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研究文章传染性疾病病毒学免费访问|10.1172 / JCI126363
1美国爱荷华州爱荷华市爱荷华大学微生物与免疫学系。
2急症和三级护理部门,以及
3.美国田纳西州孟菲斯市,田纳西大学健康科学中心微生物与免疫学系。
4美国爱荷华州爱荷华市爱荷华大学儿科。
5明尼苏达大学信息学研究所,明尼苏达大学,明尼阿波利斯,明尼苏达州,美国。
6德国雷根斯堡大学医院内科。
7美国爱荷华州爱荷华市爱荷华大学病理科。
8呼吸疾病国家重点实验室,国家呼吸疾病临床研究中心,广州医科大学第一附属医院,广州呼吸健康研究所,中国广州。
通讯地址:Stanley Perlman,微生物和免疫学系,BSB 3-712,爱荷华大学,爱荷华市,爱荷华52242,美国。电话:319.335.8549;电子邮件:Stanley-perlman@uiowa.edu;或联系:Rudragouda Channappanavar,急性和三级护理,微生物学和免疫学,分子科学大楼701E, 858麦迪逊大道,孟菲斯,38163,美国田纳西州。电话:901.448.2524;电子邮件:rchanna1@uthsc.edu.
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发布于2019年7月29日更多信息
1型ifn (IFN-I)通常保护哺乳动物宿主免受病毒感染,但在某些情况下,IFN-I是致病性的。由于IFN-I具有保护作用,它通常用于治疗没有特定批准药物或疫苗可用的病毒感染。中东呼吸综合征-冠状病毒(MERS-CoV)就是这样一种感染,但目前对IFN-I在这种情况下的作用知之甚少。在这里,我们发现IFN-I信号在MERS-CoV感染期间具有保护作用。阻断IFN-I信号通路导致病毒清除延迟,中性粒细胞浸润增强,mers - cov特异性T细胞反应受损。值得注意的是,在感染后1天内(病毒滴度达到峰值之前)给药IFN-I可以保护小鼠免受致命感染,尽管ifn刺激基因(ISG)和炎症细胞因子基因表达减少。相反,延迟IFN-β处理不能有效抑制病毒复制;肺部单核细胞、巨噬细胞和中性粒细胞浸润和活化增加;以及促炎细胞因子表达增强,在亚致死感染中导致致命性肺炎。总之,这些结果表明,至少在感染小鼠中,IFN-I反应和最大病毒复制的相对时间是决定结果的关键。 By extension, IFN-αβ or combination therapy may need to be used cautiously to treat viral infections in clinical settings.
新出现和重新出现的高致病性人畜共患病毒对全球公共卫生构成重大威胁(1- - - - - -3.).出现了几种高致病性呼吸道病毒,如严重急性呼吸综合征冠状病毒(SARS-CoV)、中东呼吸综合征冠状病毒(MERS-CoV)和流感病毒病原株(1,3.).中东呼吸综合征冠状病毒是2012年在中东出现的一种新型人类冠状病毒,现已传播到27个国家,大多数病例记录在中东和韩国(4,5).自MERS-CoV被发现以来,已感染2374人,造成823人死亡(截至2019年2月28日)(6).中东呼吸综合征冠状病毒继续感染中东人群,因此仍然是公共卫生威胁。此外,从骆驼中分离出中东呼吸综合征冠状病毒,并在蝙蝠中鉴定出SARS和中东呼吸综合征样冠状病毒,使这些病毒有可能继续出现并引起更多疫情(7,8).尽管中东呼吸综合征的发病率和死亡率很高,但有限的尸检研究阻碍了我们对人类中东呼吸综合征的了解。此外,MERS- cov在非人类灵长类动物和其他非人类宿主中引起轻度至中度疾病,这使得研究MERS发病机制具有挑战性(9).在用于研究中东呼吸综合征冠状病毒发病机制的几种动物模型中,我们和其他人已经证明,用小鼠适应的中东呼吸综合征冠状病毒株系(MERS- cov - ma)感染人类二肽基肽酶4敲入(hDPP4-KI)小鼠可以复制人类中东呼吸综合征的若干特征(10,11).
虽然已知致病性人类冠状病毒可引起严重肺炎,但其高发病率和高死亡率的机制基础尚不完全清楚。病毒快速复制达到高滴度和相关炎症反应增强被认为是导致严重肺炎的原因(12- - - - - -14).先天抗病毒反应,特别是IFN- i (IFN-α和IFN-β)的产生,构成了抵御多种病毒感染的第一道防线。IFN-I通过直接抑制病毒复制和间接调节宿主对病毒感染的免疫反应来介导抗病毒作用,这两者都是通过诱导ifn刺激基因(ISGs)介导的(15,16).由于其抗病毒作用,IFN-I已在试验中与其他抗病毒药物联合使用,以预防和治疗未获批准的新发和复发的病毒感染(17- - - - - -20.).然而,这些试验的结果并不一致。此外,其他研究表明IFN-I在急性和慢性感染中具有致病作用(14,21- - - - - -24).总之,这些发现表明,无论是内源性还是外源性给药后,病毒复制和或相关发病机制与IFN表达动力学之间的关系导致了结果的可变性。IFN-I疗法已被用于治疗冠状病毒引起的严重呼吸道疾病患者,结果同样不一致(25).特别是,IFN-I治疗MERS患者未能提高生存率(17,26,27).例如,在一项研究中,在14天评估时,干扰素治疗延长了生存期,但在28天评估时却没有(17).
在这里,我们使用MERS-CoV感染的小鼠模型来研究在病毒性肺炎期间早期和延迟IFN反应的保护作用和致病作用的机制基础。我们发现,与sars - cov感染的小鼠不同,IFN-I信号在MERS-CoV感染期间具有保护作用,并且是病毒清除所特别需要的。早期外源性给药重组IFN-β (rIFN-β)通过抑制病毒复制和炎症细胞因子的产生,完全保护小鼠免受MERS-CoV感染。相反,延迟的rIFN-β治疗导致IFN、ISG和炎症细胞因子水平显著增加,从而导致亚致死感染中的致命疾病。这些结果表明,IFN-αβ受体(IFNAR)信号通路相对于病毒复制峰值的时间是保护性免疫和致病性免疫的关键决定因素,并可能有助于解释临床试验中获得的不同结果。
IFN-I信号通路对MERS-CoV感染期间的宿主保护至关重要。目的:探讨感染1 × 10的hDPP4-KI小鼠是否无临床疾病5MERS-CoV人分离株(Erasmus Medical Center/2012 [EMC/2012])的PFU依赖于IFN-I信号,我们用对照或抗ifnar (α-IFNAR)抗体治疗感染的hDPP4-KI小鼠。α- ifnar治疗小鼠和对照组小鼠的体重都没有下降,存活率也没有差异(图1一个).然而,α- ifnar处理的小鼠在感染后5天的病毒载量(dpi)明显高于对照组(图1 b).接下来,我们感染对照组和α- ifnar治疗的LD小鼠50MERS-CoV-MA剂量(500 PFU)。虽然我们在对照组小鼠中观察到60%的死亡率,但α- ifnar处理的小鼠100%死于MERS-CoV-MA感染(图1 c).此外,在感染亚致死剂量(200-250 PFU)的MERS-CoV-MA后,α- ifnar治疗的小鼠比对照组小鼠体重减轻更多(>25%),存活率降低(图1,D和E).两组小鼠肺病毒滴度和病毒基因组RNA (gRNA)水平在2 dpi时相似(图1,F和G).然而,在4 dpi和7 dpi时,我们观察到α- ifnar处理小鼠肺部的病毒滴度高于对照小鼠(图1,F和G).为了评估延迟病毒清除是否会导致肺外扩散,我们测量了其他器官的病毒滴度。我们没有在心脏、肝脏、脾脏或肾脏组织中检测到MERS-CoV-MA (图1 h),表明即使在没有IFN-I信号的情况下,MERS-CoV感染也仅限于hDPP4-KI小鼠的肺部。我们还进行了肺组织学研究,观察到与对照组相比,α- ifnar处理小鼠的中性粒细胞浸润和细胞增生增强(图1,I和J).然而,由于疾病进展动力学在对照组和α- ifnar处理的小鼠之间重叠,只有中性粒细胞数量的差异达到统计学意义。总之,这些结果表明,在MERS-CoV感染期间,IFN-I信号在病毒清除和宿主保护中是必需的。
IFN-I信号在MERS-CoV感染期间具有保护作用。(一个)对照组和α- ifnar处理小鼠感染1 × 10后初始体重和存活率的百分比5空斑形成单位MERS-CoV-EMC。(B)在2和5 dpi时,通过斑块试验测定肺中MERS-CoV-EMC滴度。(C- - - - - -E对照组和α- ifnar处理小鼠感染500 PFU后初始体重和存活率的百分比(C)或200-250 PFU (D,雌性小鼠;E,雄性小鼠)MERS-CoV-MA。(F和G)由斑块测定的中东呼吸综合征冠状病毒滴度(F)和gRNA水平(G)在对照组和α- ifnar处理的感染200至250 PFU的MERS-CoV-MA小鼠的肺部。(H)斑块法测定所指器官中MERS-CoV-MA滴度(4 dpi)。(我)在7 dpi时,从幼稚小鼠(上图)和mers - cov - ma感染小鼠收集的肺的代表性H&E染色,显示肺水肿和中性粒细胞浸润(中图)和细胞增殖(下图)。原始放大,×4和×20。箭头指向中性粒细胞;箭头显示细胞增殖;星号表示水肿。(J)细胞增殖和中性粒细胞分布的总结评分。数据代表2个独立实验(一个- - - - - -C,G- - - - - -我)或来自2个独立实验(D- - - - - -F和J) (n= 3 ~ 5只/组)。*P≤0.05,**P≤0.01,***P≤0.001 (B,F- - - - - -H,J),由双尾学生的t测试。生存研究的统计学意义(一个和C- - - - - -E)使用log-rank (Mantel-Cox)检验计算,95% CI和aP值小于0.05为显著。
TLR-7是呼吸道上皮细胞中MERS-CoV RNA的主要传感器。在SARS小鼠模型中,相对于肺病毒滴度峰值的IFN-I反应延迟与严重疾病相关(14).因此,我们接下来比较了hDPP4-KI小鼠中IFN反应和MERS-CoV-MA复制的动力学。与sars - cov感染小鼠不同(14),我们观察到hDPP4-Ki小鼠肺中MERS-CoV-MA复制和IFN (IFN-αβ和IFN-λ)反应的同时峰值(图2一个),这意味着早期和同时发生的IFN反应都能保护宿主免受病毒感染。接下来,我们研究了MERS-CoV RNA检测和IFN诱导所必需的先天传感器。先前使用小鼠冠状病毒的研究表明,TLR7/MyD88和MDA5/MAVS通路分别是浆细胞样dc (pDCs)和骨髓来源的巨噬细胞(BMDMs)中冠状病毒RNA感知和IFN诱导的关键介质(28,29).由于模式识别受体(PRR)的表达因细胞类型而异(30.,31)和hcov主要感染气道上皮细胞(13,32- - - - - -35),我们研究了这些途径中的一种或两种是否对上皮细胞中IFN的诱导至关重要。为此,我们转导了WT C57BL/6 (B6)和小牛- / -B6和WT BALB/c和TLR7- / -腺病毒5表达人DPP4 (Ad5-hDPP4)的BALB/c小鼠,如前所述(36).Ad5-hDPP4转导大部分气道和肺泡上皮细胞,这些Ad5-hDPP4转导的细胞大多数随后被MERS-CoV-EMC感染(36).此外,ad5 - hdpp4转导的B6和BALB/c小鼠在MERS-CoV-EMC感染后表现出类似的疾病(36).由于MAVS或TLR7缺失的hDPP4-KI小鼠不可用,并且由于只有转导的细胞被MERS-CoV感染(36),我们使用ad5 - hdpp4转导的B6, BALB/c,小牛- / -,TLR7- / -研究IFN诱导所需的传感器。此外,鼻内给药Ad5有效地转导上皮细胞(37),使我们能够研究病毒RNA在上皮细胞中的特异性感应(36).转导6天后,我们用MERS-CoV-EMC病毒感染WT和KO小鼠,并在1和2 dpi测量肺IFN转录水平(图2 b).我们发现在肺中IFN-α, IFN-β和IFN-λ的表达显著降低TLR7- / -与BALB/c小鼠的表达水平比较(图2 c).与此相反,小鼠IFN水平与对照组相似甚至升高小牛- / -与B6小鼠相比(图2 d).与MERS-CoV感染一样,SARS-CoV主要感染肺上皮细胞,并流产性感染造血细胞(13,38,39).因此我们感染了TLR7- / -和小牛- / -用小鼠适应的SARS-CoV毒株(MA15)对小鼠及其各自的WT对照进行检测,作为确定相关病毒传感分子的另一种方法。MA15感染表明,TLR7和MAVS信号转导对于肺中IFN诱导至关重要,从肺中IFN-α、IFN-β和IFN-λ mRNA水平的降低可以证明这一点TLR7- / -和小牛- / -与WT对照组小鼠的肺进行比较(补充图1,A和B).这些结果表明,TLR7/MyD88信号通路是MERS-CoV感染期间肺上皮细胞IFN反应的重要中介,而根据SARS-CoV感染后的结果,MAVS信号通路在非上皮细胞感染后也很重要。
mers - cov感染小鼠的病毒RNA感知和IFN-I产生(一个)感染MERS-CoV-MA后不同时间点hDPP4-KI小鼠肺部病毒滴度和IFN mRNA水平(200-250 PFU)。(B)演示检测MERS-CoV-MA RNA传感和IFN诱导的实验计划的示意图。(C和D在MERS-CoV-EMC感染0、1和2 dpi时,IFN-α4、IFN-β和IFN-λ相对于管家基因HPRT的转录水平(1 × 10)5PFU)在ad5 - hdpp4转导的WT和TLR7- / -老鼠(C)和ad5 - hdpp4转导的WT和小牛- / -老鼠(D).数据代表2个独立实验,4 - 5只小鼠/组/实验。*P≤0.05,**P≤0.01,***P≤0.001,****P≤0.0001的双尾学生t测试。
阻断IFN-I信号通路调节炎性单核细胞和巨噬细胞以及中性粒细胞对MERS-CoV感染的反应。hCoV感染的严重疾病通常以过度的先天免疫反应为特征。特别是炎性单核细胞和巨噬细胞(IMMs)的强烈浸润(CD45+CD11b+Ly6C嗨)发生在严重的沙士,可导致死亡(34,40,41).由于IMM迁移依赖于IFN,我们接下来测量了对照组和α- ifnar处理的hDPP4-KI小鼠肺部的免疫细胞浸润和促炎细胞因子和趋化因子mRNA水平。正如预期的那样,与对照组相比,α- ifnar处理的小鼠在2和4 dpi时肺中imm的总数显著减少(图3,A和B).相比之下,虽然中性粒细胞总数(CD45+CD11b+Ly6G嗨), α- ifnar处理小鼠的中性粒细胞数量比对照组小鼠高7 dpi (图3,C和D).此外,与对照组小鼠相比,α- ifnar处理小鼠肺部的中性粒细胞产生了明显更高水平的促炎细胞因子TNF、IL-1β和IL-6,以及更高水平的iNOS (补充图2B).为了研究IFN-I信号是否会改变肺部的其他免疫细胞,我们测量了肺泡巨噬细胞(AMs)、传统dc和NK细胞的总数。虽然感染后早期对照组和α-IFNAR小鼠的AM数量相似,但我们发现α-IFNAR治疗小鼠的AM数量在第7 dpi时增加(补充图2A).α- ifnar处理的小鼠肺部DC细胞总数和NK细胞数量分别在2和4 dpi时降低(补充图2A),表明IFN-I信号通路对这些细胞的积累有影响。
免疫细胞、细胞因子和趋化因子对MERS-CoV-MA感染的反应。(一个)代表性的FACS图和(BCD11b的定量分析+Ly6C嗨在MERS-CoV-MA感染后,对照组和α- ifnar处理的小鼠肺部的IMMs (200-250 PFU)。(C)代表性的FACS图和(D) Ly6C的定量嗨Ly6G+在MERS-CoV-MA感染后,对照组和α- ifnar处理的小鼠肺中的中性粒细胞。(E和F)对照组和α-IFNAR肺感染MERS-CoV-MA后不同天数IFNs、ISGs、细胞因子和趋化因子的mRNA水平。(G) mers - cov特异性CD4+和CD8+对照组和α- ifnar处理的小鼠肺中的T细胞是根据N99或S1165肽7 dpi刺激后IFN-γ的产生来确定的。(H)对照组的MERS-CoV-MA滴度和CD4+和CD8+T细胞衰竭的肺7dpi。数据要么来自2个独立实验(B和D)或代表2个独立实验(E- - - - - -H3 ~ 5只小鼠/组/实验。*P≤0.05,**P≤0.01,***P≤0.001,由双尾学生t测试。
此外,α- ifnar处理小鼠的肺在早期时间点(2 dpi,在某些情况下,4 dpi)与对照组相比,IFN-λ、ISGs (ISG-15和CXCL-10)以及炎症细胞因子和趋化因子(TNF, IL-6, CCL-2)的转录水平显著降低(图3 E和F).在α- ifnar处理的小鼠中,中性粒细胞趋化剂CXCL-1的水平在4 dpi时显著增加,从而在7 dpi时通过组织学和流式细胞分析检测到中性粒细胞积累增加。(图1我和图3,C和D).相比之下,α- ifnar处理的小鼠IFN-β和IFN-λ的mRNA水平以及促炎细胞因子TNF和IL-6的mRNA水平显著高于对照组7 dpi (图3 E和F),可能是由于病毒负担较高(图1,F和G)及高度活化中性粒细胞的累积(补充图2B).此外,阻断IFN-I信号通路导致mers - cov特异性CD4数量减少+和CD8+肺中的T细胞(图3 g).为了确定它们在MERS-CoV感染中的作用,我们耗尽了CD4+和CD8+T细胞使用结合α-CD4和α-CD8抗体。如图3 h,与对照抗体治疗相比,T细胞的减少损害了MERS-CoV从肺部的清除,这表明病毒特异性T细胞的减少导致α- ifnar治疗小鼠的病毒清除延迟(图1,F和G).总的来说,这些结果表明,阻断IFN-I信号通路促进炎症中性粒细胞积聚,改变细胞因子和趋化因子反应,并损害病毒特异性T细胞反应。
造血细胞中的IFN-I信号通路对病毒清除和宿主保护至关重要。在上皮细胞、造血细胞或两者中的IFN-I信号通路可能是保护免受病毒感染所必需的(42,43).值得注意的是,hDPP4-KI小鼠的脑转移细胞感染MERS-CoV后,未能产生传染性病毒(补充图3).为了研究造血IFNAR信号在MERS中的作用,我们创建了BM嵌合小鼠,如前所述(14).简单地说,BM来自B6-Ly5.1, hDPP4-KI,或IFNAR- / -供体小鼠被过份转入hDPP4-KI、B6-Ly5.1或IFNAR−−/用亚致死剂量的MERS-CoV-MA感染受体小鼠和嵌合体。不出所料,B6-Ly5.1→B6-Ly5.1→IFNAR- / -→B6-Ly5.1小鼠没有出现MERS,因为它们缺乏hDPP4表达。虽然mers - cov - ma挑战的hDPP4-KI→hDPP4-KI小鼠比B6-Ly5.1→hDPP4-KI小鼠减轻的体重更多,但它们在感染后的存活率相似(图4一).然而,在造血细胞中缺乏IFN-I信号IFNAR- / -→与接受hDPP4-KI或B6-Ly5.1 BM的hDPP4-KI小鼠相比,hDPP4-KI小鼠的生存率显著降低(图4一).此外,虽然MERS-CoV gRNA水平在hDPP4-KI和hDPP4-KI中相似IFNAR- / -→hDPP4-KI小鼠在2 dpi时,我们观察到MERS-CoV RNA水平增加了4- 5倍IFNAR- / -→hDPP4-KI肺与hDPP4-KI肺6 dpi水平比较(图4 b).我们还测量了嵌合小鼠中IFN、ISG和其他炎症细胞因子的mRNA水平。我们发现造血细胞中IFN- i信号的缺失导致肺中IFN-α和IFN-β、IFN-λ和ISG-15转录水平在2 dpi时降低,而在2 dpi (TNF)和6 dpi (IL-6和ccl -1)时促炎细胞因子和趋化因子转录水平升高(图4,C和D).这些数据表明,造血细胞中的IFNAR信号通路对于病毒清除和预防MERS-CoV感染后的死亡至关重要。
造血细胞上的IFNAR信号通路对于保护宿主免受MERS-CoV-MA感染至关重要。(一个) MERS-CoV-MA攻毒后BM嵌合小鼠初始体重和存活率的百分比(500 PFU, i.n)。数据来自2个独立实验,每组/实验3 - 5只小鼠。(B) BM嵌合小鼠肺中MERS-CoV gRNA水平在2和6 dpi。(C和D) ifn和ISGs的mRNA水平(C)和炎症细胞因子及趋化因子(D)在感染mers - cov的BM嵌合小鼠(hDPP4-KI hDPP4-KI和IFNAR- / -hDPP4-KI)。(一个)体重减轻和生存曲线显示来自2个独立实验的合并数据(n= 4 ~ 5只小鼠/组/实验)。生存研究的统计学意义一个使用log-rank (Mantel-Cox)检验计算,95% CI和P值小于0.05为显著。(B- - - - - -D)图表显示来自2个独立实验的汇总数据(n= 2-3只小鼠/组/实验)。*P≤0.05,**P≤0.01,由双尾学生t测试。
早期使用rIFN-β治疗可完全预防致命的MERS-CoV感染。本研究的结果,连同先前的研究结果(14),表明IFN反应高峰的时间决定了疾病的结局。为了进一步研究呼吸道病毒感染期间IFN时间与疾病结局的关系,我们用750 U rIFN-β或PBS治疗致命感染(750 PFU MERS-CoV-MA) hDPP4-KI小鼠6小时/年(hpi)或1 dpi (图5一个).这些时间点是在病毒复制高峰发生之前,并且rIFN-β剂量大约相当于人类使用的剂量(44,45).正如预期的那样,所有pbs治疗的小鼠都死于感染,而rIFN-β治疗的小鼠在6 hpi或1 dpi时被保护免受致命的MERS (图5 b).在2和4 dpi时,rIFN-β治疗显著降低了MERS-CoV-MA gRNA在肺部的表达(图5 c).令人惊讶的是,与PBS对照组相比,rIFN-β处理组ISGs的表达下调了4 dpi (图5 d).同样,我们检测到与对照组小鼠相比,rIFN-β处理组在4 dpi时TNF和CCL-2水平降低(图5 e).在2 dpi和6 dpi时,各组间ISG-15、CXCL-10、CCL-2和TNF水平无差异。早期rIFN-β治疗在4 dpi时也降低了肺浸润imm的频率和数量以及中性粒细胞的数量,但在2或6 dpi时没有降低(图5,F和H).此外,在4 dpi时,rIFN-β处理小鼠肺部的IMMs和中性粒细胞的激活程度较低,这可以通过CD80的表达降低和TNF的数量降低来证明+TLR4 (LPS)或TLR7 (R837)配体刺激后的IMMs (图5,G和I).总的来说,这些结果表明,早期使用rIFN-β治疗可以通过抑制病毒复制和抑制对MERS-CoV感染的有害炎症反应来保护宿主免受死亡。
早期使用rIFN-β治疗可以通过抑制MERS-CoV-MA复制和减少炎症来保护宿主。(一个)检测MERS-CoV-MA感染后早期rIFN-β治疗效果的实验计划示意图。(B感染mers - cov - ma的hDPP4-KI小鼠接受PBS或rIFN-β治疗6小时/次或1 dpi的初始体重和存活率百分比。(CPBS或rIFN-β (1 dpi,早期治疗)治疗小鼠肺部的MERS-CoV gRNA水平在2,4和6 dpi。(D和E) ISGs的mRNA水平(D)和炎症细胞因子及趋化因子(EPBS-或rIFN-β -处理(1 dpi)小鼠。(F和H4 dpi时PBS-或rIFN-β -处理小鼠肺内imm和中性粒细胞的百分比和总数。(G和我) cd80表达百分比和TNF总数+PBS-和rIFN-β -处理小鼠(1 dpi)肺中的IMMs和中性粒细胞在4 dpi。数据来自2个独立的实验(B- - - - - -我)或代表两个独立的实验(E,右面板)(n= 4-5只小鼠/组/实验)。**P≤0.01,***P≤0.001,****P≤0.0001,由双尾学生t测试。生存研究的统计学意义B使用log-rank (Mantel-Cox)检验计算,95% CI和P值小于0.05为显著。
在MERS-CoV感染期间,延迟IFN治疗对宿主有害。我们接下来评估了延迟rIFN-β治疗(相对于病毒复制峰值)对MERS发病机制的影响。我们用亚致死剂量的MERS-CoV-MA感染hDPP4-KI小鼠,随后用PBS或rIFN-β以2或4 dpi (图6).与pbs治疗的小鼠相比,在2 dpi和4 dpi时接受rIFN-β治疗的小鼠体重减轻增加,存活率降低,即使治疗早在2 dpi时开始(图6 b),证实IFNAR信号延迟实际上是有害的。此外,延迟的rIFN-β治疗在亚致死感染SARS-CoV的小鼠中引起致命疾病(补充图4A),表明延迟IFN-I信号的致死作用不是病原体特异性的。与早期rIFN-β给药的效果相比(图5 c),在2 dpi时,用rIFN-β处理的小鼠在3 dpi时病毒RNA水平仅降低了3- 4倍,但在5和7 dpi时,与pbs处理的小鼠相比,病毒RNA水平相似或有更高的趋势(图6 c).此外,与PBS对照组相比,在5 dpi时,给药2 dpi的rIFN-β导致ISG和炎症细胞因子mRNA (ISG-15、CXCL-10、CCL-2和TNF)水平显著升高(图6,D和E).此外,我们在5和7 dpi时检测到rIFN-β处理的动物肺部imm和中性粒细胞的频率和总数增加(图6,F和H).此外,经rIFN-β处理的小鼠肺部的imm和中性粒细胞被高度激活,这可以通过CD80表达和/或TNF数量的增加来证明+TLR4或TLR7刺激后imm和中性粒细胞(图6,G和I).我们还观察到病毒特异性CD4细胞减少+和CD8+与对照组和1 dpi剂量的rIFN-β处理小鼠相比,2 dpi剂量的rIFN-β处理小鼠肺部的T细胞数量(补充图4B).为了检验IMMs是否会导致在2 dpi使用rIFN-β治疗的小鼠的肺部病理,我们在2和4 dpi使用α-CCR2抗体消除IMMs。与接受对照抗体的小鼠相比,IMM衰竭的小鼠免于死亡(图6 j),证明IMMs在延迟rIFN-β治疗后的致死率中具有因果作用。这些结果,连同我们先前的研究(14),提示在MERS-CoV感染过程中,延迟IFN-I信号通路或延迟使用rIFN-β治疗不能有效控制病毒复制,对宿主有害。此外,这些发现表明ifn介导的imm向肺部的招募有助于致命性。
延迟IFN治疗可促进mers - cov - ma感染小鼠的炎症和死亡率。(一个)实验计划的示意图,以检查延迟rIFN-β处理的效果。(BPBS或rIFN-β处理2或4 dpi感染mers - cov - ma的hDPP4-KI小鼠的初始体重和存活率的百分比。(CPBS或rIFN-β治疗小鼠的肺中MERS-CoV滴度分别为3,5,7 dpi (2 dpi,延迟治疗)。(D和EPBS-或rIFN-β -处理(2 dpi,延迟治疗)小鼠肺中ISGs和炎症细胞因子和趋化因子的mRNA水平。(F和HPBS-或rIFN-β -处理小鼠肺中imm和中性粒细胞的频率和数量(2 dpi)。(G和我) cd80表达百分比和TNF总数+PBS-和rIFN-β -处理小鼠的IMMs和中性粒细胞(2 dpi)在5 dpi。(J用rIFN-β (2 dpi)和α-CCR2抗体或对照抗体(2 dpi和4 dpi)处理的mers - cov - ma感染(200 PFU) hDPP4-KI小鼠的初始体重和存活率百分比。数据来自2个独立的实验(B和F- - - - - -H,左面板,我,左面板,和J)或代表两个独立的实验(E,G,我,右2个面板)(n= 3-5只小鼠/组/实验)。数据分析使用双尾学生t使用*进行测试P≤0.05,**P≤0.01,***P≤0.001,****P≤0.0001。生存研究的统计学意义(B(右)使用log-rank (mantle - cox)检验计算,95% CI和aP值小于0.05为显著。
早期和晚期IFN治疗后肺中的差异基因表达谱。为了确定早期和延迟IFN治疗在MERS-CoV感染期间的其他影响,我们进行了基于rna - seq的转录分析,以研究早期(1 dpi)或延迟(2 dpi) rIFN-β治疗感染小鼠肺部整体基因表达的变化。共有415个基因差异表达(fdr校正P< 0.001;日志2与PBS对照组相比,早期接受rIFN-β治疗的小鼠肺部>的fold变化为1.5)(图7).值得注意的是,在接受早期rIFN-β治疗的组中,参与病毒核酸传感、ISGs、ifn相关转录因子以及几种促炎细胞因子和趋化因子的基因表达水平显著降低(图7,B和C).与这一观察结果一致,匠心通路分析(IPA)显示,在接受早期rIFN-β治疗的组中,PRRs、细胞质受体的IFN调节因子(IRF)激活和IFN信号通路均降低(图7 d).早期用rIFN-β治疗的肺中上调的基因较少,但这些基因包括与SOCS1、前列腺素E2受体、sirtuin1和Irgm1信号通路相关的基因。
早期或延迟rIFN-β治疗mers - cov - ma感染肺部基因表达谱的RNA-Seq分析hDPP4-KI小鼠感染MERS-CoV-MA (200 PFU)后,用750 U rIFN-β处理1 dpi(早期,一个- - - - - -D)或2 dpi(延迟,E- - - - - -H).小鼠在rIFN-β治疗后2天安乐死(早期rIFN-β治疗组小鼠3 dpi,延迟rIFN-β治疗组小鼠4 dpi)。从全肺中分离的RNA用于RNA- seq研究。(一个和Bpbs处理小鼠与早期rIFN-β处理小鼠肺部差异基因表达谱的热图显示所有转录本(一个)和选定的先天免疫途径(B).(C)用原木绘制的火山平面图2折叠变化和对数10PPBS处理小鼠与早期用rIFN-β处理小鼠肺中差异表达基因的差异值。(D)通过途径分析发现,对照组和早期rIFN-β治疗组的主要先天免疫途径被差异调节。结果显示,rIFN-β处理后几种促炎介质的表达降低。(E和FPBS处理小鼠与延迟接受rIFN-β处理小鼠肺中差异基因表达的热图,显示所有转录本(E)和选定的先天免疫基因(F).(G)用原木绘制的火山平面图2折叠变化和对数10Ppbs处理的小鼠与延迟rIFN-β处理的小鼠肺部差异表达基因的值。红色表示上调;蓝色表示下调。数据来源于每组4只小鼠,并调整了fdrP小于0.001的值和一个日志2折叠变化大于1.5。
当对照组小鼠和接受晚期rIFN-β治疗的小鼠进行比较时,我们观察到一组不同的基因表达谱变化。共有77个基因差异表达(fdr校正P< 0.001;日志2与PBS对照肺相比,接受延迟rIFN-β治疗的小鼠肺中>的倍变化1.5)(图7,E和G),这些基因与早期rIFN-β处理中发现的基因不同,只有11个基因重叠。我们观察到在接受延迟rIFN-β治疗的小鼠中TLR4和炎症细胞因子(IL-6)和趋化因子(CXCL-14)的表达增加(图7 f).此外,IPA还显示与补体活化和凝固有关的基因表达上调(Thbs1和Serpine1),巨噬细胞活化,以及延迟rIFN-β治疗小鼠的炎症通路(图7 f和补充表1).总的来说,这些结果表明,早期和延迟的rIFN-β治疗在感染MERS-CoV的小鼠中诱导了不同的基因表达谱。虽然早期的rIFN-β治疗减弱了抗病毒和炎症基因的表达,但延迟的rIFN-β治疗增加了与炎症相关的一个基因子集的表达。
利用MERS小鼠模型,我们发现IFN-I反应对宿主保护和病毒清除至关重要。IFN-I对病毒清除的最佳动力学至关重要,对肺中达到的最大滴度没有影响(图1,B, F, G).IFN-I表达和MERS-CoV复制峰值同时发生,导致感染肺部的保护性T细胞反应。与此一致的是,早期给予IFN-I具有保护作用。相反,晚期外源性IFN-I通过激活imm和中性粒细胞、增强促炎细胞因子反应和抑制最佳病毒特异性T细胞反应来促进致死率。在中东呼吸综合征患者中也观察到类似的结果,对他们来说,严重疾病与中性粒细胞和单核细胞数量增加以及促炎细胞因子(包括IFN-I)水平升高相关。46,47).这些结果与在sars - cov感染小鼠中获得的结果形成对比,在这些小鼠中,内源性IFN-I反应是有害的,因此在没有IFN-I反应的情况下,生存率提高了(14),其中IFN-I表达峰值滞后于病毒复制峰值。总之,这些数据表明,相对于病毒复制动力学的IFN-I反应时间在决定疾病结果方面至关重要。
α- ifnar治疗的小鼠在MERS-CoV感染后病毒清除延迟可能是MERS-CoV特异性CD4受损的结果+和CD8+T细胞反应,在缺乏IFN-I信号的情况下减弱(补充图2).这些结果与其他研究一致,表明保护性T细胞反应的出现需要最佳的IFN-I反应(48,49).就像之前对sars - cov感染小鼠和其他病毒病原体的研究一样(50,51),我们的结果证实了T细胞在MERS-CoV感染期间的病毒清除中起着不可或缺的作用。之前的一项研究表明,CD4+和CD8+在mers - cov感染小鼠中,病毒清除单独需要T细胞(52);然而,我们的研究结果表明,CD4和CD4的耗竭+和CD8+T细胞导致了次优的病毒清除,这表明某种程度的冗余。值得注意的是,α-IFNAR小鼠imm数量减少,中性粒细胞浸润增加(图3,A和B)可能是由于在缺乏IFN-I信号的情况下,IMM和中性粒细胞趋化因子的产生发生了改变(53).此外,中性粒细胞促炎活性的增强(补充图2B)可能是α-IFNAR小鼠肺部促炎细胞因子和趋化因子表达增加的原因(图3 E和F).尽管最近的其他研究表明中性粒细胞浸润类似增加(53), IFN-I信号通路对中性粒细胞促炎活性的差异调控相对尚未探索。总的来说,这些结果表明,在α- ifnar处理的小鼠中,与炎症中性粒细胞积累增加相关的较高病毒负担导致致命肺炎。
MERS-CoV复制能力较差,但在活化的人脑转移瘤来源细胞中诱导强烈的促炎反应(54,55),并在活化的人类T细胞中复制(56).然而,我们的研究表明MERS-CoV未能在hDPP4-KI bm来源的细胞中复制(补充图3).尽管有这些结果,我们的嵌合体研究证明了IFNAR信号在造血细胞中的保护作用。降低了hDPP4小鼠肺部IFN和ISG的转录水平IFNAR- / -BM (图4 c)表明IFN和ISG是通过造血细胞中IFNAR信号的反馈放大而诱导的(图4,C和D),随后在诱导IFN和ISG以及对MERS-CoV感染的宿主保护中发挥了重要作用。顺便说一句,虽然尚不清楚在MERS- cov感染期间,哪种造血细胞类型(如果有的话)是IFN的主要来源,但在人类细胞中的MERS研究(57)和sars冠状病毒在人类造血细胞和小鼠模型中的研究(14,42)表明,pDCs,可能还有巨噬细胞,是感染小鼠IFN的来源。
先前的研究已经证明了MDA5在感知冠状病毒RNA并由此启动IFN-I反应方面的关键作用(29).这些研究大多使用了被小鼠冠状病毒(小鼠肝炎病毒)感染的巨噬细胞,这种病毒是嗜巨噬细胞的(58,59).由于人类冠状病毒主要感染气道和肺泡上皮细胞,且PRR的表达具有细胞类型特异性,我们使用Ad5-hDPP4转导小鼠,然后感染人类EMC/2012株MERS-CoV,检测了IFN在气道和肺泡上皮细胞中产生所必需的PRRs。Ad5主要感染上皮细胞而非髓细胞(37).这些研究结果表明,肺上皮细胞感染后IFN的产生需要TLR7/MyD88信号通路,而不是MAVS信号通路(图2,A和B).如前所述,人类pDCs是中东呼吸综合征冠状病毒感染后IFN-I的主要造血细胞来源(57),信号通过TLR7发生。在ad5 - hdpp4转导的细胞中,感染的上皮细胞或未感染的pDCs对tlr7依赖的IFN-I表达最重要,这需要进一步的研究。这些结果与先前的研究相似,表明更严重的临床疾病和较慢的病毒清除动力学IFNAR- / -和Myd88- / -与WT和小鼠比较小牛- / -Ad5-hDPP4转导后小鼠与MERS-CoV感染(36).这些数据,连同其他发现,证明PRRs的RNA感应是病毒特异性的,因为MAVS单独或MyD88和MAVS一起,分别对感染呼吸道合胞病毒(RSV)或甲型流感病毒(IAV)的小鼠诱导IFN和ISG至关重要(60,61).此外,免疫规避机制,如MERS-CoV 4a蛋白介导的PACT(一种激活RIG和MDA5的dsrna结合蛋白)抑制,可能损害MDA5介导的IFN-I反应(62).
早期rIFN-β治疗显著降低了肺部的病毒gRNA水平,而在rIFN-β治疗后没有增加ISG的表达(2和6 dpi) (图5和7).这一结果出乎意料,因为IFN-Is的抗病毒作用主要是由isg介导的,isg通过多种机制减轻病毒负担(15).相反,我们在4 dpi(干扰素治疗后第3天)检测到肺中ISG和炎症细胞因子和趋化因子的表达显著降低。这些ISGs和炎症细胞因子表达的降低不是由于病毒病原体相关分子模式(PAMPs)的降低,因为尽管病毒gRNA水平降低,这些介质的水平在2和6 dpi时相似(图5 c).我们的研究结果表明,早期IFN治疗可抑制炎症细胞因子和趋化因子的表达,从而抑制炎症细胞(尤其是imm和中性粒细胞)在肺部的积累和功能。这些结果还揭示了IFN在急性病毒感染早期的抗炎免疫调节作用。与早期IFN治疗结果完全相反,延迟IFN治疗导致了强烈的促炎反应,并没有改善病毒清除(图6,D-I).值得注意的是,我们检测到与凝血分子相关的基因上调,这被证明有助于sars - cov感染小鼠的严重疾病(63).病毒复制的无效控制可能是由于病毒蛋白的IFN和ISG拮抗作用,和/或病毒特异性T细胞反应受损的结果(14,64).虽然需要进一步的研究来确定延迟的IFN-I信号在其他病毒性肺部感染中是否具有致病性,但在接受长时间rIFN-α治疗的ivv感染小鼠中观察到的疾病严重程度的增加支持了这种信号具有有害影响的观点(65).
此外,在延迟使用IFN-β治疗的小鼠中观察到的夸张炎症反应强调了在急性病毒感染期间早期IFN治疗的重要性。在我们的研究中,在恒河猕猴MERS-CoV感染期间预防性或早期治疗性使用ifn提供了显著的保护(66).然而,对人类的研究未能最终确定rIFN治疗的有益效果(17,26,27,67),这可能是因为相对于病毒滴度峰值的给药时间较晚。我们的结果和这些临床研究表明,IFN-I治疗具有保护和致病作用,这取决于与感染相关的给药时间。我们试图通过在感染后的不同时间点用人类IFN-I治疗mers - cov感染的人类气道细胞,并检测促炎细胞因子水平和病毒滴度来直接证明这一点。然而,我们的结果并不一致,因为病毒和促炎细胞因子的相对水平在实验之间有所不同。炎症介质表达的这种可变性很可能是因为IFN-I被施用于实验感染的动物或患者,在肺部复杂的炎症环境中起作用,并同时作用于感染细胞和旁观者细胞。孤立地观察人类呼吸道细胞感染MERS-CoV并不能充分反映这种复杂性。
总之,我们的研究结果证明了IFN-I在促进MERS-CoV期间病毒清除和宿主存活方面的关键作用。此外,我们的研究结果表明,延迟的IFN反应有助于严重的病毒性肺部感染,因此,了解MERS-CoV复制的动力学对于开发合理的治疗方法至关重要。开发能够提供特定患者病毒学和炎症状态信息的检测方法,以便能够适当使用干扰素和其他治疗方法也很重要。由于相对于病毒复制的IFN- i反应时间对于确定疾病结局至关重要,因此在治疗急性病毒感染时应谨慎使用IFN或联合治疗,因为病毒复制的峰值在患者中通常是未知的。
老鼠和病毒
如前所述,生成特异性无病原体的人DPP4-KI小鼠(10).这些研究使用8-12周大的雄性和雌性小鼠。B6、B6- ly5.1和BALB/c小鼠购自Charles River实验室。小牛- / -小鼠在B6背景和TLR7- / -BALB/c背景小鼠分别由Michael Gale Jr.(华盛顿大学,西雅图,华盛顿,美国)和Westley Reeves(佛罗里达大学,盖恩斯维尔,佛罗里达,美国,经Shizuo Akira,大阪大学,大阪,日本)赠送。TLR7- / -通过与Charles River BALB/c小鼠(Charles River实验室)杂交重新衍生小鼠。老鼠是在爱荷华大学的动物护理设施中繁殖和饲养的。MERS-CoV-MA15菌株如前所述产生(10).用氯胺酮麻醉小鼠,注射200 ~ 250 PFU(亚致死)、500 PFU (LD50),或用1000 PFU(致死剂量)的MERS-CoV-MA在50 μL DMEM中注射。所有有关中东呼吸综合征冠状病毒的工作都在爱荷华大学生物安全3级(BSL3)和动物BSL3实验室进行。
肺病毒滴度
为了获得用于病毒滴度的组织,在攻击后的不同天数对小鼠实施安乐死,将肺取出并在PBS中均质,并测定Vero E81细胞的滴度。细胞用10%甲醛固定,结晶紫3 dpi染色。病毒滴度以PFU/肺表示。
肺组织学
麻醉动物,经心灌注10ml PBS和5ml锌福尔马林。取肺,用锌福尔马林固定,石蜡包埋。切片用H&E染色,用光学显微镜盲法检查(68).对照组和α- ifnar治疗组的肺进行水肿和细胞增殖评分(例如,重塑和修复改变,如纤维增生和/或上皮增生),评分为0、1、2、3和4,分别代表0%、小于3%、6%-33%、33%-66%和超过66%的肺区域。肺中性粒细胞浸润情况评分,0、1、2、3、4分分别代表血管周围多形核细胞分布为0%、小于3%、6%-33%、33%-66%和大于66%的区域。
用于流式细胞术分析的肺细胞制剂
在指定的时间点处死小鼠,经右心室灌注10 mL PBS。将获得的肺切碎,在含有2% FCS、25 mM HEPES、1mg /mL胶原酶D (Roche)和0.1 mg/mL DNase (Roche)的HBSS缓冲液中室温消化30分钟。消化后的组织经70 μm细胞过滤器压除颗粒物质,得到单细胞悬浮液。用0.2%台锥蓝排除或用Scepter 2.0细胞计数器(MilliporeSigma)枚举细胞。
细胞内细胞因子染色
细胞内细胞因子染色(ICS) 1 × 106每个孔的细胞在1 μg Golgiplug (BD Biosciences)的存在下,在37℃下孵育6小时。用浓度为1 μ m的特异性肽刺激肺细胞后进行T细胞ICS。MERS-CoV-specific CD8+和CD4+T细胞反应通过与先前定义的表位(S1165)相对应的多肽进行鉴定(36)和最近发现的(我们实验室)表位(N99, YFYYTGTGPEAALPF)。中性粒细胞ICS通过在37°C下无刺激孵育肺细胞7小时进行。IMM ICS对LPS (100 ng/mL,)或R837 (TLR7激动剂,1 μg/mL)刺激的细胞进行。用1 μg α-CD16/α-CD32抗体对细胞进行冲洗和阻断,并在冰上对细胞表面进行抗体染色。然后用Cytofix/Cytoperm Solution (BD Biosciences)对细胞进行固定和渗透,并用α-细胞因子抗体进行标记。所有流式细胞术数据均在BD FACSVerse (BD Biosciences)上采集,并使用FlowJo软件(Tree Star)进行分析。
抗体和rIFN-β
对于表面和细胞内染色,细胞用以下针对小鼠抗原的荧光标记抗体孵卵:PECy7 α-CD45 (30-F11);FITC α-Ly6G (1A8, BD Biosciences);PE/PerCp-Cy5.5 α-Ly6C (AL-21 [BD生物科学]或HK1.4);V450 α-CD11b (M1/70);Apc α-f4/80 (bm8);FITC/PE α-CD11c (HL3);α-CD80 (16-10A1);αcd4 (RM4-5);αcd8α(53 - 6.7);Apc α-tnf -α; APC α–IL-6 (MP5-20F3); APC α–IL-β (NJTEN3); APC α-iNOS (CXNFT, BD Biosciences); and PerCp-Cy5.5 α-IA/IE (M5/114.15.2) (unless otherwise stated, all from eBioscience). APC/PE α-CCR2 (475301) was purchased from R&D Systems; PE/APC α–BST-2 (JF051C2.4.1) was obtained from Miltenyi Biotec; and APC–MCP-1 (clone 2H5) was purchased from BioLegend. rIFN-β was obtained from PBL Assay Science (catalog 12405-1). For in vivo studies, 750 U rIFN-β in PBS was administered i.n. at the indicated time points
体内抗体治疗和单核细胞和中性粒细胞耗竭
7 ~ 8周龄BALB/c小鼠分别在- 6小时(750 μg)和第1天(250 μg)用阻断α-IFNAR单克隆抗体(克隆MAR1-5A3, Bio X Cell)进行免疫处理。使用相同浓度的小鼠IgG1(克隆MOPC21)作为对照抗体。α-CCR2抗体(克隆MC21, 25 μg/剂量,250 μL PBS, i.p) (69)在2和4 dpi给药。用类似浓度的大鼠igg作为对照抗体。α-CD4(克隆GK1.5, 250 μg/只)和α-CD8抗体(克隆2.43 250 μg/只)在- 2,0和+2 dpi联合作用小鼠,T细胞消失。对照组小鼠在指定时间点注射类似浓度的大鼠Ig。
小鼠BM嵌合体
从hDPP4、B6、B6- ly5.1和股骨和胫骨中提取BM细胞IFNAR- / -用70 μm尼龙过滤器过滤小鼠(均为6 ~ 7周龄),氯化铵钾(ACK)缓冲液裂解红细胞。分离的BM细胞(1 × 107细胞)过养转移到致命照射(10 Gy)的hDPP4, B6-Ly5.1或IFNAR中−−/老鼠。嵌合小鼠维持在含有抗生素的水中4周,以防止机会性感染。骨髓转移后5周,通过流式细胞仪(FACS)分析细胞重构。移植骨髓6周后,小鼠感染MERS-CoV (500 PFU),并监测体重减轻和存活情况。我们在这些实验中使用了500 PFU,因为BM嵌合小鼠在感染200至250 PFU的MERS-CoV-MA时对疾病的发展具有相对抵抗力。在2和6 dpi时用TRIzol收集肺,以测定病毒RNA水平以及细胞因子和趋化因子的mRNA水平。
肺和骨髓细胞RNA的制备及趋化因子的定量PCR估计
使用TRIzol (Invitrogen, Thermo Fisher Scientific)在感染后不同时间点从肺部提取总肺RNA,用RQ1 RNAse Free DNAse (Promega)在37℃下处理10至15分钟,以去除gDNA污染。利用M-MLV逆转录酶(Invitrogen, Thermo Fisher Scientific)合成cDNA,将每个样品归一化至HPRT后测定mRNA水平。用于定量PCR (qPCR)的特异性引物组先前已描述(70- - - - - -72).用于检测MERS-CoV ORF1a gRNA水平的引物序列如下:正向5 ' - ccactactcccatttcgttag -3 '和反向5 ' -CAGTATGTGTAGTGCGCATATAAGCA-3 '。
肺样本RNA-Seq和基因表达谱分析
使用TRIzol在指定时间点p.i.从肺部提取总肺RNA,用RQ1 RNAse-Free DNAse在37°C下处理10至15分钟,以去除基因组DNA污染。RNA-Seq分析在明尼苏达大学基因组学中心进行。
样品质量评估。RNA分离物采用荧光RiboGreen法定量。使用毛细管电泳(如Agilent BioAnalyzer 2100)评估总RNA完整性,生成RNA完整性编号(RIN)。对于通过质量控制步骤的样品,样品RNA定量需要高于500ng, RIN大于等于8,然后才能转换为Illumina测序文库。
图书馆的创建。使用Illumina的TruSeq链mRNA样品制备试剂盒(目录RS-122-2103)将总RNA样本转化为Illumina测序文库。看到https://www.illumina.com/有关工具包内容和方法的详细列表)。综上所述,500ng总RNA用oligo-dT包被磁珠纯化,裂解后反转录为cDNA。cDNA被腺苷化,连接到双索引(条形码)适配器,并使用15循环PCR扩增。最终的文库大小分布使用毛细管电泳进行验证,并使用荧光法(PicoGreen)进行量化。然后使用Pippin HT仪器对索引库进行标准化和池化,并将其大小选择为320 bp±5%。
聚类生成和测序。TruSeq库(Illumina)与NextSeq杂交(单读;Illumina公司)。聚类发生在船上,结合的文库分子被克隆扩增,并使用Illumina的合成(SBS)化学测序进行测序。NextSeq使用双色化学对星团进行成像。在完成读1之后,对于单索引库执行7-bp的索引读。如果在库准备过程中使用双索引,则执行2个单独的8或10 bp索引读取。最后,按相反方向重新合成聚类库片段,从而生成成对端读2的模板。
初级分析和多路复用。使用Illumina Real Time Analysis (RTA)软件生成每个测序周期的基调用(.bcl)文件。基本调用文件和运行文件夹被流式传输到明尼苏达州超级计算研究所维护的服务器上。使用Illumina公司2.20版bcl2fastq软件进行初步分析和多路复用。bcl2fastq工作流的最终结果是释放的多路复用FASTQ文件。
RNA-Seq数据分析。7-bp FastQ单端读取(n=每个样本1170万)使用Trimmomatic(0.33版本)启用可选的“-q”选项进行修剪;3 '端3-bp滑动窗修剪最少需要Q30。使用Babraham Bioinformatics FastQC(0.11.7版本)对每个样品的原始序列数据进行质量控制检查。以小鼠UCSC基因组(mm10)为参考,使用HISAT2(版本2.1.0)进行读作图。通过Subread (feature Counts, version 1.4.6)对原始读计数进行基因量化。使用原始读计数在CLCGWB中用edgeR(负二项)特征鉴定差异表达基因,版本10.1.2 (QIAGEN)。我们根据最小1.5倍的绝对折叠变化和fdr校正对生成的列表进行了过滤P小于0.001的值。完整的RNA-Seq数据保存在NCBI的基因表达综合(GEO)数据库(GSE131936;https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE131936).
统计数据
数据分析使用双尾学生t测试。一个P小于0.05被认为是显著的。使用log-rank (Mantel-Cox)检验计算生存研究的统计学意义,置信区间为95%。图中结果以均数±标准差表示。
研究批准
所有动物实验均由爱荷华大学IACUC批准(协议号6081822)。
RC和SP设计了研究。RC, ARF, JZ和CWL进行了实验并获得了数据。RC、JEA、RS、PBM、DKM、SP分析数据。MM提供试剂。RC和SP撰写了手稿。
我们感谢Josalyn Cho对这份手稿的仔细审阅。我们感谢Michael Gale Jr.(华盛顿大学),Westley Reeves和Shizuo Akira提供小牛- / -和TLR7- / -老鼠。这项工作得到了美国国立卫生研究院的部分资助(PO1AI060699和RO1AI129269,给SP, R21AG060222,给RC)。
ARF现在的地址是:美国堪萨斯州劳伦斯市堪萨斯大学分子生物科学系。
利益冲突:作者宣称不存在利益冲突。
版权:©2019,美国临床研究学会。
参考信息:J临床投资.2019, 129 (9): 3625 - 3639. - https: / / doi.org/10.1172/JCI126363。