肠道微生物群失调和细菌社区组装与胆结石大规模的研究

吴道¹,
中国10张²,
刘本¹,
Dezhi侯¹,
运梁¹,
杰张³&
…
彭老²

BMC基因组学体积14文章编号:669年(2013年)引用这篇文章

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文摘

背景

阐明肠道微生物群胆石患者以及复杂的细菌殖民化胆结石可能有助于预测和随后降低胆石病的风险。为此,我们研究了肠道的细菌群落组成,胆汁,并从29胆石患者胆结石以及38个正常个体的肠道,检查和分析大约299,217个细菌16 s rRNA从120年样本基因序列。

结果

首先,与正常的人相比,在胆石患者有显著(P< 0.001)增加肠道细菌门变形菌门和减少三个肠道细菌属、Faecalibacterium,毛螺菌属,Roseburia。第二,大约70%的肠道细菌操作分类单元(辣子鸡)胆石患者检测在胆道的胆道和细菌多样性显著(P< 0.001)高于直觉。第三,分析胆道核心微生物胆石患者(106年由细菌辣子鸡)显示,33.96%(36/106)的成分可以匹配已知细菌物种基因组已公开的(15)。的全基因组搜索耐多药,BSH,bG,phL与胆结石的形成有关的基因purpotedly显示所有与已知的基因(例如,15种丙酸菌属曼秀雷敦,拟杆菌通行的,假单胞菌putida)包含至少包含四个基因之一。这一发现可能提供基本的信息需要解释胆道微生物群之间的联系和胆结石的形成。

结论

我们所知,这是第一个研究发现肠道微生物群失调在胆石患者,这可能是一个关键因素的存在复杂的细菌社区组装与胆结石的出现。同样,这项研究还提供了第一次大规模的胆道微生物群可能与胆结石。这样一个描述的胆道核心微生物具有潜在的重要的生物和医学意义有关的细菌形成胆结石的作用。

背景

成年人发病率介于10 - 15%在欧洲和美国,胆结石是最常见的胃肠道疾病在西方需要住院治疗(1]。迄今为止大多数文献指出,不正常的代谢和分泌的胆固醇和胆汁酸作为主要的病理生理缺陷在胆结石的形成2,3),而有趣的是,肠道微生物群使胆汁酸代谢的调节通过减少胆汁酸池大小和组成(4]。这个角色表明肠道微生物群可能至少部分与胆结石的形成(5]。同样,肠道微生物群成员在胆管结石的存在6,7)可以在胆道梗阻的肠道通透性增加(8),然后可能导致增加炎症反应和形成结石5]。这样一个协会不是逻辑——最近的研究继续显示human-associated微生物群落与多种疾病,如肝硬化的肝性脑病,非酒精性脂肪肝、肥胖、2型糖尿病、和克罗恩病(CD) [9- - - - - -13]。然而,对肠道微生物群是否失调与胆石病或可能相关的复杂细菌殖民化与胆石的形成。因此,一个更好的理解在肠道中的细菌群落和胆道的胆石患者在发展中是至关重要的一个更加清晰的认识疾病和体内的微生物区系社区之间的联系,然后发展战略,促进消化系统的健康。

细菌可能是胆结石的发病机制的主要因素在起作用。MAKI [14)首次提出,细菌感染可能会扮演一个关键的角色在色素胆结石的发病机理,并从那时起,研究继续突出细菌感染的协会与胆结石的形成,(1,15- - - - - -23],特别是胆固醇结石,占近80%的病例在美国胆结石。虽然争论还在持续对细菌的作用胆固醇胆石的发病机理24,25),彻底否认的存在细菌(例如,铜绿假单胞菌,Entercoccus spp。,大肠杆菌,幽门螺旋杆菌)在胆结石是不正确的21- - - - - -23),特别是从胆结石活的细菌可以被培养20.]。

越来越多的分子研究继续表明,在某种程度上,一个潜在的协会之间存在细菌感染和胆石的形成。例如,多药耐药性(MDR)射流泵蛋白表达的细菌可以产生胆汁阻力,使细菌生存在特定生态位与胆汁盐(26- - - - - -30.]。迄今为止,已知有五个家庭耐多药外排泵蛋白:ABC super-family, MFS,伴侣,,和多的家庭(26]。其中,细菌空肠弯曲杆菌射流泵CmeABC可以赋予耐胆汁(31日,32]。其他潜在的细菌与胆结石的形成相关的因素也被确认,等β葡萄糖醛酸酶(bG)、磷脂酶(phL)和胆酸水解酶(BSH) [33,34]。

越来越多的证据可能暗示的作用在胆结石的形成细菌的作用。例如,肝肠幽门螺杆菌可以促进体内胆固醇胆结石的形成(15]。Urease-positive幽门螺杆菌spp体外可以沉淀钙盐(35]。Monoinfection与ureasepositive幽门或与至少一个urease-positive合并感染幽门螺杆菌有必要引起胆结石(15,35]。有趣的是,老鼠细菌合并感染几个发达胆固醇胆结石患病率为80%,高于单一细菌感染的患病率在40%以下(15]。这些发现表明,细菌社区大会可能比单一物种更重要胆结石的形成。因此,为了更好地理解细菌在胆结石发病机理中的作用,大规模的微生物组成和多样性与胆结石的发现是至关重要的第一步。

先前的研究产生了一点关于gallstone-associated微生物群,由于主要栽培的不敏感18,36)和序列分析的相对缺乏基于分子指纹图的基因片段测序方法(37)和克隆微生物small-subunit核糖体RNA基因[16 s核糖体DNA (rDNA)] [17,19,22]。这些缺点的不幸的结果是,尽管许多领域的实质性进展,我们仍然缺乏一个集成视图的组成、结构和起源gallstone-associated细菌社区。最新进展的技术(例如,基于文化无关的具有成本效益的方法454焦磷酸测序的细菌基因16 s rRNA)用于识别和分析组件的微生物大大改善我们的理解与人类疾病相关的微生物群落(38]。在这项研究中,使用454 -编码-焦磷酸测序,我们展开了一次大规模的分子序列分析16 s rDNA为了获得一个清晰的四个关键问题:1)肠道微生物群与胆石病的障碍;2)胆道微生物群落的结构和组件在胆结石患者;3)在肠道细菌群落之间的关系和胆道;4)胆道核心微生物的特点及其潜在连接胆结石的形成。

结果

样本和数据收集

总的来说,我们收集样本29胆囊结石患者(以下称为病人)和38健康受试者(以下称为主题)(见方法)的详细信息。29 gallbladder-stone病人我们得到样品的胆汁,胆结石和粪便:26胆汁样品,27个胆结石(2 50%胆固醇含量,24 70 - 90%,和1 / 95%),和29粪便样本。根据胆固醇结石的定义与50 - 90%胆固醇的主要组成内容推荐Marschall et al。39),所有收集的27个胆结石正确归类为胆结石。更严格,然而,使用70%胆固醇含量提出截止Swidsinski et al。25)和Portincasa et al。1),92.59%的抽样胆结石是胆结石。我们进一步收集38正常人类粪便样本(27个样本收集的数据在我们的一个最近的研究(13]),总共产生120个样本,用于我们的分子分析细菌16 s rRNA的基因。

为每个示例中,变量地区(v2 v1)的细菌16 s rRNA (rRNA)基因放大vi使用一套引物聚合酶链反应(PCR)和一个独特的十条形码。从所有的胆汁,石头和粪便样本,我们获得一个数据集组成的299、217高质量16 s rRNA基因序列平均2493±127 (S.E.) (n = 120)每个样本(表序列1)。从数据集,我们发现了一个4637操作分类单元(辣子鸡)基于传统标准97%的序列相似性(等于物种水平),与3696年胆汁辣子鸡,3456年胆结石辣子鸡(我们发现细菌无论胆固醇含量在所有胆结石),1772年病人的粪便,辣子鸡和1497年正常的粪便,辣子鸡40),平均321±29(良好的覆盖的41):92.8±0.6%)/ (n = 120)(表样例1)。微生物组成的分类汇总所有样品(附加文件1:图S1)产生了总共20种不同的细菌类群在所有样本,与20在胆结石,19日在胆汁,13日在病人粪便,14日在正常粪便,最主要的是胆汁的门壁厚菌门,胆石和粪便。

表1454年的数据总结

全尺寸表

比较之间的宏基因组分析和肠道和胆道内

比较宏基因组分析发现了一个更高的差异(P微生物多样性的< 0.001)胆道与肠道(丰富的辣子鸡和单件以及由香农均匀度指数,Chao1,和PD-whole树),虽然不是胆道内(胆汁与胆石)(表1)。这种程度的微生物群落多样性中发现胆道的胆石患者是史无前例的在我们当前的知识健康的人体,因为只有人类的皮肤上也有更多样的微生物群落(42]。

在门级(图1),我们发现之间没有显著差异,在肠道和胆道内最主要的门壁厚菌门或罕见的门Fusobacteria。相反,当与肠道相比,我们发现显著(P< 0.001)水平降低细菌门拟杆菌门的胆道。我们进一步观察到显著(P< 0.001)增加胆道的六个细菌类群,包括变形菌门、TM7, Tenericutes,放线菌,Thermi,和蓝藻。肠道内细菌门的相对丰度在患者显著变形菌门(P< 0.001)高于正常。在胆道中,我们观察到没有区别的细菌类群之间的胆汁和胆结石。在属级(图2),7个菌属之间没有显著差异,在肠道和胆道内。与肠道属成分相比,在胆道,显著(P< 0.001)减少2细菌属伴随着增加16其他肠道内细菌属、3细菌属的相对丰度(Faecalibacterium,毛螺菌属,Roseburia)明显(P< 0.001)低病人与健康受试者相比。

我们的研究结果还发现,120个样本可分为三个不同的集群(a - c)(图3)。肠道微生物群主要在集群,胆道内微生物群集群C和肠道之间的交叉(尤其是患者)和胆道内集群b也发现了类似的模式通过PLS-DA情节(附加文件2:图S2)和加权和未加权的UniFrac PCoA情节(附加文件3基于微生物群分析:图S3)。我们进一步发现,85%以上的细菌辣子鸡共享胆汁和胆结石(图4),但只有60%的肠道细菌辣子鸡被患者和健康者共享。大约70%的患者的肠道细菌辣子鸡和40%辣子鸡从健康受试者在胆道中找到。

胆石患者的胆道核心微生物的特点

我们发现了一个核心微生物组胆汁和胆结石通过使用一个通用规则(43包括细菌的OTU(物种)如果是共享至少一半的样品在给定组(即。病人胆汁或胆结石)。208年胆汁核心微生物包括细菌辣子鸡,179年的胆石核心微生物包括细菌辣子鸡。基于这些数据,我们发现了一个胆道核心微生物胆石患者,其中包括106个细菌辣子鸡属于6细菌类群。结果使用QIIME管道发现33.96%(36/106)的组成成员的胆道核心微生物可以匹配已知的细菌种类(图5),根据至少97%的身份(附加文件4:表S1)。

虽然我们前面提到的分析的结果是有趣的,进一步的功能特性描述胆道微生物通过文化的方法被证明是非常困难的。为了克服这一缺陷,我们发现相对线索通过搜索功能基因的内容相似的物种的基因组测序。先前的报道已经证实本研究的可行性[44]。时分析结果(图5)还显示,15 36-matched细菌物种有公开的基因组。基于参考基因组的15细菌物种,我们寻找四个基因的存在与否可能与胆结石的形成:耐多药,BSH,bG,phL。结果(附加文件5:表S2)发现15种,其中包含至少包含四个基因之一,20%的所有四个基因,其中有三个40%,40%有两个。的耐多药基因在所有15个物种最丰富(完全确定基因数量从16岁到59岁),而BSH基因被发现在5种(33%)(从1到3),bG基因7种最24名(47%)拟杆菌通行的与1 - 3),其他的,phL13个物种基因(87%)(从1到5)。

讨论

这项研究的结果,运用有针对性的扩增子测序方法,演示了一个潜在的肠道微生物群失调表现为胆石病,胆道微生物群有可能促进胆结石的形成,特别是胆结石。本研究首次使用一个基于454 -焦磷酸测序的细菌16 s rDNAs澄清胆道和肠道微生物群的构成与胆石病。而方差分析等方法,通过热图层次聚类,和UniFrac-based PCoA分析可以识别不同的微生物组成和多样性之间和肠道和胆道内文化无关454焦磷酸测序的16 s rRNA基因提供了前所未有的洞察力gallstone-associated微生物群。两个我们的最近的研究证明之间的关联肠道微生物群失调和人类疾病,例如,结直肠癌(45肝性脑病(最小的)和肝硬化13),验证本研究中使用的相关方法。

我们的结果发现重大的改变肠道微生物组成胆石患者和健康者之间。病人的肠道内,存在细菌的过度繁殖门变形菌门通常包括各种各样的病原体等埃希氏杆菌属,沙门氏菌,弧菌,幽门螺杆菌。这些病原体不同已经与许多胃肠道疾病(GIT)。一个经典案例是,一个主要致病大肠杆菌O104: H4爆发发生在2011年春末中欧(46]。此外,三种肠道细菌属-Faecalibacterium,毛螺菌属,Roseburia -在胆石患者显著降低。的减少f . prausnitzii一直在CD患者肠道失调密切相关(47),但f . prausnitzii在特定的低聚糖后显著增加(例如,inulin-oligofructose)消费(48]。与此同时,肠道细菌r . inulinivorans菊粉和淀粉消费者(49),而毛螺菌属果胶降能器(50]。前面的实验研究表明,通过低聚糖的消费,r . inulinivorans和毛螺菌属可能会选择性地刺激增长的潜在有益的肠道细菌如f . prausnitzii。同现的那三个肠道细菌可能潜在的胆石患者对肠道健康的影响,但这些影响可能不是目前已知。最终,共病的肠道微生物群失调在这项研究表明不可预知的GIT胆石患者健康风险在很大程度上仍未知。

这项研究支持越来越多的证据表明,基于文化无关454 - 16 s rDNA测序gallstone-associated细菌感染的诊断工具是必要的,因为它提供了更详细的信息比种植或其他分子指纹图的方法目前使用(37]克隆和序列分析微生物16 s rDNA [17,19,21]。我们的结果同样证明了不到5%的已报告3456细菌在胆结石辣子鸡发现在以往的研究14,15,17- - - - - -19,21- - - - - -23,25,51- - - - - -59]。保守,只有34%(36)106核心细菌辣子鸡胆石患者的胆道已知日期等大肠杆菌(60]。令人惊讶的是,大约70%的肠道细菌辣子鸡从胆石患者胆道的检测。这就提出了一个可能性,胆道微生物群可能起源于肠道。进一步的证据显然是需要探索这种可能性,但它是一个有趣的前景。

有趣的是,成员Lactococcus,通常用作益生菌在人体胃肠道,(61年]在胆道丰富的患者胆石病(图2)。但是,与胆汁盐水解的活动乳酸杆菌(62年),底层的生理作用Lactococcus在胆石病仍不清楚。这样的未知数是加剧了胆道微生物群的重要inter-subject变化也观察到(附加文件6:图S4)。例如,丰度最高的厚壁菌门门在一个胆石患者为93.30%,最低为1.17%;类似的结果也出现在胆汁最高的55.10%和最低的0.08%。高叫人胆道细菌的差异可能与许多factors-host饮食,生活方式,基因型、疾病状态,等等。

除了人际关系变化,有一些潜在的因素,可能影响殖民或胆道的胆石患者的细菌的生存。首先,耐多药外排泵蛋白表达的细菌可以产生胆汁抗性,使细菌生存在他们的生态位26- - - - - -30.[],以及BSH活动62年,63年)产生的细菌,能保护细菌细胞产生毒性的共轭胆汁盐。丰富我们的研究结果发现耐多药和胆汁呼吸道微生物BSH基因,部分支持上面的推理。第二,活检是从健康人的胆管是免费的细菌或细菌是非常罕见的。尽管没有一个明确的解释基于我们现有的知识,有可能失去宿主抵抗微生物殖民胆道可能导致胆道微生物群的存在。第三,胆结石的形成中起着重要作用胆囊殖民和携带特定细菌物种,如沙门氏菌物种(64年),这意味着胆结石本身可能会加剧胆道细菌的生长。

殖民的胆道通过改变细菌可能导致胆汁胆固醇—过饱和,这是一个风险因素的胆固醇结石的形成。根据三元平衡“胆汁salt-phospholipid-cholesterol”三元相图65年- - - - - -68年),胆固醇是媒体仅微溶于水,但溶于胆汁通过混合胶束由胆汁盐和磷脂,主要是磷脂酰胆碱的浓度确定胆固醇饱和的程度。研究进一步表明,两个细菌因素bG和PhL基因促进胆石形成(34]。最丰富的成员PhL基因在胆汁中,磷脂酶(2),可以通过水解胆结石形成引起胆汁磷脂为溶血卵磷脂和游离脂肪酸(69年]。本研究的结果表明,这两个bG和PhL基因丰富胆石患者的胆道微生物(附加文件5:表S2),这部分表明增加胆结石的风险,可能是一个潜在的后果人类胆道细菌殖民化。这还需要进一步的研究来验证这一点,其他的一些有启发性的结论,但是,尽管我们的一些结果的初步性质,本研究最突出的一个含义是细菌感染的预防和管理胆道可能降低胆结石的风险的目标。

结论

我们所知,这是第一个研究发现一个潜在的协会的肠道微生物群失调存在胆石患者。同样,我们描述的胆道核心微生物提供了意想不到的潜在重大的生物影响对胆结石患者中微生物的多样性,以及细菌的可能角色胆结石的形成。进一步研究胆汁呼吸道微生物的功能可能会补我们的发现胆道微生物和澄清的一些含义源自我们的结论。最终,这些发现有大量的医学对预防和治疗胆石病或其他相对GIT健康风险,需要进一步后续研究来验证这些发现和前进。

方法

研究对象和样本收集

本研究的所有协议和程序符合伦理指南中概述1975年赫尔辛基宣言》所反映的先天的昆明医科大学第一附属医院的批准。之前包含在这项研究中,所有的参与者提供书面知情同意。

胆结石患者被诊断出患有cholecystolithiasis通过b型超声。总共29明确患者从昆明,中国在这项研究中使用(49.2±14.3)(SD)平均年龄(23.7±3.2)身体质量指数(BMI)、和(13:16)男女比率,所有患者出现慢性胆囊炎。没有病人表示他们遭受任何胃肠道疾病除了胆囊结石,也没有了抗生素或益生菌在前三个月在此之前的研究。在打开胆囊切除术或腹腔镜胆囊切除术,一块石头被无菌从每个病人的胆囊。同时,从每个病人胆囊胆汁提取使用2毫升无菌针油管。同样,操作前,所有病人粪便也收集。所有的样品都放在cryovials没有防腐剂,立即在液氮快速冻结,并存储在−70°C,然后在干冰运输昆明动物研究所,中国科学院进行测序分析。所有样本存储在他们的原始管−80°C,直到进一步的处理。

发现是否存在任何重大改变肠道微生物在胆石病慢性胆囊炎患者,作为一个正常的肠道控制我们使用38普通中国个人(数据来自27个这些来自我们的最近的研究(13从昆明]),中国(40.7±14.5)(SD)平均年龄(21.9±2.4)身体质量指数(BMI),和男性/女性的比例(7:12)他们永久居住在昆明。所有健康的人自愿接受免费常规健康检查在昆明医科大学第一附属医院。健康志愿者的健康状况自我报告。没有志愿者表示,他们遭受了胃肠道的任何疾病或任何其他代谢性疾病,如肥胖、糖尿病和心血管疾病。没有接受手术了几年前。没有了抗生素或益生菌在粪便样本集合的前三个月。粪便样本所有正常个体收集并存储在他们的原始管−80°C,直到进一步的处理。

样品制备、分子方法和生物信息学

一个石头(≥1.0厘米直径)从每个病人quadrisected新鲜无菌,一次性钢刃。室内石材然后放松以全新的手术刀片。DNA提取的内半胆结石,与叶片之间的改变被刮削下的碎屑。惰性材料(如套管和棉签)期间收集的外科手术处理相同,并受聚合酶链反应(PCR)检测样品存储和处理过程中可能的污染。

预处理后的石头,一个整除(胆石和粪便,180 - 220毫克;胆汁,200μl)每个样本的暂停而冻结在一个解决方案包含200μl缓冲ATL(细菌细胞裂解试剂盒包缓冲区)和200μl 0.1毫米直径的浆氧化锆/硅珠(BioSpec产品,巴特尔斯维尔)。混合样本然后由机械细胞溶解破坏与珠搅拌器(BioSpec产品)为2分钟20°C),其次是提取与QIAamp DNA凳子迷你包(试剂盒)使用的协议隔离病原体检测的DNA。裂解温度增加到95°C细胞很难溶解。DNA从每个样本筛选了200年最后一卷μl洗脱缓冲和存储在- 20°C。管只包含QIAamp DNA凳子迷你工具提取控制包括整个裂解和PCR作为消极的控制步骤。

16 s rRNA基因的扩增子v2 v1地区454基因组测序音序器FLX钛平台,根据先前的研究[45]。测序读是质量过滤、OTU集群、ChimeraSlayer过滤,进一步分析使用QIIME管道[45,70年],RDP-classifier [71年),加权和未加权的UniFrac PCoA分析(72年]。所有辣子鸡发现至少在两个样本保留执行以下进一步的分析。基于层次聚类和PLS-DA策划样本使用METAGENassist微生物群进行分析,比较宏基因组的全面的web服务器(73年]。

统计方法

统计分析了使用SigmaPlot 12.0 (Systat软件有限公司)和R软件包。一般特征表示为中值和平均或百分比。多个样本比较进行使用单向方差分析(参数)或克鲁斯卡尔-沃利斯单向方差分析(非参数)。统计学意义是P< 0.05。

定量胆结石的胆固醇

一夜之间,代表胆石部分被称重和提取5毫升氯仿/甲醇(2:1)。计算每个石头的重量百分比胆固醇,胆固醇是量化使用酶CHOD-PAP方法(74年]NanoDrop 2000分光光度计(热费希尔科学)根据制造商的协议。

支持数据部分的可用性

本研究中使用的所有原始454序列数据存入NCBI序列读取存档(SRA)(加入SRA096351) (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra)。

缩写

bG:: β葡萄糖醛酸酶
BSH:: 胆酸水解酶
CD:: 克罗恩氏病
GIT:: 胃肠道
耐多药:: 多药耐药性射流泵蛋白
辣子鸡:: 操作的分类单位
phL:: 磷脂酶
核糖体rna:: 核糖体RNA。

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确认

作者要感谢昆明生物多样性区域中心的大型仪器设备,中国科学院昆明动物研究所,为他们高超的技术援助以及安德鲁Willden(中国科学院昆明动物研究所,中国科学院)援助的手稿。这项研究受到了来自云南省自然科学基金资助(批准号2010 cd147 TW和批准号2011 fa035 PS)和来自中国的国家自然科学基金(国家自然科学基金委)(批准号31100916 ZZ)和中国科学院昆明动物研究所的年轻人才项目、中国科学院(批准号Y106541131 ZZ)和“一百人才计划”从中国科学院到PS。