炎症性肠病中肠道菌群的功能障碍及其治疗gydF4y2Ba

背景gydF4y2Ba

炎症性肠病(IBD)、克罗恩病和溃疡性结肠炎是由肠道微生物和免疫系统的改变引起的。然而，在IBD期间，胃肠道微生物代谢的确切功能障碍仍不清楚。我们通过16S基因焦焦测序分析了231例IBD和健康受试者的肠道活检和粪便样本的微生物区系，并使用鸟枪宏基因组学对一个子集进行了随访。基于系统发育相关参考基因组的16S数据评估基因和途径组成，并使用稀疏多元线性建模将其与药物、环境因素和IBD状态联系起来。gydF4y2Ba

结果gydF4y2Ba

厚壁菌门和肠杆菌科丰度与疾病状态如预期的一样相关，但也与治疗和受试者特征相关。然而，微生物的功能比组成受到的干扰更一致，12%的分析通路发生了变化，而属的变化仅为2%。我们发现了氧化应激途径的主要变化，以及碳水化合物代谢和氨基酸生物合成的减少，有利于营养物质的运输和吸收。回肠克罗恩病的微生物组明显增加毒性和分泌途径。gydF4y2Ba

结论gydF4y2Ba

这一推断出的功能宏基因组信息为支持IBD发病机制的全社区微生物过程和途径提供了第一次洞察。gydF4y2Ba

炎症性肠病(IBD)是胃肠道(GI)的一种慢性和复发性炎症状态，与人类肠道的微生物群落密切相关。尽管现在人们普遍认为IBD是由肠道微生物和肠道免疫系统之间的相互作用改变引起的，但IBD中肠道微生物功能紊乱的确切性质仍有待阐明[gydF4y2Ba1gydF4y2Ba］．IBD还包括两种主要亚型，溃疡性结肠炎(UC)和克罗恩病(CD)，每种亚型都包括不同的微生物干扰和组织定位。前者局限于结肠，而后者可能影响消化道的任何部分，尚不清楚微生物是否参与其中或两者之间的因果关系[gydF4y2Ba2gydF4y2Ba］．特别是，胃肠道微生物群在IBD发病中的作用及其在积极治疗和恢复过程中的改变的微生物机制和代谢仍不清楚。gydF4y2Ba

在过去的十年中，DNA测序技术的进步使我们能够探索40%尚未培养的肠道微生物群[gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba]，为IBD菌群的研究奠定了基础。健康人的胃肠道微生物群主要由四门细菌门组成:厚壁菌门、拟杆菌门、变形菌门和放线菌门[gydF4y2Ba4gydF4y2Ba，gydF4y2Ba5gydF4y2Ba］．许多研究已经观察到IBD患者胃肠道微生物群的失衡或失调[gydF4y2Ba6gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba13gydF4y2Ba];乳糜泻和UC患者的生物多样性降低，厚壁菌门(Firmicutes)比例降低，γ变形菌门(Gammaproteobacteria)增加[gydF4y2Ba14gydF4y2Ba］．在乳糜泻中，梭状芽胞杆菌的比例发生改变gydF4y2BaRoseburiagydF4y2Ba而且gydF4y2BaFaecalibacteriumgydF4y2BaLachnospiracae和Ruminococcaceae的属减少，而gydF4y2Ba瘤胃球菌属gnavusgydF4y2Ba增加(gydF4y2Ba15gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba17gydF4y2Ba］．uc相关生物异常的具体特征描述较少，尽管已经报道了硫酸盐还原型三角洲变形菌的增加[gydF4y2Ba18gydF4y2Ba，gydF4y2Ba19gydF4y2Ba］．这些研究描述了IBD肠道群落组成的典型变化，但这些有机体的功能角色——或整个不良生物群落的功能角色——仍不清楚。gydF4y2Ba

正常肠道微生物群显示出巨大的功能多样性，编码的细菌基因数量是人类基因集的100多倍[gydF4y2Ba4gydF4y2Ba，gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba］．因此，人类微生物组的基因组潜力远远大于宿主，影响宿主的治疗、饮食或药物也可能影响微生物组。微生物群对宿主健康的重要性的一个主要例子是在膳食纤维的消化过程中，膳食纤维被下消化道的微生物群用作主要能量来源[gydF4y2Ba21gydF4y2Ba］．纤维溶菌将多糖分解成更小的碳水化合物，然后发酵成短链脂肪酸(SCFAs)，如醋酸酯、丙酸和丁酸。丁酸盐是结肠细胞的主要能量来源，但这三种物质都具有免疫调节的特性[gydF4y2Ba22gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba27gydF4y2Ba］．除了这些代谢功能，许多关于IBD的遗传研究都强调了宿主-微生物相互作用在IBD发病机制中的核心作用[gydF4y2Ba1gydF4y2Ba，gydF4y2Ba28gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba30.gydF4y2Ba］．IBD中与微生物反应相关的特定宿主途径包括T细胞激活、IL-23/T辅助因子17途径、自噬[gydF4y2Ba31gydF4y2Ba]， Paneth细胞功能[gydF4y2Ba32gydF4y2Ba］．总之，这些结果支持了宿主-微生物群串扰在肠道内稳态中的中心地位，反过来也支持了宿主和胃肠道微生物群之间的功能失调串扰在IBD中的作用。gydF4y2Ba

在人类宿主IBD的发病机制、个体微生物和IBD中胃肠道微生物群落代谢变化之间的差距还很少有研究。很少有关于IBD肠道微生物组的研究调查了微生物组的功能[gydF4y2Ba33gydF4y2Ba]，这些研究没有系统地考虑到处理和环境因素的影响。因此，我们分析了121名CD患者、75名UC患者和27名健康对照的胃肠道微生物群，使用了一种新的多变量宏基因组分析管道，特别考虑了环境因素(包括治疗、年龄和烟草使用)。除了评估微生物组组成外，我们还分析了从系统发育相关参考基因组中推断的宏基因组，包括与疾病状态和环境因素(如药物和吸烟)相关的代谢模块和途径。这些胃肠道微生物群不仅以疾病期间细菌种群的变化为特征，而且这些生物异常在功能上高度协调。跨物种富集包括通过谷胱甘肽转运、半胱氨酸生物合成和核黄素代谢的粘蛋白代谢和氧化还原耐受。相反，与枝IV和XIVa梭状芽孢杆菌广泛相关的过程被耗尽，特别是短链脂肪酸的产生。IBD中的异常不只是肠道菌群的结构变化，而是与许多基本微生物代谢功能的重大损伤相关，并对宿主产生潜在影响。gydF4y2Ba

为了测量健康和IBD患者肠道菌群的组成和功能差异，我们从大洋州克罗恩病和结肠炎地区登记处(OSCCAR)和MGH IBD研究的前瞻性登记处(PRISM)数据库中收集了231份粪便和活检样本。OSCCAR是一个基于州的前瞻性IBD初始队列，PRISM是一个基于转诊中心的前瞻性IBD队列(见材料和方法)。样本包括136个粪便标本和95个结肠或小肠活检，来自121名CD患者，75名UC患者，27名健康对照和8名不确定(表gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)．除了性别和年龄等一般信息外，我们还从每个受试者中收集了有关疾病特征(地形、哈维-布拉德肖指数(HBI)和单纯性结肠炎活性指数测量的疾病活性)、治疗(抗生素、皮质类固醇、美沙拉明、免疫抑制剂)和环境暴露(烟草使用)的数据并进行分析。从粪便样本和活检标本中提取DNA，用454技术对16S rRNA基因进行扩增和测序。然后用特定的gydF4y2Ba在网上gydF4y2Ba用于序列清理和系统型分配的管道(参见材料和方法)。在这个过程结束时，平均测序深度为每个样本2,860次读取。这些数据首先通过与之前工作的比较得到验证，总结了之前观察到的IBD过程中微生物群落组成的变化，并将一些变化归因于宿主治疗或环境。随后，他们与参考基因组相关联，以发现与疾病相关的微生物功能和代谢的调节。11个样本(7个健康样本，4个CD样本)使用Illumina MiSeq平台进行全基因组鸟枪测序，每个样本平均深度为119个巨核苷酸，以确认这些功能推断。gydF4y2Ba

评估微生物组结构与宿主IBD状态、治疗和环境的显著协变gydF4y2Ba

我们使用稀疏多元统计方法将疾病表型与微生物组结构和功能联系起来，同时考虑潜在的相关因素和混杂因素，如治疗或吸烟。首先使用boost选择与每个分支潜在相关的元数据特征，然后使用带有错误发现率校正的多元线性模型评估这些关联的重要性(参见材料和方法)。我们首先调查了微生物支系与IBD的关联，以及我们队列的特征，测试了从属到门水平的所有可用元数据和支系。对样本和宿主状态之间的总体关系进行排序，揭示了几种与微生物组共同变化的环境因素的主要组合(图gydF4y2Ba1gydF4y2Ba；额外的文件gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)．例如，UC在该人群中与美沙拉明治疗协变，而乳糜泻患者更多的是通过活检评估，用免疫抑制剂治疗和富集gydF4y2Ba埃希氏杆菌属gydF4y2Ba．疾病亚型中微生物组组成的相似性反映了以前观察到的相似性[gydF4y2Ba34gydF4y2Ba，gydF4y2Ba35gydF4y2Ba]，回肠CD (iCD)是一个强大的外群，UC是一个通常不太极端的微生物表型(与健康受试者的差异较小)，而非iCD是微生物组配置的广泛分布。gydF4y2Ba

在我们剩下的分析中，一个重要的考虑因素是疾病状态、受试者环境方面和微生物组结构之间的一致的共变异，这在微生物组的研究中经常被忽视。例如，与微生物组组成变化最相关的因素不是疾病，而是样本来源是粪便还是活检。活检定位引起微生物组组成的微小变化gydF4y2Ba2gydF4y2Ba，gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba而且gydF4y2Ba4gydF4y2Ba)相对于粪便和活检群体之间的极端差异，这与之前的研究一致[gydF4y2Ba36gydF4y2Ba，gydF4y2Ba37gydF4y2Ba］．在这个队列中，iCD总是通过活检来代表，而18.4%的非iCD和36%的UC样本是通过活检。iCD也与更大的免疫抑制剂治疗可能性相关:iCD、非iCD和UC患者分别在74.4%、19.2%和16%的样本中接受免疫抑制剂治疗。相比之下，非iCD和UC病例更倾向于使用美沙拉明或抗生素:30.2%的iCD病例使用美沙拉明，69.2%的非iCD病例使用美沙拉明，77.3%的UC病例使用抗生素，2.3%的iCD病例使用抗生素，17.9%的非iCD病例使用抗生素，13.3%的UC病例使用抗生素。这些关联导致了一系列非独立的协变量。尽管疾病活动可能影响微生物组组成，但在调整了其他因素后，在我们的分析中，它与微生物组组成的特定变化没有独立关联，而且没有显著的(gydF4y2BaPgydF4y2Ba< 0.01)微生物组组成与性别之间的关系gydF4y2Ba5gydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

第二个影响微生物组组成的独立因素是年龄，而年龄本身与吸烟呈负相关(图gydF4y2Ba1gydF4y2Ba；额外的文件gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)．24人(10.4%)年龄小于18岁，26人年龄大于或等于60岁。衰老与微生物群的持续变化有关，主要是微生物群的逐渐减少gydF4y2Ba双歧杆菌属gydF4y2Ba如图所示(附加文件gydF4y2Ba6gydF4y2Ba)及其他[gydF4y2Ba38gydF4y2Ba，gydF4y2Ba39gydF4y2Ba］．在观察了这些疾病、治疗、环境和肠道微生物组组成之间的总体共变模式后，我们仅在以多变量方式评估了微生物-疾病关联的重要性，以解释宿主环境和治疗后才继续进行分析。gydF4y2Ba

IBD中特异性丰富的微生物分支包括玫瑰菌属、瘤胃球菌科和肠杆菌科gydF4y2Ba

在调整了这些协变量后，我们确定了健康和IBD受试者之间微生物支的丰度显著不同(图gydF4y2Ba2gydF4y2Ba；额外的文件gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)．这考虑了年龄、吸烟和治疗因素(免疫抑制剂、皮质类固醇、美沙拉明、抗生素)，以及采样时的疾病活动性和样本类型(粪便或活检)。两个genus-level phylotypes,gydF4y2BaRoseburiagydF4y2Ba而且gydF4y2BaPhascolarctobacteriumgydF4y2Ba， UC和CD均显著降低，而gydF4y2Ba梭状芽胞杆菌gydF4y2Ba增加，错误发现率q < 0.2。gydF4y2BaRoseburiagydF4y2Ba是枝XIVa梭状芽胞杆菌，因此与肠道中抗炎调节T细胞的产生有关[gydF4y2Ba40gydF4y2Ba］．培养gydF4y2BaRoseburiagydF4y2Ba被描述为醋酸酯利用剂和丁酸生产剂[gydF4y2Ba41gydF4y2Ba),而培养gydF4y2BaPhascolarctobacteriumgydF4y2Ba是否完全是琥珀酸的消费者，与之共培养产生丙酸gydF4y2BaParaprevotellagydF4y2Ba［gydF4y2Ba42gydF4y2Ba］．因此，ibd相关的减少gydF4y2BaRoseburiagydF4y2Ba而且gydF4y2BaPhascolarctobacteriumgydF4y2Ba可能反映丁酸和丙酸产量的下降。gydF4y2Ba

产生醋酸酯的瘤胃球菌科[gydF4y2Ba43gydF4y2Ba，而产生醋酸盐和乳酸盐的Leuconostocaceae [gydF4y2Ba44gydF4y2Ba]， UC降低。对乳糜泻有特异性丰度显著增加的唯一主要分支是肠杆菌科gydF4y2Ba大肠杆菌、志贺氏杆菌gydF4y2Ba．该家族先前与肠道炎症有关[gydF4y2Ba6gydF4y2Ba，gydF4y2Ba45gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba47gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

克罗恩病累及回肠表现出明显的微生物表型，包括粪杆菌和臭杆菌在iCD和结肠UC中均减少gydF4y2Ba

在有回肠受累的乳糜泻患者中，瘤胃球菌科和的序列gydF4y2BaFaecalibacteriumgydF4y2Ba尤其是与其他受试者相比显著减少(图gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)，证实了先前的研究[gydF4y2Ba48gydF4y2Ba，gydF4y2Ba49gydF4y2Ba］．gydF4y2BaFaecalibacterium prausnitziigydF4y2Ba唯一有文化的代表gydF4y2BaFaecalibacteriumgydF4y2Ba，能够从肠道粘液中代谢膳食来源的多糖和宿主来源的底物，如n -乙酰氨基葡萄糖[gydF4y2Ba50gydF4y2Ba］．它也是丁酸盐的主要生产者，在结肠炎的情况下表现出抗炎作用[gydF4y2Ba51gydF4y2Ba］．瘤胃球菌是微生物相关碳水化合物代谢的第一步，因为它们降解下消化道的几种多糖，包括淀粉、纤维素和木聚糖[gydF4y2Ba21gydF4y2Ba］．的gydF4y2BaRoseburiagydF4y2Ba属，在所有IBD患者(包括iCD)中显著减少，和瘤胃球菌科进一步的功能联系在一起，后者消耗氢和产生醋酸盐，可被利用gydF4y2BaRoseburiagydF4y2Ba生产丁酸[gydF4y2Ba41gydF4y2Ba，gydF4y2Ba43gydF4y2Ba］．因此，所有这些分支的持续减少可能会对宿主修复上皮细胞和调节炎症的能力产生功能后果。gydF4y2Ba

的属gydF4y2Ba大肠杆菌、志贺氏杆菌gydF4y2Ba(作为一种16s的系统型难以区分)在iCD中特别富集(q < 0.2;额外的文件gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)高于乳糜泻患者的过量含量。革兰氏阴性菌产生的脂多糖如gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2Ba是一种典型的微生物相关分子模式，已知可激活toll样受体4 (TLR4)信号通路[gydF4y2Ba52gydF4y2Ba从而引发炎症级联反应。IBD患者肠上皮组织中TLR4表达高度上调[gydF4y2Ba53gydF4y2BaTLR4突变与乳糜泻和UC均相关[gydF4y2Ba54gydF4y2Ba］．之前基于文化的研究已经发现gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2Ba,特别是gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2Ba表现出粘附和侵入等病原体样行为[gydF4y2Ba55gydF4y2Ba]，更频繁地从iCD活检中培养，培养独立研究发现在gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2Ba含有iCD中毒性相关基因的[gydF4y2Ba6gydF4y2Ba］．这表明cd受累的回肠是一个良好的环境建立gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2Ba这可能与IBD的恶化及其慢性有关。炎症的回肠可能提供一个专门的生态位，允许在炎症条件下增强适应性的微生物。gydF4y2Ba

UC最严重的形式是肠炎，UC影响整个结肠;这种情况会大大增加患结肠癌的风险[gydF4y2Ba56gydF4y2Ba］．胰腺炎患者在其生物失调中没有明显的特异性。然而，这些患者和iCD患者的gydF4y2BaOdoribactergydF4y2Ba属于卟啉单胞菌科和拟杆菌门。作为gydF4y2BaOdoribacter splanchnusgydF4y2Ba是已知的醋酸盐、丙酸盐和丁酸盐的生产者[gydF4y2Ba57gydF4y2Ba),减少gydF4y2BaOdoribactergydF4y2Ba可能通过减少SCFA的可用性影响宿主炎症。gydF4y2Ba

微生物组组成也与受试者年龄、治疗、吸烟和样本生物地理密切相关gydF4y2Ba

在识别IBD特异性菌群扰动的过程中，我们的多元模型同时分析了环境和治疗因素对胃肠道微生物群落的影响，其差异之大令人惊讶(见图中的选择)gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba；在附加文件中完成数据gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)．我们观察到年龄增加和年龄减少之间有显著的相关性gydF4y2Ba双歧杆菌属gydF4y2Ba(附加文件gydF4y2Ba6gydF4y2Ba)．在这个队列中，厚壁菌门也显著减少，而拟杆菌门随着年龄的增长而增加gydF4y2Ba1gydF4y2Ba）;这与之前的研究结果一致[gydF4y2Ba38gydF4y2Ba，gydF4y2Ba39gydF4y2Ba，并可能反映随年龄增长而发生的饮食或体重相关变化，这些变化在这些受试者中没有直接测量，或宿主代谢变化[gydF4y2Ba58gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

对于确定IBD和肠道微生物组之间的因果关系至关重要的是，IBD治疗还与微生物组组成的改变有关。美沙拉明(5-氨基水杨酸)是一种肠道特异性氨基水杨酸药物。尽管其确切的作用模式尚不清楚，但它被认为是一种抗氧化剂，并减少肠道炎症，部分原因是通过激活过氧化物酶体增殖物激活受体-γ (PPARγ)，抑制NFκB和促炎类二十烷素的产生。在这里，它的使用与强烈的减少有关gydF4y2Ba大肠杆菌、志贺氏杆菌gydF4y2Ba(> 100%平均丰度，q < 0.04;额外的文件gydF4y2Ba7gydF4y2Ba)，与最近的一项研究结果一致[gydF4y2Ba59gydF4y2Ba］．5-氨基水杨酸和免疫抑制剂治疗均与轻度增加相关gydF4y2Ba肠球菌gydF4y2Ba，是免疫抑制剂治疗患者中唯一错误发现率低的干扰属(>为平均丰度的100%，q < 0.09)。gydF4y2Ba

抗生素是与生态多样性减少相关的最强因素之一gydF4y2Ba2 bgydF4y2Ba)．在使用抗生素后，许多个体支链大大减少或几乎消失，包括gydF4y2Bacollinsela, doria, butyriccoccus, subdoligulumgydF4y2Ba,gydF4y2BaAcetivibriogydF4y2Ba(所有q < 0.2;额外的文件gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)．这些属主要来自梭状芽胞杆菌目、革兰氏阳性和厌氧菌，它们是IBD中常用的抗生素(如环丙沙星和甲硝唑)的目标。gydF4y2Ba

吸烟可能是影响炎症性肠病的最著名的环境因素[gydF4y2Ba60gydF4y2Ba］．它与乳糜泻风险的增加有关，相反对UC的发展具有保护作用[gydF4y2Ba61gydF4y2Ba］．在这些个体中，与烟草使用有关的唯一常见有机体是gydF4y2BaAnaerostipesgydF4y2Ba(厚壁菌门)，减少(> 60%平均丰度，q < 0.15;数字gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba)对当前或曾经吸烟的人的影响，而不是单纯由于吸烟者的平均年龄较高而造成的任何变化。的gydF4y2BaAnaerostipesgydF4y2Ba属可利用乳酸生产丁酸[gydF4y2Ba62gydF4y2Ba，这对结肠健康有益。gydF4y2Ba

最后，如前所述，粪便样本与粘膜活检在微生物组组成上存在很大差异(附加文件gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)．与活检相比，在q < 0.2时，粪便样本中有超过70个分支明显富集或富集不足。这种效应扩展到整个门，因为厚壁菌门在粪便中的数量大约是原来的两倍gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)．微生物生境决定了微生物群落的组成[gydF4y2Ba36gydF4y2Ba];在胃肠道中，这已被认为发生在肠道区域的生物地理尺度上[gydF4y2Ba37gydF4y2Ba，gydF4y2Ba63gydF4y2Ba甚至相差几毫米[gydF4y2Ba64gydF4y2Ba，gydF4y2Ba65gydF4y2Ba]，结肠镜检查前的肠道准备可能进一步干扰腔内/粘膜的差异[gydF4y2Ba66gydF4y2Ba］．数据并不表明管腔和黏膜群落是独立的;相反，当按样本起源分层时，与IBD显著相关的所有14个分支都保持了相同的趋势gydF4y2Ba8gydF4y2Ba)．粪便微生物组似乎传递了一种一致的但在数量上转变的黏膜群落功能，这两种功能的组成都与宿主环境、治疗和疾病有关。gydF4y2Ba

通过对不同地区的活组织切片所反映的肠道生物地理学的进一步分析，大多数分支的差异是适度的，并与之前描述的pH值变化密切相关(附加文件gydF4y2Ba2gydF4y2Ba，gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba而且gydF4y2Ba9gydF4y2Ba) [gydF4y2Ba67gydF4y2Ba］．区域变化最大的演化枝包括gydF4y2BaRoseburiagydF4y2Ba瘤胃球菌科，在低ph值回肠末端、横结肠和右结肠中丰度较低;gydF4y2BaAlistipesgydF4y2Ba，遵循类似的模式;和gydF4y2BaFusobacteriagydF4y2Ba肠杆菌科，以相反的模式，在回肠和右结肠的丰度有所增加。特别是前者在之前的研究中也与结直肠癌微环境有关[gydF4y2Ba68gydF4y2Ba，gydF4y2Ba69gydF4y2Ba]，值得注意的是，微生物区系中与生物地理和pH值相关的这些变化与我们在IBD和潜在氧化还原状态方面观察到的变化类似，详见下文。gydF4y2Ba

在IBD中，微生物代谢途径的宏基因组丰度比生物体丰度受到更一致的干扰gydF4y2Ba

我们将群落组成与京都基因与基因组百科全书(KEGG)编目中的1200多个注释基因组相结合，继续我们的分析[gydF4y2Ba70gydF4y2Ba］．在每个可用的参考基因组中注释的基因被用来为每个群落提供一个近似的基因目录(参见材料和方法)，我们将其重建为代谢途径(图gydF4y2Ba4gydF4y2Ba)和更小的模块和生物过程(图gydF4y2Ba5gydF4y2Ba；额外的文件gydF4y2Ba10gydF4y2Ba)如上文所述[gydF4y2Ba71gydF4y2Ba］．然后，利用评估微生物丰度的相同稀疏多元模型，将途径、模块和过程丰度与疾病和宿主环境相关联(附加文件)gydF4y2Ba11gydF4y2Ba，gydF4y2Ba12gydF4y2Ba而且gydF4y2Ba13gydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

仅考虑IBD (CD或UC)与健康受试者的对比，200个总代谢模块中有24个(12%)在q < 0.2时差异丰富。这与上面讨论的微生物转移形成鲜明对比，在263个属级别的分支中，只有6个(2%)达到了这一显著性阈值。即使没有宏基因组或元转录组数据，仅利用与这些群落相关的参考基因组中的基因和途径，微生物功能的变化比群落结构的变化更一致。环保团体已经注意到这一点[gydF4y2Ba72gydF4y2Ba，并建议在肥胖和其他生物识别方面[gydF4y2Ba73gydF4y2Ba，gydF4y2Ba74gydF4y2Ba]，但到目前为止，还没有关于疾病相关的失调或IBD的报道。gydF4y2Ba

我们通过霰弹枪宏基因组测序对一小部分具有适当粪便DNA的样本、7名健康对照组和4名乳糜泻患者进行了验证gydF4y2Ba14gydF4y2Ba)．测序深度较浅，平均每150个核苷酸对端Illumina MiSeq reads样本119个巨核苷酸，降低了我们的有效检测极限，但在其他方面与推测的IBD宏基因组的代谢转移非常一致。下面和图中突出显示的模块gydF4y2Ba5gydF4y2Ba其中一种(钴胺素生物合成)低于检测限度，其余六种在克罗恩病中保持了预期的过度或不足富集趋势，下文详细介绍的其他过程，包括糖酵解和细菌分泌也是如此。gydF4y2Ba

IBD菌群中的氨基酸合成和碳水化合物代谢减少，有利于营养物质的吸收gydF4y2Ba

我们观察到，在UC和CD中，甚至基本的胃肠道微生物组代谢都发生了改变。氨基酸代谢出现了主要的扰动:几乎所有氨基酸(特别是组氨酸和赖氨酸)的代谢和生物合成基因的丰度都降低了(图)gydF4y2Ba4gydF4y2Ba)，而精氨酸，组氨酸和赖氨酸的转运(图gydF4y2Ba5gydF4y2Ba)基因丰度增加。在iCD中，我们还观察到谷氨酸相关功能模块的减少，这将导致γ -氨基丁酸、鸟氨酸和精氨酸生物合成所需的谷氨酸减少;这三个模块的丰度也下降了。与其他氨基酸相比，含硫氨基酸半胱氨酸代谢基因的丰度显著增加，iCD的增加幅度更大。这与UC和CD中与硫酸盐转运相关的基因的过度表达相对应(图gydF4y2Ba5gydF4y2Ba)，以及乳糜泻中硫和氮代谢的增加(图gydF4y2Ba4gydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

乳糜泻与许多与碳水化合物转运相关的基因的丰度增加有关(图gydF4y2Ba5gydF4y2Ba)．iCD中戊糖磷酸途径和果糖/甘露糖代谢基因丰度大幅增加(图gydF4y2Ba4gydF4y2Ba)，它们伴随着碳水化合物代谢的增加，但在UC和CD中不显著。此外，iCD显示葡萄糖、己糖、麦芽糖、单糖、二糖和低聚糖转运基因的丰度增加(图gydF4y2Ba5gydF4y2Ba)．我们观察到在iCD中丁酸盐和丙酸盐代谢均下降(图gydF4y2Ba4gydF4y2Ba)，表明微生物组产生的短链脂肪酸可能减少，可能是由于观察到的gydF4y2BaRoseburiagydF4y2Ba而且gydF4y2BaFaecalibacteriumgydF4y2Ba．gydF4y2Ba

我们发现UC和CD中谷胱甘肽转运基因丰度增加(图gydF4y2Ba5gydF4y2Ba)以及UC中谷胱甘肽代谢基因丰度的增加。谷胱甘肽是一种半胱氨酸和谷氨酸的三肽，由变形菌和少数链球菌和肠球菌合成[gydF4y2Ba75gydF4y2Ba]，使细菌在氧化或酸胁迫时保持体内平衡。炎症级联包括产生高活性氧和氮代谢物，这在活动性IBD中大大增加[gydF4y2Ba76gydF4y2Ba］．丙质板单核细胞在炎症期间也释放同型半胱氨酸，这进一步促进氧化应激;IBD与高水平的粘膜和血清同型半胱氨酸有关[gydF4y2Ba77gydF4y2Ba］．因此，硫酸盐转运、半胱氨酸代谢和谷胱甘肽代谢的增加可能反映了肠道微生物组处理炎症引起的氧化应激的一种机制。gydF4y2Ba

iCD中的极端功能转变包括氧化还原代谢的改变、信号/分泌的富集，并提示一种“病原体样”侵袭宏基因组gydF4y2Ba

累及回肠的乳糜泻在模块水平表现出特定的功能障碍。它与糖酵解和碳水化合物运输和代谢的几个模块的增加有关(图gydF4y2Ba5gydF4y2Ba)．相反，iCD表现出较低的脂质代谢和分解代谢基因丰度，证实了能量代谢的主要失衡。我们观察到iCD、CD和UC中烟酰胺、嘌呤和嘧啶核苷酸生物合成模块的全球下降(图gydF4y2Ba5gydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

与iCD相关的维生素生物合成减少，但硫胺素和特别是核黄素代谢模块增加(图gydF4y2Ba4gydF4y2Ba)．有趣的是，这个通路是由磷酸戊糖通路提供的，在iCD中也有过度表达。核黄素是将氧化的谷胱甘肽还原为还原形式所必需的，因此是pH值和氧化应激稳态所必需的，就像NADPH一样，是戊糖磷酸途径的产物。含硫氨基酸半胱氨酸和蛋氨酸的代谢在iCD中增加，而非含硫氨基酸如赖氨酸和谷氨酰胺的代谢则在ibd中减少。由于同型半胱氨酸很容易转化为蛋氨酸，这可能表明维持氧化还原稳态的进一步机制。或者，这可能与icd特定的碳水化合物代谢增加有关，因为半胱氨酸可能被代谢为丙酮酸。gydF4y2Ba

最后，参与发病过程的基因，如分泌系统和粘附/侵袭，在iCD中过度代表(图gydF4y2Ba4gydF4y2Ba)．例如，参与志贺菌病途径的基因在CD中更丰富，II型分泌基因在iCD中更丰富。II型分泌参与细胞壁降解酶的分泌[gydF4y2Ba78gydF4y2Ba]及分泌毒素，例如类似霍乱毒素的不耐热肠毒素[gydF4y2Ba79gydF4y2Ba］．这些功能是典型的病原体附着-侵袭性的gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2Ba，在我们自己的研究和其他研究中观察到它们会增加iCD [gydF4y2Ba6gydF4y2Ba，gydF4y2Ba55gydF4y2Ba］．这可能与组织损伤有关，要么主要是毒素分泌的结果，要么是刺激细胞因子产生的结果。这种组织破坏可能是微生物过度生长的代谢物的来源，选择了能够在这种环境中茁壮成长的营养不良专家，并导致微生物全群落基本生物合成过程的损失(图gydF4y2Ba4gydF4y2Ba而且gydF4y2Ba5gydF4y2Ba)．这反过来又会导致进一步的组织分解，细菌过度生长，以及群落结构和功能失调。gydF4y2Ba

胃肠道微生物组影响膳食能量提取、免疫系统发育、维生素生产和药物代谢，但胃肠道微生物组细菌的大多数分子和代谢功能尚未确定[gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba］．为了深入了解ibd相关生物失调的功能后果，我们使用了一种新的方法，将微生物群落16S基因序列图谱与最接近的可用全基因组序列信息配对。这定义了一个推断的宏基因组，从而补充了本研究中每个微生物组的代谢功能模块。这使我们能够识别IBD患者微生物群中独特的功能性扰动。有趣的是，尽管我们只在与UC相关的细菌分支中发现了9个变化(共350个，2.6%)，但我们在功能通路和代谢模块中发现了21个具有统计学意义的差异(共295个，7.1%);这种模式也适用于CD和iCD功能。这强调了一个事实，即胃肠道微生物群组成的系统发育多样性变化可以在功能上协调，并导致微生物群代谢潜力的重大改变。gydF4y2Ba

本研究中获得的微生物代谢信息仅代表了IBD菌群功能研究的一个步骤，因为它是利用微生物基因组的先验知识进行的精确而近似的推断。从我们的16S数据推断的宏基因组得到了样本子集的鸟枪测序的支持，提供了一个确认，即它们代表了社区功能能力。随着测序成本的持续下降，数十或数百个样本的丰富宏基因组数据将进一步提高我们解决群落中物种水平基因功能的能力。当然，在任何给定的时间内，一个社区都只能表达其功能能力的一个可变子集，以响应环境刺激。因此，代谢组学、蛋白质组学和代谢组学的数据将继续增加我们对炎症性疾病期间机体的哪一种潜在功能对宿主影响最大的理解。gydF4y2Ba

结合功能模块丰度的变化和这些代谢途径的先验知识，对IBD中的微生物组功能障碍提供了新的认识。UC和CD中含硫氨基酸半胱氨酸的代谢增加，同时伴随着核黄素代谢、谷胱甘肽转运体和n -乙酰半乳糖磷酸转移酶系统的增加。黏液蛋白富含半胱氨酸和糖基化糖，在肠上皮中大量存在，在炎症时表达上调。半胱氨酸代谢和n -乙酰半乳糖转运体的增加可能反映了微生物组向更多的使用粘蛋白作为主要能量来源的微生物的转变(图gydF4y2Ba6gydF4y2Ba)．这种功能提示粘膜活性，对于屏障功能受损的IBD上皮可能存在问题。gydF4y2Ba

另外，半胱氨酸(谷胱甘肽的前体)和谷胱甘肽转运模块的生物合成增加可能与微生物组对炎症IBD肠道氧化应激(活性氧和氮的高水平)的反应有关[gydF4y2Ba76gydF4y2Ba］．为了支持这一概念，我们发现在iCD中，将谷胱甘肽在氧化态和还原态之间转换所需的核黄素代谢增加。此外，磷酸戊糖途径也增加了，该途径产生还原型谷胱甘肽所需的NADPH。最近的研究表明氧化还原应力允许gydF4y2Ba沙门氏菌gydF4y2Ba以乙醇胺为碳源[gydF4y2Ba80gydF4y2Ba并允许肠出血性gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2Ba用作氮源[gydF4y2Ba81gydF4y2Ba]，从而赋予这些微生物竞争优势。这就提出了一种有趣的可能性gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2Ba或IBD中的相关物种可能有较高的代表性，因为它们从氧化应激中获得了竞争优势，并能够更好地通过产生谷胱甘肽来补偿。gydF4y2Ba

UC和CD中，赖氨酸、精氨酸和组氨酸的生物合成均减少，有利于转运;色氨酸代谢的进一步下降与iCD相关。数据显示，许多基本过程，如钴胺素合成、嘌呤和嘧啶生物合成、脂质分解代谢和磷脂代谢也大幅度下降，而转运明显增加。氨基酸和核苷酸生物合成基因丰度的总体下降与本质上是营养性的高度共生细菌和一些病原体的生活方式惊人地相似(图gydF4y2Ba6gydF4y2Ba)．一个这样的例子是分节丝状细菌(SFB)，一种共生体属于gydF4y2BaCandidadatusgydF4y2Ba关节炎，分支I的一个亚群gydF4y2Ba(美国这篇gydF4y2Ba梭状芽胞杆菌。最近测序的SFB基因组缺乏核苷酸生物合成基因以及几乎所有的维生素和氨基酸[gydF4y2Ba82gydF4y2Ba，gydF4y2Ba83gydF4y2Ba］．SFB通常大量存在于啮齿动物回肠末端，并负责Th17细胞的成熟[gydF4y2Ba84gydF4y2Ba，在cd相关炎症中发挥重要作用[gydF4y2Ba85gydF4y2Ba］．迄今为止，在人类中均未观察到SFB或系统发育相关序列[gydF4y2Ba82gydF4y2Ba，gydF4y2Ba86gydF4y2Ba];在我们的数据中也是如此(0个16S序列，> 90%与X77814 SFB相同)。然而，在这些IBD群落宏基因组中观察到类似于SFB的功能趋势，因为贯穿中心碳代谢、氨基酸生物合成和核苷酸维持的生物合成机制都减少了(图)gydF4y2Ba4gydF4y2Ba而且gydF4y2Ba5gydF4y2Ba)，这暗示了人类可能拥有功能等同的sfb样病原体，它们在IBD中增加，但在系统发育上不接近gydF4y2BaCandidatusgydF4y2BaArthromitis。宿主组织的破坏，无论是炎症介导的还是细菌介导的，都会提供一个现成的营养来源(图gydF4y2Ba6gydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

这里提供的数据显示，IBD和iCD尤其与厚壁菌门和变形菌门的变化为特征的生物失调有关。环境因素和值得注意的是，治疗也与胃肠道微生物群的独立变化相关;在未来IBD菌群研究中必须考虑到这些因素。这些细菌组成的扰动，虽然不大，但与胃肠道微生物组功能的主要扰动有关，该功能围绕氧化应激存在时的代谢和组织损伤期间的营养可用性扰动。需要进一步的研究，特别是包括转录组学、蛋白质组学或代谢组学表征、纵向数据和膳食元数据，以进一步确定ibd相关微生物组功能障碍对宿主的影响，以及它们由微生物组进行或调节的具体机制。gydF4y2Ba

奥斯卡奖和棱镜奖gydF4y2Ba

大洋州克罗恩病和结肠炎地区登记处(OSCCAR)是一个基于州的、前瞻性的IBD患者初始队列，旨在研究IBD的流行病学，确定罗德岛州IBD的发病率，并将这些发病率外推到美国普通人群。罗德岛州超过100万的多样化人口、有限的地理范围和严格限定的胃肠病学社区是建立IBD患者前瞻性初始队列的理想环境。在罗德岛的98名胃肠病学/结肠直肠外科医生中，除了一人之外，所有人都同意将患者转诊到OSCCAR，而在罗德岛边境的马萨诸塞州执业的11名胃肠病学家也同意将他们新诊断的IBD患者转诊到罗德岛。2008年1月1日开始招生。所有新确诊为乳糜泻、结肠炎或不确定结肠炎的罗德岛居民都有资格纳入(确诊后12个月内)。在分析中没有考虑受试者的种族背景，不确定的结肠炎患者只对其他元数据进行分析，而没有对IBD诊断进行分析。根据国家糖尿病、消化和肾脏疾病研究所(NIDDK) IBD遗传联盟的标准，通过内窥镜、病理或影像学检查来诊断CD、UC或不确定性结肠炎。OSCCAR的研究方案由三个机构审查委员会(寿命(#0214-07)、合作伙伴人类研究委员会(#2007-P-001705)和人体受试者保护项目/西奈山医学院(#11-01479))审查和批准，所有实验都遵守这些审查委员会的规定。在参与研究前获得每位受试者的知情同意和HIPAA(健康保险携带与责任法案)授权。在研究开始日期之前被诊断为IBD的个体、孕妇、那些不愿意为参与研究提供知情同意的人，以及在诊断时是囚犯的人，都不允许参与。gydF4y2Ba

MGH IBD研究的前瞻性登记(PRISM)是一个以转诊中心为基础的IBD患者前瞻性队列研究。2005年1月1日开始招生。根据标准的内窥镜、影像学和组织学标准诊断为乳糜泻或UC的18岁及以上患者有资格参与。对照组为18岁及以上的健康患者，为筛查目的，在结肠镜检查中对其进行活检。gydF4y2Ba

患有急性疾病、等待移植或慢性疾病(如肾功能衰竭、糖尿病、充血性心力衰竭)的患者被排除在健康志愿者组之外。在常规结肠镜检查期间，受试者有机会捐献活检样本。采样后，将肠道活检组织保存在5%甘油-80°C中，直到提取DNA。粪便样品在4°C保存24小时，然后在-80°C保存直到DNA提取。PRISM研究方案由合作伙伴人类研究委员会(#2004-P-001067)审查和批准，所有实验都遵守该审查委员会的规定。gydF4y2Ba

提取DNAgydF4y2Ba

使用QIAamp DNA stool迷你试剂盒(Qiagen, Inc.， Valencia, CA, USA)根据制造商说明并如前所述从粪便和活检样本中提取DNA [gydF4y2Ba87gydF4y2Ba］．为了适应更大的粪便量，并通过几个步骤的串珠来改善均质性，制造商修改了该方案:a)在该方案中使用了至少2毫升的缓冲ASL和300毫克的粪便;b)使用不超过1500 mg的粪便和10.5 ml的缓冲ASL，以700 μl的缓冲ASL / 100 mg的粪便重量的比例;c)向每个样品添加缓冲ASL(步骤2)后，将0.70 mm石榴石微珠(MO BIO Laboratories, Inc.， Carlsbad, CA, USA)添加到悬浮液中并旋转10秒;d)在0.1毫米玻璃珠管(MO BIO Laboratories, Inc.)中对悬浮液(步骤3)加热后进行第二次打珠，并旋转10分钟。gydF4y2Ba

16S基因的扩增和454测序gydF4y2Ba

16S基因集由454个FLX Titanium序列组成，跨越V3到V5可变区域。16S扩增和测序的详细方案可在人类微生物组项目数据分析与协调中心网站上查阅[gydF4y2Ba88gydF4y2Ba］．简而言之，基因组DNA使用结合FLX Titanium适配器和样本条形码序列设计的引物进行16S扩增，允许定向测序覆盖可变区域V5到部分V3(引物:357F 5'- cctacgggaggcagag -3'和926R 5' CCGTCAATTCMTTTRAGT-3')。PCR混合物(25 μl)包含10 ng模板，1× Easy A反应缓冲液(Stratagene, La Jolla, CA, USA)， 200 mM每个dNTP (Stratagene)， 200 nM每个引物，1.25 U AccuPrime hifi克隆酶(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)。V3-V5的循环条件包括95°C初始变性2分钟，然后在95°C变性40秒，50°C退火30秒，72°C延伸5分钟，72°C最终延伸7分钟。扩增子在1.2% Flash凝胶(Lonza, Rockland, ME, USA)上确认，用AMPure XP DNA纯化珠(Beckman Coulter, Danvers, MA, USA)按照制造商要求进行纯化，并在25 μl 1×低TE缓冲液(pH 8.0)中洗脱。扩增子在安捷伦生物分析仪2100 DNA 1000芯片(安捷伦技术公司，Santa Clara, CA, USA)上定量，并以等摩尔浓度池化。乳剂PCR和测序按照制造商的规范进行。gydF4y2Ba

处理测序样品gydF4y2Ba

序列在数据管理管道中处理，该管道实现在母亲[gydF4y2Ba89gydF4y2Ba该方法将小于200个核苷酸或大于600个核苷酸的序列从分析中删除，如果这些序列具有较低的读取质量评分(< 25)，包含模棱两可的字符，具有不精确的条形码匹配，或与反向引物序列(926R)有4个以上的不匹配。剩余的序列根据条形码匹配分配到样本中，然后对条形码和引物序列进行修剪。嵌合序列使用ChimeraSlayer进行识别[gydF4y2Ba90gydF4y2Ba]算法，使用MSU RDP分类器v2.2对读进行分类[gydF4y2Ba91gydF4y2Ba]，使用核糖体数据库项目(RDP 10数据库，版本6)维护的分法。处理后的测序深度平均为每个样本2,860个reads(标准差1,730)。gydF4y2Ba

从微生物组组成推断宏基因组gydF4y2Ba

为了构建每个样本群落的近似基因目录，我们使用1,119个KEGG参考基因组的基因含量来推断我们检测到的系统型的近似基因含量。我们首先匹配了FastTree GreenGenes (GG)的系统发育[gydF4y2Ba92gydF4y2Ba]注释了这些KEGG基因组的生物，而不是用于系统分型的RDP分类法。RDP分类学中的每个分支都被映射到GG系统发育中的分支，该分支最大化了重叠命名后代基因组的Jaccard指数。也就是说，每个属级的系统型都被分配到包含该属基因组最多和其他属基因组最少的GG分支。较高级的分支继续使用Jaccard指数作为最优性标准的模式。然后，在GG树中重建祖先支的基因内容，首先将每个参考基因组(树叶)总结为KEGG同源体(KO)的载体[gydF4y2Ba70gydF4y2Ba拷贝数(基因组中注释的基因的0、1或多个拷贝)。各GG亲本枝的基因含量gydF4y2BaggydF4y2Ba通过所有后代基因组的平均gydF4y2BahgydF4y2BaKO向量，带权值gydF4y2BawgydF4y2Ba（gydF4y2Bag hgydF4y2Ba)与系统发育距离呈反指数关系:gydF4y2Ba

GG树节点gydF4y2BaggydF4y2Ba而且gydF4y2BahgydF4y2Ba由系统发育的分支长度分开gydF4y2Ba经销gydF4y2Ba（gydF4y2Bag hgydF4y2Ba)并用KO基因组载体注释gydF4y2Ba$\stackrel{\rightharpoonup gydF4y2Ba}{\mathrm{ggydF4y2Ba}}$而且gydF4y2Ba$\stackrel{\rightharpoonup gydF4y2Ba}{\mathrm{hgydF4y2Ba}}$．gydF4y2Ba

使用这种基因组的向量表示，单个基因家族的丰度(KO)gydF4y2Ba我gydF4y2Ba在一个群落中，由于存在一个特定的系统型gydF4y2BaggydF4y2Ba对应基因的产物是否计数gydF4y2Ba$\stackrel{\rightharpoonup gydF4y2Ba}{\mathrm{ggydF4y2Ba}}［gydF4y2Ba\mathrm{我gydF4y2Ba}］gydF4y2Ba$以及测量到的系统型的丰度gydF4y2BaggydF4y2Ba．因此，通过将样本中存在的所有系统型的个体贡献相加，可以估计每个样本中每种KO的总相对丰度。利用这种方法，我们推断出每个抽样社区的功能组成。通过比较来自人类微生物组项目的16S数据集中推测的KO丰度与其宏基因组测序对应物，验证了推断过程的准确性gydF4y2Ba15gydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

代谢途径重建gydF4y2Ba

推断出的每个群落基因(KO)丰度随后利用人类微生物组项目代谢重建管道HUMAnN重建为微生物途径相对丰度[gydF4y2Ba71gydF4y2Ba］．利用HUMAnN将KOs分组到以基因集表示的通路中，利用MinPath通过最大简约性选择通路[gydF4y2Ba93gydF4y2Ba，并计算每个通路的相对丰度，作为其中所有基因的平滑平均值，考虑异常值和空白填充。我们运行了三次HUMAnN，从这些基因中重建了三种互补类型的通路:小代谢模块(使用KEGG的连接范式逻辑)、大代谢通路和基因本体论术语(使用来自九个特征良好的KEGG微生物的注释到ko映射:ban、cje、cpe、eco、nse、pae、sce、son和vch)。对于这三种途径中的每一种，HUMAnN输入每个样本中所有基因的推断相对丰度，并输出样本内通路的相对丰度。随后的分析以与按枝采样的微生物丰度相同的方式处理这些按途径采样的相对丰度。gydF4y2Ba

微生物枝和途径与样本元数据的显著关联gydF4y2Ba

计算分支丰度、KEGG途径和模块丰度以及基因本体术语丰度[gydF4y2Ba94gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba97gydF4y2Ba］．其次，在建模前对数据进行预处理，进行质量控制。当有超过10%的数据缺失时，或者当它们的值与可用样本相比没有变化时，临床元数据将被删除。枝、路径和极低丰度的特征(≥90%的样本< 0.001)和下或上外围栏外(3×四分位数范围)的特征异常值被删除。用样本的平均丰度对缺失数据进行显著性检验;使用R包中的NA . gams .replace函数对缺失因子元数据进行‘NA’因子级别的推断[gydF4y2Ba98gydF4y2Ba］．除非另有说明，所有后续分析和计算都是使用这些处理过的数据进行的。经过处理后，228个和231个样品分别通过了枝丰度和功能丰度分析的质量控制。gydF4y2Ba

最后，通过使用一种新的多元算法，对分支和函数与感兴趣的临床元数据进行了统计学上显著的关联测试。每个支系(不包括生态措施)用稳定方差的反正弦平方根变换进行归一化，并用一般线性模型进行评估(在R中使用glm包)。对稀疏数据的模型选择使用boost (gbm包[gydF4y2Ba99gydF4y2Ba])。将所有可用元数据与每个分支独立关联的多元线性模型得到了提升，在这些迭代中至少1%选择的任何元数据最终在标准广义线性模型中进行了显著性测试。因此，这个复合模型的形式是:gydF4y2Ba

在哪里gydF4y2BapgydF4y2Ba是否从增强中选择临床元数据。gydF4y2Ba

在每个元数据/枝独立关联中，使用Bonferonni校正调整因子水平上的多个比较;对所有分支和元数据进行多重假设检验，以产生最终的Benjamini和Hochberg错误发现率[gydF4y2BaOne hundred.gydF4y2Ba］．除非另有说明，q值阈值为0.25以下认为存在显著相关性;KEGG途径硫代谢(ko00920)与克罗恩病相关的平均q值为0.26。进行了多因素分析，以可视化异质因素数据之间的关系以及与元数据显著相关的选定类群(使用FactoMineR R包[gydF4y2Ba101gydF4y2Ba])。元数据、分类和函数之间的总丰度和重要关联列在附加文件中gydF4y2Ba1gydF4y2Ba而且gydF4y2Ba11gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

节段丝状细菌的序列比对gydF4y2Ba

为了确定样品中是否存在SFB，从三种物种(鸡、大鼠和小鼠)中提取了三个SFB序列(X80834、X87244和X77814)，使用20和15种子字进行blast比对。在对齐长度至少100个核苷酸的序列中，未发现一致性≥95%的序列。该研究的平均序列长度为435个核苷酸。gydF4y2Ba

猎枪宏基因组测序gydF4y2Ba

为了提供推断微生物群落基因和途径组成的内部验证，来自7名健康对照组和4名乳糜泻患者的粪便DNA进行了宏基因组鸟枪测序。用Illumina Nextera XT试剂盒构建文库，并根据制造商说明在Illumina MiSeq上使用2 × 150 bp对端测序。结果测序深度从3.9到270个巨核苷酸，平均119个巨核苷酸，从中用HUMAnN确定微生物群落功能[gydF4y2Ba71gydF4y2Ba]，如上文所述。gydF4y2Ba

顺序登录号和可用性gydF4y2Ba

本研究中生成的序列是公开的(NCBI生物项目ID号82111和175224)。gydF4y2Ba

CD:gydF4y2Ba

克罗恩氏病gydF4y2Ba

GG:gydF4y2Ba

绿色煤电gydF4y2Ba

GI:gydF4y2Ba

胃肠gydF4y2Ba

炎症性肠病:gydF4y2Ba

炎症性肠病gydF4y2Ba

iCD:gydF4y2Ba

回肠克罗恩氏病gydF4y2Ba

KEGG:gydF4y2Ba

京都基因和基因组百科全书gydF4y2Ba

柯:gydF4y2Ba

KEGG直接同源gydF4y2Ba

OSCCAR:gydF4y2Ba

海洋州克罗恩和结肠炎地区登记处gydF4y2Ba

棱镜:gydF4y2Ba

MGH IBD研究的前瞻性注册gydF4y2Ba

RDP:gydF4y2Ba

核糖体数据库项目gydF4y2Ba

短链脂肪酸:gydF4y2Ba

短链脂肪酸gydF4y2Ba

SFB:gydF4y2Ba

分段丝状细菌gydF4y2Ba

TLR:gydF4y2Ba

toll样受体gydF4y2Ba

加州大学:gydF4y2Ba

溃疡性结肠炎。gydF4y2Ba

我们感谢Wendy Garrett、Patrick Veiga、Ken Croitoru和Mark Silverberg对这份手稿和研究的宝贵意见，也感谢Bruce Birren和广泛基因组测序和分析项目。这项工作的部分资金来自法国胃肠病学会、Bettencourt Schueller基金会、Philippe基金会和Arthur Sachs奖学金(HS);NIH (NIHU54HG004969)和美国克罗恩病和结肠炎基金会(DG和DVW);麦金尼斯和拉斯穆森家族的慈善支持;NIH 1R21HD058828-01A1到NL;和NIH 1R01HG005969, NSF DBI-1053486, ARO W911NF-11-1-0473和W911NF-11-1-0429向CH. Sands博士承认NIH (7 R21 DK078555)，疾病控制和预防中心(5 U01 DP002676, 5 U01 DP000340)，以及美国克罗恩病和结肠炎基金会gydF4y2Ba

作者指出gydF4y2Ba

1. 哈利科尔gydF4y2Ba

   现住址:AP-HP消化科，Hôpital巴黎圣安东尼和UPMC大学，巴黎，75012，法国gydF4y2Ba

作者和联系gydF4y2Ba

1. 哈佛大学公共卫生学院生物统计系，马萨诸塞州波士顿02115gydF4y2Ba

   Xochitl C Morgan, Timothy L Tickle, Joshua A Reyes & Curtis hutenhowergydF4y2Ba

2. 麻省理工学院和哈佛大学布罗德研究所，美国马萨诸塞州剑桥02142gydF4y2Ba

   Timothy L Tickle, Dirk Gevers, Doyle V Ward, Ramnik J Xavier & Curtis hutenhowergydF4y2Ba

3. 美国马萨诸塞州波士顿02114哈佛医学院马萨诸塞州总医院胃肠科和炎症性肠病研究中心gydF4y2Ba

   哈里·索科尔，凯瑟琳·L·德瓦尼，约书亚·科泽尼克和拉姆尼克·J·泽维尔gydF4y2Ba

4. 哈佛医学院马萨诸塞州总医院计算与综合生物学中心，马萨诸塞州波士顿02114gydF4y2Ba

   哈里·索科尔，凯瑟琳·L·德瓦尼和拉姆尼克·J·泽维尔gydF4y2Ba

5. 布朗大学华伦阿尔珀特医学院孩之宝儿童医院小儿消化内科，普罗维登斯，RI, 02903，美国gydF4y2Ba

   萨米尔·沙阿和尼尔·莱莱科gydF4y2Ba

6. 美国马萨诸塞州波士顿，哈佛医学院，儿童医院和布莱根妇女医院胃肠科gydF4y2Ba

   Scott B Snapper, Athos Bousvaros & Joshua KorzenikgydF4y2Ba

7. 西奈山医学院消化内科，纽约，10029，美国gydF4y2Ba

   布鲁斯·E金沙gydF4y2Ba

相应的作者gydF4y2Ba

对应到gydF4y2Ba柯蒂斯HuttenhowergydF4y2Ba．gydF4y2Ba

相互竞争的利益gydF4y2Ba

作者声明他们没有竞争利益。gydF4y2Ba

作者的贡献gydF4y2Ba

DG, BES, RJX和CH构思和设计了这项研究。DG、DVW和XCM生成测序数据。HS、TLT、XCM和CH分析数据。TLT、DG、JAR进行计算分析。HS、XCM、SBS、AB、JK、BES、RJX和CH解释数据。DG, KLD, DVW, SAS, NL, AB, BES, RJX协同样品分析。HS, TLT, XCM和CH起草了手稿。所有作者均已阅读并批准本手稿出版。gydF4y2Ba

Xochitl C Morgan, Timothy L Tickle, Harry Sokol对这项工作也做出了同样的贡献。gydF4y2Ba

再版和权限gydF4y2Ba