同种异体移植物肿瘤的挑战。此外,我们注意到,天真CD8+T细胞不响应产生抗原CD8抗原刺激+效应T细胞。我们的观察从而支持了这样的观点,即IRF8对CD8至关重要+T细胞的活化作用和效应函数(46,57,59),确定IRF8关键作用的T细胞介导的免疫监视。然而,引人注目的是,竞争WT的结合Irf8- / -BM透露,内在IRF8函数不需要天真CD8+分化成抗原CD8 T细胞反应抗原+效应细胞,这表明CD8+基于IRF8函数T cell-extrinsic机制在调节天真CD8+体内T细胞的活化和分化。这个概念进一步支持我们的观察,IRF8-TKO老鼠对抗原刺激并拒绝同种异体移植物肿瘤WT老鼠一样有效。因此,我们相信我们已经发现了一个以前无特征机制IRF8调节CD8+通过cell-extrinsic T细胞激活机制。更重要的是,我们已经确定了骨髓细胞和T细胞的分子联系上下文中的IRF8函数T细胞激活。我们表明OPN是一个强有力的抑制T细胞的活化及其表达式IRF8压抑的骨髓细胞。在缺乏IRF8, OPN在CD11b高度表达+Ly6C罗Ly6G+在生理条件下骨髓细胞。IRF8因此充当阻遏OPN表达髓细胞cell-extrinsic促进T细胞激活的机制。我们的数据表明OPN函数作为负调节T细胞活化的压制性配体。
然而,OPN是辐照后明显升高,持续整个移植物抗宿主病(60)。OPN显然行为增强T细胞的活化和生存在移植物抗宿主病(60,61年)。OPN的机制这些对比函数移植物抗宿主病和癌症是未知的,因此需要进一步的研究。
尽管IRF8最初识别和广泛研究髓系细胞(62年),在nonhematopoietic IRF8也表达了和功能性细胞(63年,64年)和作为一个肿瘤抑制(65年,66年)。有趣的是,我们观察到IRF8表达的高度结合Spp1启动子区域抑制OPN表达结肠上皮细胞。然而,IRF8沉默,OPN表达升高在结肠上皮细胞转型为结肠肿瘤细胞,这表明肿瘤细胞的差别可能使用对这些IRF8上调OPN作为一种机制来抑制宿主细胞毒性t淋巴细胞抗肿瘤免疫反应。因此,我们相信,我们的数据显示一个以前无特征的作用机制IRF8作为一个肿瘤抑制,表明IRF8行为抑制OPN抑制OPN-mediated免疫抑制,抑制肿瘤的发展。高架OPN表达与结肠癌的发展和多种其他人类癌症(67年,68年)。我们的数据表明OPN CD11b中高度表达+Ly6C罗Ly6G+骨髓细胞和肿瘤细胞,肿瘤微环境的两个主要组件。因此,OPN可能充当另一个免疫检查点和贡献,至少部分CTLA-4 / PD-1 / PD-L1-independent免疫抑制和癌症病人接受当前的ICI免疫疗法。
老鼠。IRF8-KO老鼠生成的如前所述(32)。老鼠的loxp在Irf8B6 (Cg)的基因Irf8tm1.1Hm/ J如前所述生成(44)。B6.Cg-Tg (Lck-cre) 548 jxm / J、SJL (B6.SJL -Ptprc一个Pepcb/ BoyJ)和C57BL / 6小鼠获得杰克逊实验室。从查尔斯河获得BALB / c小鼠弗雷德里克设施。IRF8-TKO老鼠穿越B6 (Cg)创造的Irf8tm1.1Hm/ J小鼠B6.Cg-Tg (Lck-cre)548 jxm / J小鼠。IRF8-GFP记者老鼠(B6 (Cg)Irf8tm2.1Hm/ J)如前所述生成(30.)。WT和IRF8-KO嵌合体小鼠由转移5×10610×106BM细胞小鼠C57BL / 6和IRF8-KO致命(8.5 Gy)辐射C57BL / 6受体小鼠,分别。创建混合BM嵌合体小鼠C57BL / 6和SJL老鼠交叉生成F1杂种小鼠。BM细胞SJL然后IRF8-KO小鼠混合(1:2或SJL / IRF8-KO 1:5比例)和过继转移到致命辐射F1杂种小鼠生成混合嵌合体小鼠(补充图3)。
小鼠肿瘤模型。老鼠注射急性中耳炎(Sigma-Aldrich 10毫克/公斤体重)腹腔内一次,接受2.5% DSS (MP生物医学,35000 - 50000分子量)1天中耳炎注射后1周,其次是2周,无菌,未经处理的水。AOM-DSS循环重复2次。老鼠维护与普通饮用水第三AOM-DSS周期和牺牲之后进行分析。4 t1乳房癌细胞获得美国类型文化集合(写明ATCC)。4 t1细胞检测支原体和当时mycoplasma-free研究。4 t1肿瘤细胞(1×104细胞/鼠标)注入。3女性BALB / c小鼠的乳腺。
人类结肠癌癌数据集和外周血标本。的基因表达数据集提取,TCGA结肠癌和直肠癌(COADREAD)数据集使用齐娜功能基因组学Explorer (UCSD)。人类结肠癌患者血清Biorepository从格鲁吉亚获得癌症中心(奥古斯塔、乔治亚州)。人类血液标本得到健康的捐赠者的书面知情同意参加Shepeard社区血库(奥古斯塔,GA)。
GFP荧光可视化。GFP荧光可视化如前所述(30.)。组织被LSM780元共焦激光显微镜下检查(卡尔蔡司)。捕获的图像浏览和分析使用蔡司禅宗2012元成像软件。
激活CD8+T细胞通过接种疫苗在体内。小鼠接受免疫接种的卵子肽(SIINFEKL)使用报告的过程(69年)。疫苗由'其次是增加14天后,并由注入卵子肽的混合物(100μg Genscript)、CD40马伯(' 100μg,提高25μg;BioXcell)和poly-IC(50μg, Invivogen)。七天每次接种疫苗后,血液细胞收集和沾MHCII, CD45.1, CD45.2和CD8-specific马伯(BioLegend)和卵四聚物(BML实习生Corp .)。使用一个Fc受体阻滞剂(BioLegend)会同卵巢四聚物。染色分析细胞在LSR二流式细胞分析仪(BD生物科学)。
细胞表面标记分析。细胞和抗体染色和流式细胞术分析。下面的抗体和染料从BioLegend: CD4(克隆RM4-5) CD8(克隆53 - 6.7),CD25(克隆PC61) CD11b(克隆M1/70) Gr1一起(克隆RB6-8C5) Ly6G(克隆1 a8), Ly6C(克隆HK1.4) CD45.1(克隆表达A20) CD45.2(104年克隆),CD44(克隆IM7)、CD62L(克隆MEL-14),和僵尸紫罗兰。染色分析细胞在一个Accuri C6, LSRII或LSR Fortessa (BD生物科学)。
T细胞在体外激活。CD3+从小鼠脾脏和淋巴结T细胞纯化MojoSort鼠标CD3 T细胞隔离设备(BioLegend)根据制造商的指示。人类CD3+从外周血T细胞纯化细胞使用MojoSort人类CD3健康的捐赠者+T细胞隔离设备(BioLegend)。小鼠T细胞活化,96孔培养板是涂有anti-mouse CD3(克隆145 - 2 - c11)和anti-mouse CD28 37.51(克隆)马伯(BioXcell) PBS一夜之间在4°C。对人类T细胞激活,一个96孔培养板涂有反CD3(克隆OKT3)马伯(BioLegend)。鼠标OPN蛋白(目录763604年,BioLegend)和人类OPN蛋白(目录1433 - op,研发系统)。纯化T细胞(1.5×105细胞/)被播种在涂层板rpmi - 1640中加上10%的边后卫。对细胞增殖测定纯化CD3+T细胞被标记为0.1μM CFSE根据制造商的指示(表达载体)。CFSE-labeled细胞进行了分析使用一个Accuri流式细胞分析仪(BD生物科学)。
EMSA protein-DNA交互。CD3+T细胞纯化从使用MojoSort CD3脾和淋巴结+T细胞隔离工具如上所述。anti-CD3 T细胞被激活,anti-CD28 mAb-coated板块为3天,用于准备核提取(如前所述)(70年)。从小鼠结肠组织收集和均质玻璃均质器核提取制备所述(70年)。包含ISRE共识序列互补的寡核苷酸的老鼠Spp1启动子(补充表1)是合成和退火使双链DNA探针。互补的寡核苷酸序列包含ISRE后果的老鼠Pdcd1启动子(补充表1)也被合成和退火使双链DNA探针。DNA探针和32 p和孵化end-labeled核提取物的免疫球蛋白,anti-IRF8抗体(C-19,圣克鲁斯生物技术),或冷探测器。分析了dna蛋白质复合物phosphoImager通过聚丙烯酰胺凝胶电泳和检测。
芯片分析。芯片检测进行了使用anti-IRF8抗体(C-19,圣克鲁斯生物技术)和蛋白质A-agarose珠子(微孔)。鼠标Spp1启动子DNA检测到qPCR和半定量的使用gene-specific引物PCR (补充表1)。
细胞内染色和流式细胞术。细胞被染色和anti-CD11b anti-Gr1马伯,固定与IC固定缓冲区(BD生物科学),与透化作用缓冲孵化,沾PE-anti-mouse OPN(目录IC808P、研发系统)。
通过ELISA IFN-γ和OPN蛋白分析。分析了血清和细胞培养基IFN-γ和OPN蛋白水平使用鼠标IFN-γ酶联免疫试剂盒(目录430805年,BioLegend),人类IFN-γ酶联免疫试剂盒(目录430105年,BioLegend),鼠标OPN酶联免疫试剂盒(目录MOST00、研发系统),和人类OPN酶联免疫试剂盒(目录DOST00、研发系统)。
基因表达分析。总RNA分离使用GenElute直接从细胞信使RNA Miniprep工具包(Sigma-Aldrich)根据制造商的指示。互补脱氧核糖核酸合成使用MMLV逆转录酶(Promega),和用于qPCR使用StepOne实时PCR系统(应用生物系统公司)。PCR序列中列出补充表1。
统计数据。除了表示,所有使用2-tailed学生的统计分析t测试。P生存的价值分析是计算上的生存率较考克斯hazard-proportional模型。意义激活标记动力学计算使用双向方差分析与图基的测试。IFN-γ生产意义和分裂指数计算使用1路的方差分析与Dunnett修正。计算肿瘤体积(长×宽2)/ 2。P小于0.05被认为是具有统计学意义。所有数据是平均数±标准差。
研究批准。使用小鼠根据协议执行批准的2008 - 0162年奥古斯塔大学制度动物使用和保健委员会。综述了所有研究与人类标本并确定“不是人类课题研究”的奥古斯塔大学制度审查委员会批准(933148 - 1)。
JDK, AVP、EC、新航、KO和KL发达的概念和研究设计;EC和KO提供关键试剂;JDK, avon, PSR多层互连、CL和DY进行实验;JDK和KL写的手稿。
这项工作是支持由美国国立卫生研究院(CA133085 CA182518 KL和CA172105 SA),退伍军人事务部奖(KL BX001962),在校内研究项目的一部分国家儿童健康和人类发展研究所(KO)。我们感谢Roni Bollag格鲁吉亚癌症中心Biorepository病理建议人类血清标本和提供人类结肠癌的专利。我们还要感谢侯赛因苏丹协助鼠标抗原T细胞疫苗接种和分析。
通信地址:Kebin刘,生物化学与分子生物学、佐治亚医学院、奥古斯塔、乔治亚州30912,美国。电话:706.721.9483;电子邮件:kliu@augusta.edu。
利益冲突:作者宣称没有利益冲突的存在。
许可:版权2018年,美国社会对临床调查。
参考信息:中国投资。2018,128 (12):5549 - 5560. - https: / /doi.org/10.1172/JCI123360。
看到相关的评论骨桥蛋白控制肿瘤微环境中免疫抑制。