宏基因组生物标志物的发现和解释

本研究描述了宏基因组生物标志物的发现和验证新方法的类比较,测试生物一致性和效果评估。这解决的挑战,寻找生物,基因,或通路一致解释两个或两个以上的微生物群落之间的差异,这是一个宏基因组研究的核心问题。一些微生物和广泛验证我们的方法提供了一个方便的网络接口的方法http://huttenhower.sph.harvard.edu/lefse/。

生物标志物发现已经被证明是一种最广泛适用的和成功的方法将分子和基因数据转化为临床实践。比较健康和病变组织的重要性凸显了任务,比如类发现小说(检测疾病的亚型)和类预测(确定一个新的样本)的亚型1- - - - - -4),最近的宏基因组分析表明,人类微生物群可以用作生物标记等宿主因素的生活方式(5- - - - - -7)和疾病(7- - - - - -10]。随着测序技术的不断发展,使微生物生物标志物越来越容易检查出来的,这使得临床诊断和微生物应用程序通过微生物群落的比较11,12]。

人类微生物组,由总微生物与人类宿主相关的补充,是一个重要的新兴领域宏基因组生物标志物的发现(13,14]。肠道微生物丰度的变化,口腔和皮肤相关疾病从肥胖(15- - - - - -17牛皮癣][18]。更普遍的是,微生物群落的宏基因组研究是一种有效的方法来识别任何无教养的样本的微生物或微生物代谢特征(19,20.]。宏基因组数据的分析通常寻求识别特定的生物,演化支,操作分类单位,或路径的两个或两个以上的组相对丰度差异的样本,而且微生物群落的几个特点已经被提议作为潜在生物标志物用于各种疾病。例如,单一致病菌可以信号疾病如果在一个社区21,22),增加和减少社会的复杂性,使被观察到在细菌性阴道炎23和克罗恩氏病8]。这些不同类型的微生物生物标记物是与疾病表型,但很少提供生物信息学方法存在解释类比较宏基因组数据。

识别最生物信息特征区分两个或两个以上的表型可以挑战在任何基因组数据集,并为宏基因组生物标志物尤其如此。需要健壮的统计工具来确保结论来自宏基因组数据的重现性,这是生物研究的临床应用的关键。相关的挑战与高维数据的数据类型或实验平台;潜在的生物标记物的数量,例如,通常是远高于样品的数量(24- - - - - -26]。宏基因组分析另外提出自己的具体问题,包括测序错误,嵌合读(27,28,复杂的生物学基础;发现了许多微生物社区非常高inter-subject可变性。例如,大的差异是发现即使在双胞胎的肠道微生物组29日),人类微生物组和环境社区被认为是具有长尾的稀有生物的存在(30.- - - - - -32]。此外,简单地识别潜在生物标志物没有阐明生物一致性和角色只是一个前兆理解microbe-microbe或宿主相互作用的潜在机制(33]。在许多情况下,有必要解释不仅有两个生物样品不同,但为什么。这个问题被称为类比较:表型之间的差异如何如肿瘤亚型或疾病状态的一致解释生物学途径或分子机制?

类已经提出了大量的方法发现或在宏基因组数据比较。梅金(34)是一个宏基因组分析工具中最近添加的系统发育的比较(35和统计分析36]。然而梅根,只能单对基因组进行比较,与邮票也是如此(37),并引入一个概念“生物相关性”的形式的置信区间。UniFrac [38]比较套基因组在严格分类级别使用系统的距离,虽然MG-RAST [39],ShotgunFunctionalizeR [40],mothur [41],METAREP [42所有过程宏基因组数据(主要是使用标准的统计测试t与一些修改测试)。大多数社区的方法从生态的角度分析依赖于无监督聚类分析基于主成分分析(43)或主坐标分析(44]。这些可以成功地检测组织相关的样品,但是他们不包括先验知识的表型或环境条件相关的团体,他们通常不负责集团关系识别的生物特性。Metastats [45)是目前唯一的方法,明确夫妻统计分析(评估基因组不同)和生物标志物的发现(检测特性描述的差异)基于重复t统计和费雪的测试随机排列。然而,这些方法,即使是那些提供细致入微的分析宏基因组数据,提供生物类的解释建立统计学意义,生物一致性和效应值估计预测生物标志物。

在这项工作中,我们目前的线性判别分析(LDA)效果(LEfSe)方法来支持高维类与特定关注宏基因组比较分析。LEfSe决定了功能(生物演化支、操作分类单位,基因,或功能)最有可能解释差异统计学意义的标准测试类之间的耦合与额外测试编码生物一致性和效果的相关性。类比较方法通常预测生物标志物组成特征违反没有差异的零假设类;我们另外检测特性的子集与丰富模式兼容算法编码生物假设和估计的大小显著变化。特别是,效果提供了一个观察现象的大小估计由于每个描述特性,因此它是一个有价值的工具,用于排序的相关性不同的生物方面和解决进一步的调查和分析。前生物知识的引入方法约束分析,从而有助于解决挑战传统与高维数据挖掘。LEfSe因此旨在支持生物学家提出的生物标志物,解释大部分的利益分化表型的影响(两个或两个以上)的生物标志物发现比较和假说驱动的调查。发现生物标志物在分类树的可视化提供了一个有效手段,总结结果在生物学上有意义的方式,这两种统计和视觉捕捉16 s分类法/固有的层次关系的发展史或本体的通路和生物分子功能。

我们从人类微生物组验证这种方法使用数据,溃疡性结肠炎小鼠模型,和环境样品,在每种情况下预测的生物或操作分类单位,简明地分化相比较的类。我们进一步评估LEfSe使用合成数据,观察它达到一个更好误判率与标准统计测试相比,在价格的适度增加假阴性率(也可以由用户根据需要调整)。LEfSe包括一个方便的图形界面的实现合并的星系框架(46,47)是在网上提供的(48]。

LEfSe是一种算法对于高维识别基因组特性的生物标志物的发现和解释(基因,通路,或类群)描述两个或两个以上的生物条件之间的差异(或类)(图1)。统计意义,它强调生物一致性和相关性影响,让研究人员确定不同的丰富特性也符合生物学意义的类别(子类;见材料和方法)。LEfSe第一强劲统计识别特性不同的生物类之间。然后执行额外的测试来评估这些差异是否符合预期对生物行为;例如,给定一组内的一些已知的人口结构输入样本,是一个功能更丰富的人口在所有子类或只有一个吗?具体来说,我们首先使用非参数的阶乘克鲁斯卡尔-沃利斯(千瓦)sum-rank测试(49)检测与重要的微分特性丰富的阶级的利益;生物一致性是随后调查之间的两两测试使用一组子类使用(未配对)Wilcoxon rank-sum测试(50,51]。作为最后一步,LEfSe用LDA (52)来估计每个不同的效果和丰富的功能,如果需要由调查员进行降维。

我们有专门设计的生物标志物发现LEfSe宏基因组数据。我们因此总结我们的研究结果应用工具从16 s rRNA基因和全基因组鸟枪数据集来检测细菌生物和功能特征之间的差异丰富的两个或两个以上的微生物环境。这些包括身体网站在人类微生物组(粘膜表面和需氧/厌氧环境),成人和婴儿肠道菌群,炎症性肠病状态在老鼠模型中,细菌和病毒环境的社区,和合成数据定量计算评价。

在人类微生物类群描述身体的站点

人体微生物群落组织在多个网站是当前活跃的研究领域,因为低收入和高通量方法显示差异和重叠的微生物群中多个身体站点(53,54]。我们检查了这些差异的16 s phylometagenomic数据集从24个人参加人类微生物组计划(13,55]。最少5000 16 s rRNA基因序列获得301年样本24名健康受试者(12男,12女性)覆盖18身体网站,包括6个主体网站类别:口腔(9子网站采样),阴道(3子网站采样),皮肤(2子网站采样),retroauricular折痕(2子网站采样),鼻腔样本(1)和肠道的示例(1)。我们通过对比验证LEfSe粘膜与non-mucosal身体网站类和通过比较三个层次的有氧环境(厌氧、microaerobic和有氧)。在这两种情况下,身体的每个类中不同站点被用作生物子类。

粘膜表面是由不同细菌殖民;non-mucosal微生物强烈丰富的放线菌

我们第一次分析集中在微生物群组成差异粘膜和non-mucosal身体网站。口腔、肠道和阴道网站分为粘膜社区和前窝的来源(皮肤),鼻腔,retroauricular non-mucosal折痕。粘膜环境从身体的其他网站有很大的不同,主要是由与人类免疫系统的交互特征,氧化挑战,水合作用[56]。

LEfSe提供了三个主要输出(图2),描述了影响大小的粘膜/ non-mucosal社区中观察到的差异,这些差异的系统发育分布基于核糖体数据库项目(RDP)细菌分类57),和原始数据驱动这些影响。LEfSe发现15细菌演化支显示统计学意义和生物体内non-mucosal网站(图一致的差异2)。

non-mucosal体内最丰富的细菌类群不同网站属于门与流行有氧成员:放线菌,厚壁菌门和变形菌门,包括环境生物从Betaproteobacteria Gammaproteobacteria演化支。Non-mucosal过多属包括丙酸菌属,葡萄球菌(发现只在non-mucosal样品),棒状杆菌属,假单胞菌。还值得注意的是叶绿体的相关表征植物生物(叶绿体),相关类群的分布不同,像一些仅限于non-mucosal表面(环境暴露和潜在的化妆品)和其他消化(消化食品)。身体没有演化支始终存在于所有粘膜网站,展示这些社区的β-diversity(即差异他们的人口结构),但许多类群在放线菌,Bacillales以及其他演化支non-mucosal网站相对丰富。受试的β-diversity系统发育水平突出显示额外的文件1,量化的程度不同粘膜身体网站之间的距离大于等效non-mucosal站点之间的距离。这导致缺乏类群共同粘膜身体网站,因此没有分类群是由LEfSe粘膜的特征作为一个整体。

放线菌目通常最丰富的系统单元(订单)在non-mucosal社区,在几个皮肤样品比例高于90%,最多20%的绝大多数口腔粘膜样品和大幅降低阴道和肠道(图2摄氏度)。从定量的角度,分类顺序放线菌目构成本质上所有的发现门放线菌的成员,除了阴道网站报道大量Bifidobacteriales存在。Bifidobacteriales本身并不是发现粘膜和non-mucosal身体之间的差异丰富网站,因为这是一个功能只有阴道的样品,而不是身体的粘膜网站。的对比许多演化支的丰度与分布是显著的;例如,属Alloscardovia,Parascardovia和Scardovia存在于所有身体站点在丰度很低,而加德纳菌属只在阴道样品过多,超过三个数量级差异。类似的分布被发现的共性Bacillales更低丰度。在属级,丙酸菌属,葡萄球菌,棒状杆菌属和假单胞菌分化的分布和丰富。的葡萄球菌属尤其被LEfSe与LDA分数很高(超过5数量级),反映明显丰富non-mucosal网站(意思是10%、18%和21%的皮肤,retroauricular折痕和身体前鼻孔网站,分别)和持续低丰度在粘膜网站(平均不到0.001%)。

类有多个级别:不同的有氧、无氧和microaerobic社区在人类微生物组

同桌的人类微生物群的厌氧代谢的作用尚未充分研究由于研究这些社区文化的困难。我们因此进一步研究人类微生物群的aerobicity特征在高水平分组的身体网站可用氧气分子水平不同的三个类。的high-O₂直接身体接触类包括网站和永久暴露于氧:皮肤、前鼻孔和retroauricular折痕。的mid-O₂身体接触类包括口腔和阴道可以直接的网站,但不是永久,气压上暴露,low-O₂接触类(肠道)主要是厌氧的。身体网站中包含三个类可能有其他特点除了不同氧气接触,一般来说,这些混杂因素会导致与好氧生活无关的特性,作为生物标志物检测。然而,LEfSe生物步骤确保一致性检测生物标志物特征的所有子类的类和其他类的所有子类。例如,丰富的口腔细菌进化枝由于oral-specific利基并不作为生物标志物检测,除非相同的利基也出现在阴道样品(mid-O其他身体部位₂在任何high-O类),而不是礼物₂或low-O₂单一机构网站。所以LEfSe将检测生物标记物比传统的方法更自信地与好氧生活特征,不包含子类信息。此外,LEfSe特别能够分析顺序类与多个水平,同意建立微生物学,我们观察到特定微生物演化支内无处不在的这三个环境和特点,详细如下(图二维)。

LEfSe允许序数类有超过两个层次来分析在两个不同的保守派。第一个需要每一对之间重要的类群不同阶级的值(在这个例子中,aerobicity;见材料和方法);发现生物标志物必须准确区分所有单个类(高、中期和low-O₂)。在这个例子中(图二维;严格的版本),我们发现13演化支LDA分数2以上,显示三种不同的丰富水平。另外,LEfSe可以确定重要类群不同的至少一个(也可能是多个)类值(s)(非严格版本);换句话说,生物标记区分至少有一个单独的类。使用这种方法(图2 e),我们发现60演化支与LDA分数至少2。

使用方法,每个氧气水平是广泛的,其特征是一个特定的进化枝。整体的丰度放线菌门更高的身体网站直接暴露于氧气分子与几个成员寄生在皮肤的放线菌目秩序。放线菌目包括丙酸菌属属,这是高度丰富的皮肤上,在moderate-O低₂环境和缺席肠道。Lactobacillales(主要是细菌)是特定于温和的啊₂低暴露水平,相反在high-O存在₂接触类,再次缺席肠道。类杆菌(特别是拟杆菌在厌氧样本)无处不在;然而,有趣的是,这个家庭的成员更丰富的高氧可用性条件(特别是在皮肤和retroauricular折痕)比在中氧的可用性,显示系统分支内的利基多样性。这是在协议与观测,许多微生物财团显示极端生物地理学的微环境变化对营养,代谢产物和氧气可用性(58,59]。

双歧杆菌和额外的演化支弱势在溃疡性结肠炎的小鼠模型

啮齿动物模型建立了提供一个独特的准确和容易处理模型研究肠道微生物群,包括慢性肠道炎症的分子和细胞机制驾驶(60- - - - - -63年]。特别是,炎症性肠病的小鼠模型63年)促进机械的贡献评价肠道微生物群的起始及延续慢性肠道炎症,发生在人类克罗恩病和溃疡性结肠炎64年]。已知一个宿主分子机制之间保持平衡免疫调控和共生的微生物区系T-bet,许多免疫细胞的转录因子表达的子集。失去在缺乏一种自适应免疫系统的结果在一个高度渗透和积极形式的溃疡性结肠炎65年,特别依赖于通过肠道菌群和传染性。我们因此试图调查粪便微生物群的特点在一个小鼠模型的自发结肠炎发生在一群Balb / cT-bet^{- / -}×Rag2^{- / -}老鼠使用16 s rRNA基因宏基因组数据(66年,67年]。

LEfSe是应用于微生物群20的数据T-bet^{- / -}×Rag2^{- / -}(例)和10Rag2^{- / -}(控制)小鼠(数据集提供了额外的文件10丰富),发现19个不同分类演化支(α= 0.01)与LDA分数高于2.0(图3)。这些不同的丰富的演化支是符合我们之前的16 s rRNA-based使用完整的链接层次聚类序列分析和定量实时pcr实验上执行相同的粪便DNA样本(67年]。更具体地说,这标志着Bifidobacteriaceae和损失双歧杆菌属与T-bet^{- / -}×Rag2^{- / -}我们观察到这里可能会解释这结肠炎的积极响应双歧杆菌animalis无性系种群。lactis发酵的牛奶产品验证的低吞吐量的方法(67年]。

在家庭层面上,Rag2^{- / -}浓缩的Bifidobacteriaceae Porphyromonadaceae Staphylococcaceae和T-bet^{- / -}×Rag2^{- / -}浓缩的Lachnospiraceae确认我们的报告68年使用培养和实时定量PCR技术。LEfSe LDA进更多的内容详细的重组这些类群相对P价值发现的这些家庭在我们以前的工作,强调了双歧杆菌,有趣的是,几个演化支在梭状芽胞杆菌。其中包括Rag2^{- / -}特殊技能Roseburia和Papillibacter属属于T-bet^{- / -}×Rag2^{- / -}特殊家庭(Lachnospiraceae和Ruminococcaceae)。的重要地位Metascardovia(Bifidobacteriaceae)Rag2^{- / -}老鼠也是有趣的,因为它可能有一个类似的角色双歧杆菌属因为Metascardovia之前已经观察到主要在口腔68年]。这个分析突出了LEfSe的协议的效应值估计对低吞吐量确认并建议额外的演化支进一步实验研究。

比较与当前使用病毒和微生物宏基因组分析工具从环境数据通路

我们应用LEfSe的环境数据69年),一个数据集的目标描述的功能角色viromes(即病毒基因组)和微生物(细菌基因组)。这个任务是用于45)描述Metastats算法在相同的原始数据。在29日高层功能角色(包括未分类角色)子系统层次结构的种子70年]和NMPDR [71年)框架,LEfSe标识只有严格的核苷和核苷酸子系统不同丰富在所有环境子类,特别是高水平viromes微生物。这是一个精确的描述完全蛋白质功能的最常见的病毒基因组中编码,而细菌基因组的编码范围广泛的少特别丰富的功能。当LEfSe放松检测至少一个显著的变化一致,而不是所有环境子类,我们另外确定“呼吸”子系统在微生物对viromes大大丰富,可能反映出均匀有氧细菌新陈代谢捕捉到这些数据。

除了核苷和核苷酸和呼吸子系统,Metastats [45]报告五个其他高级功能角色不同丰富(P= 0.001)。然而,当考虑到子类结构在整个采样环境,这些额外的差异显示更少的变化一致。这是显示在图4,这些病例报告原始数据的直方图和LEfSe的不同结果,Metastats和千瓦单独测试。此外,由于子系统框架层次(三层),LEfSe的结果包括进化分枝图显示每个水平上的显著差异(见图4两级进化分枝图,和额外的文件2三级进化分枝图)。

考虑所有三个级别的种子功能特异性,LEfSe报告59子系统更丰富更丰富的微生物基因组,只有7在病毒基因组(附加文件3)。细菌基因组编码更大数量和生物分子的功能比大多数病毒基因组的多样性,,因此这些差别是可以预料到的。然而,他们也强调考虑特定于大多数宏基因组(更普遍,生态)分析,通常分析相对丰度。一些很常见的子系统viromes(即核苷和核苷酸)将迫使其他子系统的相对丰度下降,导致明显的under-abundance。子系统检测到特异性可能因此显示这一趋势在一定程度上由于正常化丰度在每个样本。这个问题是特定于LEfSe和Metastats,然而,和必须考虑的解释任何相对丰度数据,宏基因组或(72年]。

机能活动在婴儿和成人的微生物群表明post-weaning微生物专业

正如LEfSe可以确定生物体或通路是否不同丰富几个宏基因组样本,还可以关注个体酶或同源组。Kurokawa等。(73年]分析了13从九成人和四个还在吃奶的婴儿肠道基因组同源基因家族的功能。他们最初这样做是通过比较齿轮(74年,75年)发现在每个metagenome参考数据库;后,白等。(45]Metastats算法应用于直接检测婴儿和成人微生物组之间的差异。使用意义的α值0.01的低基数的类(特别是婴儿类),LEfSe发现366齿轮丰富成人或婴儿基因组——17的LDA得分高于3(附加文件4)。

17齿轮配置文件中LEfSe得分高于3,11也Metastats探测到。六个齿轮不被Metastats(附加文件5)外膜蛋白(COG1538)和Na⁺借耐多药外排泵(COG0534),浓缩在成人中,衍生品和转座酶灭活(COG2801 COG2963)转录监管机构/糖激酶(COG1940)和转录监管机构(COG1309),丰富了婴儿。所有六个齿轮拥有丰富资料,婴儿和成人个体之间是完全重叠(除了COG1538,成人的最低水平略低于最高的婴儿),因此名义上很歧视。另一方面,在192齿轮Metastats发现,9没有检测到LEfSe即使在LDA得分最低阈值(附加文件6)。所有婴儿和成人之间具有重叠的丰度值类(至少两个,通常,最高的样本越少丰富类重叠被认为是更丰富的类)。这种歧视性的缺乏权力阻止LEfSe突出成人和婴儿之间的差异是显著的,特别是考虑到低的婴儿数量样品。

有趣的是,LEfSe截然不同的列表的功能活动的核心婴儿和成人微生物暗示“通才”微生物活动在早期生活随着时间的推移和专业化(76年]。事实上,检查最高的五个不同的丰富的齿轮为每个类尺度效应,我们发现婴儿非常高层次的官能团与广泛的转录调节(COG1609、COG1940 COG1309和COG3711)。在成人中,所有五个代表更专门的同源组,包括COG1629(外膜受体蛋白,主要是铁运输),COG1595 (DNA-directed RNA聚合酶专业σ亚基,sigma24同族体),和COG4771 (ferrienterochelin外膜受体和大肠杆菌素)。由于不同的数量丰富的齿轮非常高(366),这个观察只是强调候选人生物标记列表的顶部由于LEfSe大小的影响量化,它允许最类间特征差异出现。出于同样的原因,我们可以很容易地证实,糖代谢中起着至关重要的作用在婴儿肠道和铁代谢在成人中,已经在(45,73年];得分最高的齿轮LDA的确拥有糖和葡萄糖为婴儿和成人iron-related功能功能活动。

LEfSe达到合成数据中假阳性率很低

我们进一步调查的能力LEfSe检测生物标志物使用合成高维数据(见材料与方法的描述数据集)相比,仅千瓦测试(一种非参数的方差分析(方差分析)和Metastats [45]。LDA的效果一步LEfSe这里不考虑为简单起见,和人工数据详细的图5。

从理论上讲,前两个实验的设置(图5 a、b为千瓦)完全匹配应用程序条件测试。假阳性率(平均2.5%,不管距离特性的手段和正态分布的标准偏差)实际上是一致的α值0.05,考虑到负面特性总数的一半。LEfSe行为定性千瓦非常相似,但大大降低假阳性率(少于0.5%的绝大多数情况下对中值为2.5%)和较高的假阴性率。在生物学上,假阳性往往比假阴性(视为更戏剧性的77年- - - - - -79年];这通常归因于这样一个事实,这是不受欢迎的投资昂贵的实验后续的假阳性,而在高吞吐量设置,一些真正的阳性大于假阴性被知晓。减少假阳性的动机,我们认为至少LEfSe执行以及千瓦当没有意义的子类结构是可用的。另一方面,当子类可以确定内部类和他们中的一些人不同意这种趋势在类,LEfSe执行定性和定量比千瓦(图5度)。假阳性是事实上总是大大低于千瓦,而假阴性高只有非常嘈杂的特性。Metastats [45]似乎达到千瓦(附加文件非常相似的结果7关于LEfSe)相同的缺点。

获得深入的结构、组织和微生物群落的功能提出了作为研究的一个主要挑战当前的十年(80年),它将通过实验和计算宏基因组分析。为此,我们开发了LEfSe算法比较宏基因组研究允许微生物类群的特征具体实验或环境条件、途径和生物机制的检测是否被充分代表在不同的社区,并在哺乳动物微生物宏基因组生物标志物的鉴定。LEfSe这里显示是有效地检测不同的丰富特性在人类微生物组(典型的粘膜或有氧类群)和小鼠结肠炎模型。比较与现有统计方法和先进的宏基因组分析环境、婴儿肠道微生物组,和合成数据显示,LEfSe持续提供降低误判率,可以有效地帮助解释生物学基础微生物群落的差异。

这些发现证明了类的概念解释包括统计和生物学意义是非常有益的在解决统计挑战与高维生物标志物的发现(28,81年,82年]。特别是LEfSe决定特性可能能够解释差异条件而不是功能,仅仅拥有类间分布不均匀。这是不同于最新的统计方法(45),类似于生物学先验知识的结合被证明是非常成功的在最近的全基因组关联研究(83年- - - - - -85年]。此外,特别是在(通常是嘈杂的)宏基因组数据集,效果可以作为正交措施补排名基于生物标记物P单独的值。类之间的差异非常显著(低P值),但如此之小,他们不太可能生物表型差异负责。另一方面,相对较大的生物标志物P值(例如,0.01)可能对应于一个巨大的影响大小,通过技术与统计显著性减少噪音。LEfSe调查两方面计算通过测试的一致性和类间差异特性丰富的效应大小的结构问题。这是随后执行标准统计显著性测试和集成LEfSe通过评估生物意义的组样本在每个子类条件之一。这种耦合与生物统计方法的一致性和效应值估计减轻可能的工件或统计不均匀性是常见的宏基因组数据,例如,主题或极端的差异的存在长尾的稀有生物(32,86年]。同样,尽管多个假设纠正统计学意义讲可能重现性结果,估计效果在高维设置是至关重要的,以解决生物一致性和可解释性。

生物学强调了这些调查与宏基因组的潜力对微生物生态学和转化应用。例如,某些细菌演化支经常发现生物标志物甚至在多样化的环境中,这表明一些物种可以在惊人的适应condition-specific礼仪。葡萄球菌Bacillales,例如,有区别的粘膜组织,有氧条件下,小鼠结肠炎,而没有任何变形菌门一直描述的这种情况下,即使他们总是代表了很大一部分的社区。这些观察结果可能反映了广泛的微环境的异质性和多面手的共存和专家细菌(87年- - - - - -89年]。

除了这些见解微生物学,宏基因组生物标记,包括特定生物的丰度、丰度的整个演化支,或存在缺乏特定的生物,可以描述主机表型,生活方式,饮食,以及疾病(5- - - - - -10]。如果消耗的双歧杆菌属物种在溃疡性结肠炎证明发生在人类疾病病因的早期,这可比转变微生物群的潜在的应用在人类疾病的检测90年,91年),特别是一些细菌财团可以检测到的变化容易和便宜。口腔微生物生物标记,例如,可以很容易地获得和分析微阵列芯片针对细菌分析(92年]。这些看起来特别有前途的临床应用(11),唾液微生物群落的似乎代表一个潜在的代理对其他人类微生物群(93年]。其他重要的宏基因组分析的临床应用包括益生菌治疗(94年,95年)和微生物移植(96年- - - - - -99年胃肠道疾病。

LEfSe,生物类的计算方法比较详细,从而导致微生物群落和导游的理解生物学家在检测小说宏基因组生物标志物。算法的有效性一直在强调真实和合成数据几个实验中,我们成功地在多个上下文中host-associated微生物群和环境微生物的特征。支持持续的宏基因组分析,我们实现了LEfSe友好的web应用程序,它可以提供原始数据和publication-ready图形化的结果,包括报告检测到微生物变化分类树的视觉和生物学上的总结。LEfSe在线免费银河系中工作流框架(46,47在以下链接()48]。

LEfSe算法在结果部分,介绍了概述和图6详细说明的格式输入(一个矩阵n行和米列)和执行的三个步骤计算工具:千瓦等级和测试(49)类,成对Wilcoxon测试(50,51不同的类的子类之间),LDA (52在相关的特性。

每一个n特性是用positive-valued向量表示包含其丰度米样本,每个样本与价值观描述它的类,可选地,子类和/或原始主题。阶乘KW等级和测试应用于每个特性对类因素;子类和主题信息作为分层子组当礼物。特性,根据KW等级和测试,不违反类间的零假设相同的值分布(违约P价值,α= 0.05)没有进一步分析。成对Wilcoxon测试应用于保留特性属于不同的类的子类。对于每个功能,成对Wilcoxon测试是不满意如果至少有一个比较有一个子类P价值高于选择α或者变异是不等于的符号在所有比较。例如,如果一个功能出现在两类样本三个子类,子类之间的所有九个比较在不同的类必须违反零假设,和所有的迹象中位数之间的差异必须是一致的。通过成对Wilcoxon测试的功能被认为是成功的生物标志物。LDA模型最终建立与类作为因变量,其余特性值,子类和主题值作为独立的变量。这个模型被用来估计的影响大小,所获得的平均差异类方法(使用修改的特性值)与类之间的差异意味着沿着线性判别第一轴,这同样重量特性的可变性和歧视性的能力。LDA得分为每个生物标志物得到计算这个值的对数(基地10)缩放后的[1,10⁶]区间,不管LDA的绝对值分数,它引发的排名生物标志物的相关性。鲁棒性,LDA另外支持引导(默认30倍)和随后的平均。

LEfSe的前两个步骤采用非参数测试,因为宏基因组数据的性质。相对丰度,在大多数情况下,违反的主要假设的典型参数测试(正常人群在每个类),而非参数测试更健壮的潜在分布数据,因为他们是传播变为免费的方法。唯一Wilcoxon和千瓦测试的假设是,每个类的分布是相同的形状可能不同的中位数。例如,有机体违反的双峰或多峰丰度分布参数测试的假设,而不是那些非参数测试,除非数量的峰值分布(或者更普遍,分布)的形状也改变类之一。LDA用于效应值估计作为我们的实验确定方法相比它更准确地估计生物一致性组的差异意味着/中位数或支持向量机(svm) [One hundred.]。比较LDA和SVM方法对效应值估计的低吞吐量的小鼠溃疡性结肠炎模型(生物验证生物标记中可用的67年])是我们补充材料(附加文件报告8和9),显示了LDA的优势对upranking特性的潜在生物的兴趣。从理论上讲,这是出于LDA的能力找到最高的方差和支持向量机的轴的关注特性结合预测能力而不是单一特征的相关性。注意,当我们执行类比较而不是类预测,值得说明的是,效果估计精度的算法不是直接连接的预测能力(例如,支持向量机方法通常被认为是比LDA预测更准确)。

多级策略

比较以上两类需要特殊的策略应用Wilcoxon和LDA的步骤,而阶乘千瓦测试已经适合此设置。我们多级战略Wilcoxon测试取决于问题特定的策略选择的用户定义特征分布在不同n类。在最严格的策略中,我们要求所有n丰富的功能在统计上显著不同的在所有n类。实现这一策略,称为“严格”,要求所有Wilcoxon测试类之间是显著的。更宽松的策略,称为“非严格”,认为作为生物标志物特征如果至少有一个类是明显不同于其他所有人。更宽松的策略只需要满足的一个子集Wilcoxon测试。无论战略,LDA一步总得分最高的检测报告在所有两两类比较。

子类结构变体编码不同生物假说

生物标记类的不同的解释比较问题实现LEfSe通过修改要求成对Wilcoxon子类之间的比较。如果类包含子类代表不同的地层,我们只测试比较在每个子类(图相同4)。例如,评估治疗的效果在两个子类型相同的疾病,我们比较预处理和后处理的水平在每个子类和要求趋势观察到子类的类级别的独立是很重要的。要实现此变体,LEfSe执行Wilcoxon一步只比较具有相同名称的子类。另外,子类可能代表的功能水平可能不同但反是的问题没有规定明确的分层(图2)。在这两个设置,我们明确地要求所有成对比较拒绝零假设检测生物标志物;因此,不需要多个测试修正。

子类包含几个样品

当几个样品,非参数测试像Wilcoxon减少了功率检测的差异。这可以影响LEfSe当子类非常小,防止整体测试甚至拒绝零假设。出于这个原因,小子类应该避免在可能的情况下,例如,通过将他们排除在问题或组成的所有子类与小的基数。的情况下,删除或分组子类是不可能的或破坏了生物的一致性分析,LEfSe替代品Wilcoxon测试和一个测试来比较是否子类中位数不同预期的迹象。用户可以选择这个值比较的子类基数阈值代替Wilcoxon测试。

参数设置

除了结果,如上所述,否则所有本研究实验运行与LEfSeα为成对测试参数设置为0.05测试,正常类和子类和阈值的对数得分LDA分析被设置为2.0。这些参数的严格很容易可调(也通过web接口),允许用户检测较低的生物标志物P值和/或更高的效果,例如,要优先考虑额外的生物实验和验证。LDA的分数都是由引导30多个周期,每个采样三分之二的数据替换,LDA的最大影响系数LDA得分三个数量级。

数据描述

除了如上所述否则,分类丰度为16 s样本过滤产生的序列读取使用RDP分类器(101年与信心低于80% rebinned],“不确定”。下面描述的数据集,最后输入LEfSe是一个矩阵的相对丰度从读计数与每个样本归一化和获得。Witten-Bell平滑(102年)是用来容纳罕见的类型,但由于LEfSe的非参数方法,这微小的影响发现生物标志物和LDA得分。这也使得我们的生物标志物的发现方法来避免大多数序列质量问题的影响,只要任何排序偏差在不同条件下均匀,没有特定的假设上的统计分布和噪声模型是由算法作为非参数方法是标准的。

人类微生物组的数据

正常的16 s rRNA-based phylometagenomic数据集(健康)人类微生物组是通过人类微生物组计划(13),由454名FLX钛序列生成V3 V5变量地区获得301年样本24名健康受试者(12男,12女性)进入一个临床网站在休斯顿,TX。这些样本涵盖18个不同的网站,包括6个主体网站类别:口腔样本(9),肠道示例(1),阴道(3)样品,retroauricular折痕(2)样品,鼻腔(1样本)和皮肤(2)样品。详细协议用于注册、抽样、DNA提取、16 s扩增和测序人类微生物组项目数据分析和协调中心的网站(103年),和在别处也有描述55,56]。总之,基因组DNA分离使用莫生物PowerSoil工具包(104年)和接受16 s放大使用引物设计结合FLX钛适配器和样本条形码序列,使定向测序覆盖变量地区V5部分V3(引物:357 f 5“-CCTACGGGAGGCAGCAG-3”和926 r 5“-CCGTCAATTCMTTTRAGT-3”)。产生的序列处理使用数据管理管道中实现mothur [41),减少了测序错误率小于0.06%,模拟社区进行验证。作为管道参数的一部分,通过最初的质量控制步骤,一个明确的不匹配样本条形码和两个错配PCR扩增引物是允许的。序列与一个模棱两可的基地打电话或均聚物超过八个核苷酸在随后的分析中删除,正如前面提出的(105年]。基于提供的质量分数,所有序列都修剪基地调用时得分低于20是遇到了。所有序列都使用NAST-based序列一致对准器自定义参考基于席尔瓦对齐(106年,107年]。序列的短于200个基点,或者不一致预期的地区参考对齐被移除的进一步分析。嵌合序列被确定使用mothur ChimeraSlayer算法的实现(108年]。独特的读取与MSU RDP分类器分类v2.2 [58)使用提出的分类(109年),在RDP维持(RDP 10数据库版本6)。16 s rRNA读取序列中的可用阅读档案在[110年]。

T-bet^{- / -}×Rag2^{- / -}和Rag2^{- / -}鼠标数据

T-bet^{- / -}×Rag2^{- / -}和Rag2^{- / -}老鼠,他们的饲养,他们的食物被描述在67年]。动物研究和实验,根据哈佛大学的批准和开展动物常务委员会以及美国国立卫生研究院的指导方针。收集、处理和提取的粪便样本中的DNA进行描述(67年]。16 s rRNA的版本5和版本6的区域基因与纠错条形码针对放大和多路复用焦磷酸测序。测序进行使用罗氏FLX基因组定序器DNAVision(该市,比利时)和数据预处理去除序列与低质量分数。有7579±2379高质量的16 s读取/样本平均读278个基点的长度。

病毒和微生物环境数据

我们从网上检索的补充材料69年]80基因组(42 viromes, 38微生物)。我们确定了三个环境包含至少7样品和分组成珊瑚,hyper-saline,和海洋子类;第四个子类,其他组所有环境很少有样品。

婴儿和成人微生物组的数据

九成人的齿轮配置文件和四个还在吃奶的婴儿肠道菌群是获得的补充材料73年)和修改的在这项研究中使用。

合成数据集

我们建立了三个集合的人工数据集为了比较LEfSe千瓦和Metastats。所有数据集有1000特性和100个样本属于均匀两类,并从高斯正态分布采样的值。两个类中的样本进一步分为4个子类(两类)与平等的基数。1000功能,500因此跨类和特性有不同的手段应该作为生物标志物检测(优点),其他500个特性是均匀分布在类或至少一个子类中两类和不应该被歧视(负功能)。评估方法评估假阳性率(生物标记对发现的错误数的总数特性)和假阴性率(数量的正确检测到non-discriminant功能特性的总数,即敏感性)。这三个数据集的集合(图形如图5)不同子类中的值的分布和正态分布的均值/标准差。(一)子类在相同的类具有相同的参数(因此子类组织是没有意义的)。消极的特性都有μ= 10000和σ= 100,而积极的特性的一个类μ= 10000 - t(σ= 100),另一个μ= 10000 + t(σ= 100),t是一个参数从1到150。所有方法的性能评估在t参数的常规步骤。(b)数据集在这个集合中定义一样收集与t = 1000(一个),但所有的数据集和σ从1000年到10000年不等。(c)负类分布在第三组有不同的子类。特别是,第二个子类的第一个类有相同意思的第一个第二个类的子类。另外两个子类有不同的手段(μ= 10000 - t和μ= 10000 + t, t = 1000),但功能是不考虑微分自子类之间的区别是不一致的。积极的特性是相同的方式定义数据集(b)。

该方法的实现和可用性

LEfSe在Python实现,利用R统计职能的硬币(111年)和质量(112年]rpy2图书馆通过[113年)和matplotlib (114年库的图形输出。银河系中LEfSe提供图形界面框架(46,47),它允许用户选择参数(主三紧缩参数、多级设置和其他计算,统计,和图形喜好),模块间的管道数据在一个工作流框架中,生成可发布图形输出,并将这些结果与其他统计和宏基因组分析。LEfSe可用在[48]。

英国石油公司:

碱基对

千瓦:

克鲁斯卡尔-沃利斯

LDA:

线性判别分析

LEfSe:

线性判别分析效应大小

聚合酶链反应:

聚合酶链反应

RDP:

核糖体数据库项目

支持向量机:

支持向量机。

我们要感谢整个人类微生物组项目财团,包括四个测序中心(Broad研究所,华盛顿大学,贝勒医学院和J Craig Venter研究所),相关调查人员从许多额外的机构,和美国国立卫生研究院办公室主任路线图计划。这部分工作是支持由格兰特DE017106国家牙科和颅面研究所(JI)、国家卫生研究院的基金AI078942 (WSG)和布罗Wellcome基金(WSG),是由国立卫生研究院1 r01hg005969 CH。

作者和联系

1. 生物统计学、哈佛大学公共卫生学院,亨廷顿大街677号,波士顿,MA, 02115年,美国

   尼古拉Segata,利未沃尔德伦,拉里萨Miropolsky &柯蒂斯Huttenhower

2. 分子遗传学、福赛斯研究所第一街245号,剑桥,妈,02142年,美国

   雅克·伊泽德

3. 口腔医学、感染和免疫,哈佛大学牙科学院的医学、洛伍德大街188号,波士顿,MA, 02115年,美国

   雅克·伊泽德

4. 微生物测序中心,麻省理工和哈佛,剑桥7中心,剑桥,妈,02142年,美国

   Gevers德克

5. 免疫学和传染病,哈佛大学公共卫生学院的亨廷顿大街665号,波士顿,MA, 02115年,美国

   温迪年代加勒特

6. 医学系、哈佛医学院、波士顿,MA,弗朗西斯街75号02115,美国

   温迪年代加勒特

7. 医学肿瘤学部门,丹娜-法伯癌症研究所,44 Binney则街,妈,02215年,美国

   温迪年代加勒特

相应的作者

对应到柯蒂斯Huttenhower。

作者的贡献

NS和CH构思研究;NS和LM方法实现;NS:霁:LW: DG: WG和CH分析结果;NS:霁:LW: DG: WG和CH写手稿。所有作者阅读和批准了手稿的最终形式。

再版和权限