鉴定人肠粘膜对乳杆菌WCFS1在活的有机体内

背景

关于人类肠腔中共生菌和益生菌的黏膜反应的程度和动态的知识有限。本研究旨在确定肠道黏膜对共生菌的急性、时间依赖性反应乳杆菌WCFS1在活的有机体内在两项对健康志愿者的安慰剂对照人类干预研究中持续十二指肠内输注l .杆菌采用专用口胃导管经口胃插管和鼻胃插管，并采用标准柔性胃十二指肠镜进行组织取样，分别观察WCFS1 1 h和6 h。

结果

小肠粘膜暴露1 - 6小时l .杆菌WCFS1分别诱导669和424个报告基因的差异表达。而短期暴露于l .杆菌WCFS1抑制脂肪酸代谢和细胞周期的进展，在长时间暴露后，细胞转入一个更增殖的阶段，整体表达谱的特征是参与脂质代谢、细胞生长和发育的基因上调。细胞死亡和免疫反应被触发，但细胞死亡执行基因或炎症信号未表达。蛋白质组学分析显示几种蛋白表达差异。在所有受试者中，只有微粒体蛋白“微粒体甘油三酯转移蛋白”在转录和蛋白水平上都受到调控。

结论

总的来说，这项研究表明肠道暴露于l .杆菌WCFS1在健康肠道黏膜中诱导一致的、时间依赖性的转录反应。这是对人类反应的广泛探索l .杆菌WCFS1最终可以为这种菌株或物种的特异性或益生菌活性提供分子支持，并证明了识别人类肠道微生物潜在生物活性的应用技术的力量。

许多乳酸菌(LAB)在保存食物配料方面有着悠久的历史[1］．除了它们的防腐效果(主要是基于它们将原料中的有效碳源转化为乳酸和醋酸的有效性)之外，lab -发酵还产生了许多其他相关的产品特性，如质地、风味和稳定性。各种拉拉品种，作为食物补充，在肠道发挥有益的生物活性[2，3.］．

对人类宿主和具有促进健康作用的微生物之间相互作用的研究大多局限于对微生物对胃肠道或全身症状评分的影响的评估。几项研究描述了膳食中添加各种LAB的有益效果，包括该物种的特定菌株乳杆菌有关肠易激综合症(IBS)病人的症状[4]，在炎症性肠病(IBD)患者中[5]，以及对应激条件下肠屏障功能的影响[6］．关于人对LAB的粘膜反应的详细的描述性研究很少。DiCaro等人研究了喂食GG对食管炎患者小肠黏膜转录应答的影响[7]，在有限数量(n = 3)患有基础疾病的受试者中，提供了关于益生菌补充方案对益生菌对人体黏膜反应的影响的大量信息。

本研究旨在确定健康肠黏膜对暴露于l .杆菌WCFS1，从NCIMB8826(国家工业和海洋细菌收集，阿伯丁，英国)中分离出的单个菌落。该菌株最初从人类唾液中分离出来，并被用作宿主-微生物相互作用研究的模式微生物，由于其已建立的分类学，其在胃肠道(GI)转运中存活的能力[8]及其作为益生菌物种的假定作用[9］．全基因组序列的可用性l .杆菌WCFS1 [10极大地促进了研究它对哺乳动物胃肠道中所遇到条件的反应。

在本研究中，我们应用了最近开发的在活的有机体内肠灌注技术[11]以评估肠黏膜在短时间(1小时)和长时间(6小时)暴露于l .杆菌健康受试者的WCFS1。这些研究集中在近端小肠，因为在健康的人，只有少量的微生物居住在这个肠道区域，而它遇到和感知大量的食物来源的微生物。事实上，只有少量的微生物居住在特定的生态位，使确定的影响l .杆菌WCFS1暴露在没有其他粘膜-微生物相互作用干扰的情况下，就像在远端小肠或结肠的情况一样，那里有大量的微生物群落。这篇稿子描述了，第一次在健康的受试者，肠粘膜对腔内微生物的反应。基因表达分析的生物学解释显示，特别是与脂质代谢、细胞增殖、细胞死亡和存活以及免疫反应相关的基因受到调控。微生物对参与这些过程的基因转录的影响被提出和详细讨论。

这里所分析和呈现的粘膜反应代表上皮细胞相互作用的急性反应l .杆菌细胞及其分泌产物，以及来自固有层中不相互作用的相邻上皮细胞(不直接暴露于管腔内容物)的细胞及其分泌产物，以及其他类型的细胞，如免疫细胞。

研究1

我们观察到669个基因报告基因发生了显著变化;225个基因上调，444个基因报告基因下调(见附加文件)1)．这些差异表达基因的折叠变化范围为0.56 ~ 1.33。0.56的翻倍变化意味着56%的基因表达在安慰剂干预后仍然存在l .杆菌WCFS1干预，而1.33倍的变化意味着该基因的表达增加了33%，由于l .杆菌WCFS1曝光。

通过路径分析软件套件GenMapp首次确定了转录谱改变的生物学意义。表格1显示了基于基因本体数据库的24条z值为> 3的通路，并且有3个或更多的基因报告基因被差异表达。在这些过程中，蛋白质的生物合成和代谢过程、核糖体相关过程、蛋白酶活性过程和脂肪酸氧化过程似乎是最重要的调节生物过程

研究2

6小时的l .杆菌Challenge显著调节了424个报告基因的表达;383例上调，41例下调(见附加文件)2)．这些差异表达基因的折叠变化范围为0.70 ~ 1.78。Genmapp通路分析显示，基于标准设置为z评分为> 5的基因本体数据库，以及3个或更多基因报告基因的差异表达，干预介导了22条通路(表5)2)．与MHC I类和II类相关的过程以及其他免疫反应和抗原处理相关的过程，以及与能量代谢相关的几个过程(主要是脂肪酸-氧化、三羧酸循环和电子传递链)都受到干预的调节。

对研究2中获得的组织样本的蛋白质组学分析表明，所有志愿者在6小时暴露于l .杆菌(数据没有显示)。其中一个斑点被鉴定为微粒体甘油三酯转移蛋白(MTP)，而分析未能识别第二个斑点。微阵列结果表明，在Affymetrix U113A微阵列上，编码MTP的基因(proset 205675_at, UniGene参考文献Hs.195799)的表达量增加了19.3%l .杆菌．矛盾的是，同一基因在1小时内下调了36.8%l .杆菌干预研究，但这一差异未达到统计学意义。研究1中的组织样本没有进行蛋白质组学分析。

研究1与研究2的比较分析

54个基因在灌注1小时和6小时的微阵列数据集中被调控。其中4个基因在两项研究中向同一方向差异表达(3个基因上调1个基因下调)，2个基因上调下调，48个基因在研究1和研究2中分别下调上调。下面，使用匠心路径分析(IPA)软件工具(参见URL的可用性和需求部分)对两个研究的结果进行了详细的比较。IPA输出的代谢和信号通路代表性的统计学评估基于右尾Fisher确切检验。该测试计算基因参与给定路径的概率，相对于它们在ingenious覆盖的所有其他路径注释中的出现。

脂类生物合成和脂肪酸代谢

暴露1小时后l .杆菌，三个参与脂质和脂肪酸代谢的基因(ACSL5;CD36抗原,DEGS1)被下调(图1)．暴露6小时后，转录调控因子JUND，GTF2I而且TSC22-D1，这与防止氧化应激和脂质/脂肪酸代谢有关，GPX4这种蛋白质与防止氧化应激有关，氧化应激是一种脂肪酸结合蛋白FABP1，血栓反应蛋白受体(或脂肪酸转位酶)CD366个酰基辅酶a基因和异柠檬酸脱氢酶- 1（IDH1)，这是一个更“中心”的枢纽蛋白都上调了。然而，重要的中央调控蛋白，如肥胖基因瘦素或PPAR -γ暴露6小时后无差异表达(图2)．

介导细胞增殖的主要转录因子和蛋白质

暴露1小时后l .杆菌WCFS1，四个主要的转录调控因子都被发现下调:致癌基因产物MYC（原癌基因)，”丛书（c-Fos)，小君（c-Jun)和NF-κB转录复合体的p65亚基，RELA．从这些反应来看，调节细胞代谢和增殖的基因下调似乎是对第一次感知的中央黏膜反应l .杆菌．暴露6小时后，这些调控因子均无差异表达。

细胞死亡和死亡诱导因素

在这两项研究中，一些编码蛋白质的基因参与了细胞死亡的调节和调节。肿瘤坏死因子受体(TNFRs)TNFRS1A它是TNF-α的主要受体，是细胞凋亡的中介因子和炎症的调节因子TNFRSF4在输注l .杆菌，而TNF受体TNFRSF25（DR3)在暴露于l .杆菌WCFS1。tnf相关蛋白的表达TNFAIP1（B12)，是一种位于细胞膜上的离子通道，是肿瘤坏死因子诱导信号传导的直接靶点，转化生长因子(TGF-α)和TNFR诱导剂白介素1 -β也会在暴露于l .杆菌WCFS1。

在细胞免疫反应刺激条件下，转录因子NFκB转位到细胞核促进主要促炎细胞因子的表达。NF-κB的p65 (RelA)成分在暴露1 h后下调。NF-κB功能上游调控因子之一，IKBKG（IKK -κ或尼莫),是调节。IKK磷酸化IκB，从而靶向IκB进行蛋白水解降解，并间接促进NFκB的核易位。TNF受体相关因子4 (TRAF4)对IKK上游NF-κB激活有负调控作用，暴露1 h后NF-κB激活也上调。

与死亡介导途径的整体下调或不调节一致，fas激活丝氨酸/苏氨酸激酶属于细胞外信号直接诱导细胞死亡的一组非tnf蛋白FASTK，在暴露于l .杆菌．

的基因TPT1(或称组胺释放因子)，细胞因子诱导的凋亡抑制因子1 (cIAP-1)，线粒体PUMA (BBC3)，组织蛋白酶B (CTSB)， ATP6V0A1，组织蛋白酶L和LAMP2，所有这些都与细胞死亡相关反应相关，在暴露于l .杆菌WCFS1。我们发现，在急性反应中，那些参与调节细胞死亡的基因在暴露6 h后没有被调节或表达，其他死亡调节基因也没有表达。只有TNFR家族TTRAP， TRAF和TNF受体相关蛋白在暴露6小时后上调l .杆菌．

免疫反应

暴露1小时后l .杆菌，白细胞介素-1 (IL-1)， IL-1受体IL-1R而且il -1样受体IL1RL1 (ST2)表达下调。促炎细胞因子受体IL8R1也被下调了。暴露6 h后未发现这些基因的调控。

暴露1小时后，激活先天免疫反应的几个基因上调(表3.)．其中包括IF，编码补体因子I的基因，这是一种丝氨酸蛋白酶，可以激活先天免疫反应的经典补体通路。第二，CFD (adipsin)也是一种丝氨酸蛋白酶和补体通路的激活剂。C1S是补体途径的第三丝氨酸蛋白酶和激活子，参与g蛋白偶联受体途径的激活，包含钙结合的EGF结构域。C1R是一种类似于C1S的蛋白质，也是补体通路的一部分。所有编码基因在暴露1小时后上调l .杆菌WCFS1。随着C1S的上调，我们观察到其抑制剂SERPINE2的下调。

在1 h暴露研究中，编码补体成分8 γ多肽的C8G基因被下调。C8G是抗菌膜攻击复合体(MAC)的一部分，MAC是一种参与破坏细菌细胞膜的细胞溶解蛋白复合体。细胞表面糖蛋白CD93 (C1QR1)也是补体成分1的一部分，表达下调。与暴露1小时相比，暴露6小时后这些基因都没有受到调控。

部分MHC I类通路在暴露1小时后被发现受到调控。激活蛋白酶体α和β亚基(PSME1/2)是少数上调基因之一。伴侣HSP70在细胞质抗原摄取进入ER前的加工过程中起作用，HSP70下调。尽管没有发现TAP1或TAP2转运蛋白的调控，但TAPBP蛋白介导了两者之间的相互作用新创产生的MHC I类分子和与抗原处理相关的转运蛋白(TAP)上调。暴露1小时后，只有MHC跨膜(TM)受体HLA-DRA被调节。(下调的)基因产物在抗原呈递细胞(APCs)中表达，参与免疫反应、外源抗原呈递和加工。

暴露6小时后l .杆菌WCFS1，肠黏膜表现出不同的免疫应答相关表达谱。一些属于MHC I类和II类的hla型TM受体被上调(表3.)．上调的HLA-A TM受体参与免疫反应，并在与自然杀伤细胞(NK)相互作用时调节细胞毒性。HLA-E基因编码具有免疫调节功能的mhc类蛋白;蛋白的表面定位可以保护表达细胞免受NK细胞介导的裂解。HLA-DMA TM受体是暴露6 h后上调的II类受体之一l .杆菌WCFS1。该受体通过抗原呈递和处理参与免疫反应，并参与检测微生物。暴露6 h后TM受体CD74抗原也上调。该受体参与抗原呈递、免疫应答和体液防御机制，但也促进细胞增殖和负调控凋亡。

Q-PCR用实时定量PCR (real-time quantitative PCR, QPCR)对微阵列数据集进行验证。观察到的10个基因中有8个的上调或下调得到了证实。对GUCA2A和PCNA两个基因的Q-PCR分析未能证实微阵列数据。此外，对MTP基因的QPCR分析也证实了微阵列的结果。

人类在活的有机体内旨在阐明微生物和肠道之间相互作用的研究受到医学和伦理限制的阻碍。以前，主要采用动物模型来研究黏膜对微生物的反应。在无菌小鼠中，共殖菌诱导的基因定植涉及营养吸收、粘膜屏障强化、异种生物代谢、血管生成和出生后肠道成熟[12，以及先天免疫[13］．这些研究清楚地表明，接触共生细菌可以调节肠道生理中许多具有不同功能的基因的表达。目前还不清楚这些发现与人类有何关联在活的有机体内一个由不同微生物组成的复杂群落。共生微生物对人肠道粘膜转录组影响的数据在活的有机体内限制在描述补充l．GG [7的),芽孢杆菌clausii［14]对食管炎患者肠道转录反应的影响。在本研究中，影响l .杆菌研究了WCFS1对人基因转录和通路调控的影响在活的有机体内在健康志愿者中建立模型，使微生物直接进入小肠和肠道组织样本进行转录分析。据我们所知，这是第一个使用后基因组技术来揭示健康人体中特定宿主-微生物相互作用的研究例子。在随后的两项干预研究中，1和6小时连续注射l .杆菌WCFS1进行调查。选择1小时的暴露时间作为“短期”暴露时间，而6小时的暴露时间被认为是长时间的暴露。我们实验室之前的研究表明，在6小时之后，由于长时间的禁食期，问题可能会出现，在此期间受试者保持休息，因此，这被认为是所选实验设置的最大时间框架。

这两项研究显示，胃内摄入维生素d会引起小肠黏膜中数百个基因的调控l .杆菌．暴露近端小肠粘膜1小时至l .杆菌激发了转录反应，至少部分似乎在长时间(6小时)暴露中被修改。在腔内注射的最初几个小时内基因转录的时间变化l .杆菌正如在这篇稿件中所描述的，提供了细胞宿主对腔内非病原微生物的反应的深入概述。观察到的反调节反应对维持正常的肠道内稳态很重要。这被长时间暴露研究中的蛋白质组学分析所证实，在该研究中，只有两种蛋白质被一致地发现存在差异l .杆菌与安慰剂相比。在急性暴露研究中，没有试图调查蛋白质图谱的差异，因为1小时的暴露时间预计太短，不会在蛋白质水平上引起实质性的差异。

脂质和脂肪酸的摄取和代谢参与多种细胞功能，包括膜生物发生，一般代谢和(细菌)信号传递。随着粘膜暴露时间的增加l .杆菌，脂质和脂肪酸摄取和代谢的转录谱也受到影响，反映了脂肪酸和脂质代谢的增加。

灌注1 h后，脂质和脂肪酸代谢或摄取和转运相关基因(ACSL5;CD36抗原和DEGS1)下调，提示粘膜细胞在相互作用过程中没有主动吸收或代谢额外的脂肪酸和脂类l .杆菌与安慰剂治疗的粘膜相比。相比之下，在长时间暴露6小时后，与脂质/脂肪酸代谢和氧化应激保护相关的三种转录调控因子(JUND, GTF21和TSC22-D1)与安慰剂治疗相比上调(图)2)．一种与抗氧化应激有关的重要基因，谷胱甘肽过氧化物酶(GPX4)，也在暴露于氧化应激6小时后上调l .杆菌．

CD36糖蛋白，在细胞粘附和调节脂肪酸运输和摄取中起作用，并通过与氧化低密度脂蛋白结合参与细胞对氧化应激的控制[15]，在暴露1 h后下调，但在暴露6 h后上调l .杆菌．脂肪酸结合蛋白FABP1在6小时暴露研究中被上调，微粒体和er定位的甘油三酯转移蛋白MTP也被上调，下面将更详细地讨论。因此，很明显，长时间的接触l .杆菌诱导脂肪酸摄取相关基因的上调。参与线粒体和过氧化物酶体脂肪酸代谢(如酰基辅酶a基因)或膜鞘脂代谢(ASAH1)的几个基因也被上调(图)2)．

微粒体甘油三酯转移蛋白(MTP)在转录水平和蛋白质水平上受到调控l .杆菌在6小时暴露研究中。MTP参与细胞内脂质运输和分泌，主要在肝脏和肠道组织中表达[16］．最近，MTP也被发现通过调节I型CD1分子参与调节肠道对抗原的免疫反应[17，18]，它们是主要组织相容性复合体(MHC) i类同源物。研究还表明，MTP影响抗原呈递，并能够调节CD1a、CD1b和CD1c的产生，因此支持了MTP在宿主对微生物病原体的反应中很重要的观点。这与本研究中观察到的其他mhc相关反应一致，如下所述。总的来说，MTP对细胞外和细胞内信号的响应可能会影响黏膜对病原体的反应，也可能会影响脂质代谢和血浆脂蛋白水平。MTP抑制剂可用于促进减肥[19]，但它们可能有有害的副作用，例如脂肪堆积在肝脏和小肠。观察到MTP在1小时暴露研究中没有显著下调，而在延长的6小时暴露研究中上调，这为推测最终的生理后果提出了一个具有挑战性的情况。MTP在脂质代谢中的作用，这一过程受到l .杆菌，及其在涉及树突细胞的免疫反应中的作用[18可以在…上提出那个建议l .杆菌暴露时，会触发树突状细胞对微生物的感知，这至少部分是由MTP介导的，并刺激肠黏膜中的脂质代谢相关过程。

急性暴露研究中观察到的刺激细胞增殖的主要转录因子的下调表明细胞增殖在第一次感知后被抑制l .杆菌细胞。细胞周期最初的下调可能是细胞活动转向微生物感知、细胞防御和免疫反应的结果。事实上，在急性(1小时暴露)和后期反应期间，观察到免疫反应途径和细胞死亡、存活和增殖的调节。

转化生长因子-β (TGF-β)是细胞增殖的重要调节因子[20.］．虽然在数据集中没有观察到TGF-β的调控，但TGF-β-早期反应基因TSC22在时间上表现出与暴露时间相关的差异调控，1 h后下调(TSC-22D1， -3)， 6 h后上调(TSC-22-D1)。TSC-22是肠上皮细胞分化过程中TGF-β和PPARγ信号的重要下游成分。TGF-β和PPARγ信号通路对抑制肠上皮细胞过度增殖都很重要[21］．暴露1小时后，急性期增殖下调l .杆菌，增殖抑制基因产物IFITM3的上调似乎进一步增强。一般来说，增殖率主要由两个主要的相互作用的途径决定，即NFκB和丝裂原激活蛋白(MAP)激酶途径。暴露6 h后，mapk1激酶(MAPK3)上调。在细胞环境中，ERK1可能通过下调重要的致癌基因调节剂如c-Fos和拮抗ERK2功能(一种介导增殖信号的相关MAPK)发挥细胞过度增殖的抑制作用[22］．

NFκB是细胞增殖和凋亡的关键调控因子之一[23］．显著的是，处理1 h后l .杆菌，仅发现NFκB的p65亚基下调，而NFκB在暴露6 h后无差异表达。NFκB在细胞增殖中的确切作用尚不清楚，但有研究表明，NFκB通过介导c-Myc的表达，是细胞增殖所必需的[24]，刺激在细胞周期控制中起重要作用的基因的转录，如细胞周期蛋白、CDKs和E2F [25］．

nf - κ b在细胞凋亡调控中发挥重要作用。它通过诱导几种抗凋亡蛋白的表达和调节促凋亡蛋白的表达或活性来抑制凋亡[25］．矛盾的是，NFκB也具有促凋亡活性[26］．NFκB本身是一种不活跃的细胞质复合体，与IκB家族的抑制蛋白结合。在刺激下，TRAFs招募NFκB诱导激酶(NIK)，它磷酸化IKK复合体，随后触发IκB的泛素化，这使得NFκB复合体能够从细胞质转移到细胞核，在细胞核中激活各种基因的转录[27］．caspase募集结构域蛋白CARD10通过与IKK复合体的相互作用诱导NFκB活性[28］．该CARD10在暴露6 h后上调，提示NFκB活性诱导。然而，TTRAP(一种编码蛋白质的基因，通过与TNF受体结合来抑制NFκB)的同时上调[27]可能拮抗NFκB复合体CARD10的诱导作用。

在与微生物相互作用过程中，细胞死亡诱导主要通过TLR信号和死亡诱导细胞因子的表达发生，如肿瘤坏死因子(TNF)或Fas配体(FasL)，同时伴随适当的死亡信号受体的表达增加。TNF家族的一种受体TNFRSF25在急性反应(1小时暴露)期间上调。TNFRSF25，也被称为死亡受体3 (DR3)，诱导NFκB激活，从而介导细胞凋亡的激活[29］．

虽然发现了与细胞死亡相关的几个基因表达差异，但这些基因中没有一个是刺激或执行细胞死亡的。重要的是，随着暴露于微生物的持续时间的延长，细胞似乎没有保持细胞“妊娠”期的代谢下调，这是急性1小时反应的特征l .杆菌而是转换到一个更富增殖的阶段，整体表达谱的特征是参与细胞生长、增殖和发育的基因的上调。尽管这种向细胞增殖的转变，细菌存在的监测仍然是明显的，这可以从抗菌α-防御素和主要组织相容性复合体(MHC)抗原处理和呈递途径的上调表达中推断出来。

重要的MHC和其他先天免疫系统相关受体和效应器分别在暴露1和6小时后表达差异。暴露1小时后l .杆菌，编码主要补体成分1蛋白的基因被上调，这是一组介导补体免疫反应“经典途径”的蛋白质。而编码补体成分8 γ多肽的C8G基因则被下调。该基因是抗菌膜攻击复合体(MAC)的一部分，MAC是一种参与破坏细菌细胞膜的细胞溶解蛋白复合体。观察到该抗菌蛋白的下调可能意味着肠黏膜免疫系统可以感知l .杆菌在1小时内将其识别为共生的非致病性细菌。

长期输液l .杆菌诱导MHC抗原加工和呈递途径，表明粘膜上皮积极执行细菌监测和识别过程。CD74是主要受体之一，可与细菌结合，是上调基因之一。该受体参与抗原呈递和免疫反应[30.]，但也能促进细胞增殖和负调控凋亡。

暴露6 h后，MHC-I和MHC-II跨膜受体表达上调。在长时间接触乳酸菌后，CD74和HLA-DMA和-B上调。这些受体参与抗原内吞、加工和呈递的MHCII途径[31，32］．HLA-E表达的增加表明上皮细胞受到了积极的保护，免受潜在的破坏性免疫系统反应。增加细胞表面HLA-E的数量使细胞对自然杀伤细胞介导的裂解不那么敏感。HLA-E表达的稳定是由HLA-A2介导的[33]， 6 h后该蛋白表达也上调。

综上所述，在急性反应过程中，补体1被诱导，暴露6 h后，MHC抗原加工和递呈途径被表达，提示细菌监测和识别过程被激活。基于微阵列数据，未发生炎症免疫反应。更确切地说，是暴露于l .杆菌与细胞增殖是一致的。但值得注意的是，灌流6 h后，paneh -cell-specific defensin α5表达上调，表明肠道内微生物被感知，其数量受肠黏膜隐窝区免疫应答的控制。

Q-PCR分析结果与微阵列数据一致。10个基因中有8个基因表达结果得到确认，这与Affymetrix微阵列平台提供可靠的基因表达测量平台的共识是一致的[34］．观察到的这两种技术之间的差异与其他人的观察结果是一致的[34]，且大多是由于探针序列和目标位置的差异造成的。

目前的稿件提供了一个深入概述的初始转录反应的健康肠粘膜与活细菌细胞的相互作用l .杆菌描述了细菌暴露1和6小时后转录反应的时间依赖性变化l .杆菌．观察到的变化是适度的，因为基因最多受78%的影响。这与我们小组对人类的一项干预研究的影响是一致的，在该研究中，也只观察到对折叠变化的温和影响，最高可达基因转录本的翻倍[11］．本研究的生物学观察结果与以往补充益生菌30 d效果的研究结果一致喂食GG和芽孢杆菌clausii人小肠黏膜的转录应答研究[7，14］．三种微生物在转录组水平介导免疫调节、细胞生长和细胞-细胞信号转导(大鼠李糖GG和l .杆菌WCFS1)。此外，我们的研究表明l .杆菌WCFS1介导脂肪酸的摄取和代谢，不仅有助于脂质代谢，也有助于如上所述的免疫反应调节。值得注意的是，尽管30天补充研究的作者声明益生菌对健康十二指肠的影响进行了调查，但药物(质子泵抑制剂)的使用以及小样本量(每组n = 3)阻碍了他们的结果的推广，因此，与当前研究结果的比较可能是不合理的。我们想强调的是，在目前的研究中观察到的基因转录的影响，可能不是特定的l .杆菌WCFS1。如前所述，其他微生物也会引起一些生物学效应。未来的研究应该会揭示这一点l .杆菌WCFS1在胃肠道中诱导特定而独特的反应。

综上所述，本研究表明l .杆菌WCFS1诱导健康受试者肠黏膜的时间依赖性转录变化。在各种生物过程中，特别是脂质代谢、细胞增殖、细胞死亡和存活以及免疫反应都受到调控。基因表达谱表明细胞死亡和促炎反应被触发，但没有被执行。这是对人类反应的广泛探索l .杆菌WCFS1可能最终为该菌株和/或物种的特异性或益生菌活性提供分子支持，并证明了用于识别人类肠道微生物潜在生物活性的应用技术的力量。

本研究包括两项人类干预研究，分别在“研究1”和“研究2”下描述。这两项研究都得到了马斯特里赫特大学医院伦理委员会的批准，并完全按照《赫尔辛基宣言》的原则进行(52^ndWMA大会，爱丁堡，苏格兰，2000年10月)。所有受试者在纳入研究前都给予了书面知情同意。

植物乳杆菌WCFS1的制备

l .杆菌WCFS1在MRS培养基上厌氧条件下生长，遵循标准的实验室程序。每次实验前15分钟l .杆菌WCFS1 10¹¹刚做好的l .杆菌WCFS1在37℃重悬于含10 g/L葡萄糖的600 mL生理盐水溶液中。

研究1

主题

8名健康的不吸烟志愿者(24±4岁)，无胃肠道症状史，无任何药物治疗，在随机安慰剂对照交叉研究中分别进行了两次调查。

协议

禁食一晚后，通过标准软性胃十二指肠镜从十二指肠水平部分(幽门远端约15cm处)获得粘膜组织样本，并在小肠近端经胃放置灌注导管，如上所述[11］．简单地说，在胃十二指肠镜检查过程中插入导管，以便在幽门远端5cm处注入液体。在短时间间隔的透视控制下进行导管定位。志愿者没有服用镇静剂。随后，在实验的前180 min，用蠕动泵以10 ml/min的速度连续注入含有10 g/L葡萄糖的生理盐水溶液。经过这段时间，使肠液流量建立稳定状态，含10 g/L葡萄糖的生理盐水，加或不加，共1 × 10¹¹l .杆菌WCFS1注入1小时。液体保持在37°C使用摇晃水浴。受试者保持仰卧位直到实验结束，实验期间不允许进食或饮料。灌注实验结束后，轻轻拔出灌注导管，取出灌注导管。灌注实验15分钟后进行第二次胃十二指肠镜检查，从当天早些时候相同的肠区获得组织样本。在第一次实验后的13到16天，整个实验方案在另一天重复，随机调查安慰剂或安慰剂的效果l .杆菌WCFS1。在所有组织样本中，使用全基因组微阵列(Affymetrix U133A;见下文)。未取样品进行蛋白质组学分析，因为预计在1小时暴露时间内不会发生蛋白质水平的变化l .杆菌WCFS1。

研究2

主题

7名健康的非吸烟志愿者(28±6岁)，无胃肠道不适史，无任何药物治疗，参与了一项随机对照交叉研究。

协议

在一夜禁食后，十二指肠内进食导管(鼻肠管，絮凝剂^®本马克，纽迪西亚医疗保健公司，夏特尔街。Denis，瑞士)是按照制造商的说明鼻胃放置。志愿者没有服用镇静剂。导管定位于小肠后(管尖定位于幽门远端5-10 cm处)，取含10 g/L葡萄糖的生理盐水溶液，共10¹²l .杆菌WCFS1或在另一个测试日随机注射含有10 g/L葡萄糖的生理盐水溶液，以6.7 ml/min的速度连续注射6小时。两项研究中，液体中细菌的浓度是相同的，这对不同研究之间的适当比较很重要。输注速度低于研究1，以避免注射过多液体和细菌，可能引起胃肠道症状。液体保持在37°C使用摇晃水浴。受试者保持仰卧位直到实验结束，实验期间不允许进食或饮料。6小时后，在幽门远端约15cm处，通过标准软性胃十二指肠镜从十二指肠水平部分取组织样本。在所有组织样本中，使用全基因组微阵列(Affymetrix U133A;见下文)。在重复的组织样本中，使用CyDIGE方法(最小荧光标记的二维凝胶电泳)和Maldi-TOF MS(见下文)进行差异蛋白质组分析。

微阵列分析

RNA隔离用TRIzol裂解法分离总RNA。接下来，每个分离组织样本的总RNA被杂交到基因芯片微阵列(HG U133A;Affymetrix Inc, Santa Clara, Ca, USA)根据制造商的说明。因此，在研究1中，32个RNA样本进行了杂交(来自8个受试者的组织样本，分别在干预前后获得l .杆菌WCFS1和安慰剂)和研究2,14个RNA样本(来自7名受试者，在暴露于l .杆菌WCFS1)杂交到芯片上。简单地说，在每个冷冻组织样本中加入1 mL TRIzol (Invitrogen Life Technologies b.v.， Breda, Netherlands)和10 μL β- mercapto乙醇(VWR International b.v.， Amsterdam, Netherlands)，用小型打珠器摇30秒。加入200 μL氯仿(Sigma Aldrich Chemie b.v.， Zwijndrecht, The Netherlands)，孵育3分钟，21000 g离心分离相15分钟。取上部水相，加入500 μL 70%乙醇。随后，使用RNeasy Mini Kit (Qiagen Benelux b.v.， Venlo, the Netherlands)进行额外的DNA消化，通过柱上RNase-Free DNase处理(Qiagen Benelux b.v.， Venlo, the Netherlands)纯化提取的RNA。使用纳米滴设备(ND-1000分光光度计，Isogen Life Science b.v.， IJsselstein, The Netherlands)测定RNA纯度。只考虑260/280比值在1.9到2.1之间的RNA样本进行进一步分析。使用Bioanalyzer技术(Bioanalyzer 2100, Agilent, Santa Clara, USA)测定RNA完整性。RNA完整性数(RIN)高于8.0的RNA样本被考虑作进一步分析。

微阵列

根据制造商的说明，将总RNA杂交到genchip微阵列(Affymetrix Inc, Santa Clara, Ca, USA)上。在本次分析中，每个样品中提取5微克总RNA，并按照制造商(Affymetrix Inc, Santa Clara, Ca, USA)的推荐使用单周期标记系统。微阵列扫描使用基因芯片仪器系统(Affymetrix Inc, Santa Clara, Ca, USA)。微阵列数据计算以获得差异表达基因的详细信息在补充材料中有描述(见附加文件)3.)．

路径分析

分析的基因和折叠变化加载到GenMapp [35]和MAPPFinder [36进入GOurmet和匠心路径分析IPA (URL请参见可用性和需求部分)软件包，根据基因本体论(GO)术语和局部地图，评估与已知生物过程、分子功能和细胞成分相关的转录本。只有安慰剂组和治疗组的平均强度高于500或其中一个组的平均强度高于1000和10%的上调或下调的基因转录本，才被用于获得差异表达基因通路的排序列表。

用MappFinder软件筛选出差异表达基因数量相对较高的mapp，这些mapp受乳杆菌WCFS1相比安慰剂。调节通路的排序由个体z评分表示。考虑到在阵列上表示的MAPP中出现的基因数量，以及相关MAPP中涉及的基因总数，如果发现的变化基因数量更多，则z得分就会增加。选择mapp进行进一步研究，如果组结果为(Lacobacillus杆菌WCFS1相比安慰剂)在研究1的MAPP上达到至少3的任意z得分，研究2至少5，并且至少3个基因在该通路上有差异表达。两项研究使用了不同的z评分分界点，因为研究2的影响更明显，揭示了更多的生物通路的调控，因此可以在通路分析中使用更严格的统计分界点。

通路可视化

通过与NCBI Entrez基因信息(URL请参见可用性和需求部分)、蛋白质、信号转导、转录相互作用和炎症网络网关数据库pSTIING (URL请参见可用性和需求部分)和BioCarta图表(URL请参见可用性和需求部分)中发表的信息和可用性路径进行进一步细化和生物学解释。基于IPA和pSTIING的综合信息和已发表的数据，利用Biocarta提供的图像(“工具箱”)调色板，根据其编码和相互作用的蛋白质和通路，重建了微阵列结果的图形表示。

Q-PCR根据制造商的说明，使用iScript cDNA Synthesis kit (Bio-Rad, Veenendaal, the Netherlands)合成第一链cDNA。以250 ng和500 ng总RNA为模板，分别进行研究1和研究2的cDNA反应。起始量的差异是由于研究1中可用的RNA数量较少，这是由于本研究中获得的组织样本尺寸较小。用无RNase的H稀释cDNA₂O浓度分别为5和10 ng/μl。Q-PCR使用IQ Sybr Green Supermix (Bio-Rad, Netherlands)。每个Q-PCR反应中含有12,5 μl iQ Sybr Green Supermix、1 μl 10 μM基因特异性正、反引物、2 μl cDNA模板液和8,5 μl无菌水。使用了以下引物。管家基因为18SrRNA: gtaacccgttgaaccccatt, ccatccaatcggtagtagcg;GAPDH: tgcaccaccaactgcttagc, ggcatggactgtggtcatgag和Calnexin: ccactgctcctccttcatctcc, cggtatcgtctttcttggctttgg。基因研究1;GUCA2A: gggttgggaaactcaggaactttg tacaggcagcgtaggcacag;PCNA: gccactccactctcttcaacgg tggtgacagaaaagacttcagtatatgc;CD36: ggaatctgtcctattgggaaagtcactgc ctgggttttcaactggagaggcaaagg; FOS: ctgtgtctcttttctctttctccttagtc, tccagcaccaggttaattccaataatg; DUSP1: agcagaggcgaagcatcatc, acggtggtggtggaggtg. Genes study 2; PLA2G2A: gcagaagtcaactgtgtgagtgtg, gggagggagggtatgagagagg; DEFA6: ggctcaacaagggctttcac, gtatgggacacacgacagtttc; CDS1: tggattcattgctgcctatgtgttatc, ctttagaaagggtggaagtgagtaagtc; REG3A: gctgtcccaaaggctccaagg, atcacatcactgctactccactcc; CD24: gtatttgggaagtgaagactggaagc, agtgttctaaatgtggctattctgatcc. Gene study 1 and 2; MTP: ggacctagcacagaggaatcag, ccaaatccaccagtttcttgaagc. Reactions were run on the My IQ Single Color Real Time PCR Detection System (Bio-Rad, Veenendaal, The Netherlands). The cycling conditions comprised 3 minutes at 95°C and 40 cycles at 95°C for 10 seconds and 60°C for 45 seconds followed by a melting program. The CT values were normalized using the IQ5 Optical System Software version 2.0 (Bio-Rad, Veenendaal, The Netherlands). Gene-transcripts were analyzed using a multivariate Gaussian linear regression, similar to the microarray analysis, with the difference of having the sample concentration, the test day, the perfusion procedure, repeats, and the best housekeeping gene among 18S ribosomal RNA, GAPDH and calnexin included. Detailes of the Q-PCR calculations are provided in Additional file3.．

蛋白质组学分析

肠道活检组织在裂解缓冲液中通过超声进行蛋白质分析，并经二维清理试剂盒(Amersham Biosciences, Freiburg, Germany)去除非蛋白质物质。使用二维定量试剂盒(Amersham Biosciences, Freiburg, Germany)测量蛋白质浓度。按照制造商说明，使用Ettan™DIGE技术进一步对样品进行二维荧光差异凝胶电泳处理[37］．利用Ettan IPGphor 3等电聚焦系统进行二维电泳分离蛋白质混合物，根据其等电点，利用Ettan IPGphor 3等电聚焦系统分离蛋白质混合物，利用EttanDalt12电泳系统分离蛋白质混合物的分子量。安慰剂干预的样本和l .杆菌在一个IPG-strip上装载了干预剂，以及一个池内标准。二维电泳完成后，用台风共聚焦激光扫描仪(Typhoon 9410 Variable Mode Imager, Amersham Biosciences)扫描凝胶，并将扫描图像加载到DeCyder软件(DeCyder 2D, Amersham Biosciences, Freiburg, Germany)中，分析蛋白质图谱的差异。用Ettan Spot picker (Amersham Biosciences, Freiburg, Germany)筛选差异表达蛋白斑点。使用Maldi-TOF MS分析对切除的斑点进行大规模指纹识别，如别处所述[38］．

微阵列数据可在ArrayExpress数据库中获得http://www.ebi.ac.uk/arrayexpress实验注册号为e - mxi -1328。

异丙醇:http://www.ingenuity.com

NCBI Entrez基因信息:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=gene

pSTIING:http://pstiing.licr.org/

BioCarta图表:http://www.biocarta.com

作者要感谢D. Jonkers博士(马斯特里赫特大学，马斯特里赫特，荷兰)准备了l .杆菌WCFS1补充剂。本研究得到了托普食品与营养研究所(TIFN C007;Ft, pvb, ak, wdv, mk, rjb)。PL由马斯特里赫特大学资助。

作者和联系

1. 马斯特里赫特大学内科，消化病学和肝病科，荷兰马斯特里赫特

   Freddy J Troost和Andrea Kodde

2. 顶级食品与营养研究所(TIFN)，荷兰瓦赫宁根

   Freddy J Troost, Peter van Baarlen, Andrea Kodde, Willem M de Vos, Michiel Kleerebezem & Robert-Jan M Brummer

3. 分子和生物分子信息学中心，内梅亨大学奈梅亨医学中心，奈梅亨，荷兰

   Peter van Baarlen

4. 尼佐食品研究，埃德，荷兰

   米歇尔•Kleerebezem

5. 荷兰马斯特里赫特大学人口遗传学系

   帕特里克·林赛

6. 荷兰瓦赫宁根大学微生物学系

   威廉·M·德沃斯和米歇尔·克里雷贝泽姆

7. 部门。荷兰马斯特里赫特大学医院内科和临床营养学

   Robert-Jan M介绍

相应的作者

对应到弗雷迪J Troost．

作者的贡献

英国《金融时报》构思了这项研究，准备并进行了人体实验，并起草了手稿。PVB进行了生物信息和途径分析，并对手稿草稿做出了贡献。PL参与了研究的设计并进行了统计分析。AK进行了RNA分离和Q-PCR分析。WDV参与了研究的设计，并帮助起草了手稿。MK构想了这项研究，参与了它的设计和协调，并帮助起草了手稿。RJB构思了这项研究，参与了它的设计和协调，执行了胃十二指肠镜检查程序，并帮助起草了手稿。所有作者阅读并批准了最终稿件。

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