AGE-RAGE轴在结直肠癌中的临床意义:与乙醛酶i、脂联素受体表达及预后的关系

背景

晚期糖基化终产物(AGEs)及其受体RAGE是结直肠癌发生的重要致病因子。然而，在结直肠癌(CRC)中，它们与解毒酶Glyoxalase (GLO)-I和脂联素受体(AdipoR1, AdipoR2)的关系目前尚不清楚。在本研究中，我们研究了上述分子在CRC中与邻近非肿瘤组织的表达水平及其与临床病理特征和患者生存的潜在相关性。

方法

我们分析了133例原发性CRC中AGE、RAGE、GLO-1、AdipoR1和AdipoR2的免疫组化表达，重点分析了GLO-I的免疫组化表达。进一步评估黏液性癌的肿瘤MSI状态。Western免疫印迹法用于验证正常和肿瘤组织以及三种CRC细胞系的免疫组化数据。另一组55例患者也被用于验证GLO-I的单因素生存分析结果。

结果

结直肠癌组织中AGE和RAGE表达强度均高于正常结肠黏膜，大多数病例(78%)为GLO-I阴性。Western免疫印迹法证实肿瘤组织中AGE、RAGE和GLO-I均有过表达。GLO-I表达与RAGE直接相关，与AGE免疫标记负相关。在黏液性癌亚组中，所有标记物(RAGE除外)的表达都有升高的趋势，尽管具有边缘性意义，但AdipoR1和AGE似乎更为突出。此外，AGE、AdipoR1和Adipo R2的表达与肿瘤分级相关，而GLO-1和AdipoR1与t类相关。在生存分析中，AdipoR2和GLO-I过表达预测整个队列和早期病例的生存时间缩短，在验证队列中再现了对GLO-I的影响。此外，在患者队列中，GLO-I出现为不良意义的独立预后因子。

结论

我们在此为CRC中AGE-RAGE轴、GLO-I和脂联素受体之间可能的相互作用提供了新的证据。AGE和AdipoR1可能参与了结直肠癌的发生，而AdipoR2和GLO-I作为新的独立预后生物标志物，对早期疾病患者具有不良意义。进一步的研究是必要的，以扩大我们的观察和调查其潜在的治疗意义。

结直肠癌是男性第三常见恶性肿瘤，女性第二常见恶性肿瘤，其次是乳腺癌[1］．肥胖和糖尿病患者患结直肠癌的风险明显更高[2］．现在很明显，环境因素，如富含脂肪的高热量西方饮食，在疾病的发病机制中起着重要作用。越来越多的数据表明，胰岛素抵抗、高血糖和慢性炎症通过与遗传特征的相互作用导致致癌，尽管潜在的分子途径仍有待澄清[2］．

晚期糖基化终产物(AGEs)是高活性分子，是葡萄糖或其他还原糖与氨基酸、核苷酸基或脂肪酸反应时内源性或外源性形成的[3.］．内源性AGEs在代谢氧化应激过程中产生，并随年龄在组织中正常积累[4]，它们的产生会因高血糖而急剧加速[5］．高水平的外源性AGEs，也称为糖毒素，可由现代烹饪方法产生，应用干热和高温，饮料和吸烟[3.］．外源性AGEs经口吸收，直接影响血浆浓度和组织沉积[6］．糖毒素的过度积累与许多代谢、退行性和炎症性疾病以及癌症的发展有关。

AGEs通过与相邻的细胞外基质蛋白形成交联来发挥其有害作用，从而降低组织的灵活性[5］．AGEs的细胞内功能是通过结合到晚期糖基化终产物(RAGE)的受体介导的，RAGE是一种跨膜受体和免疫球蛋白蛋白家族的成员。RAGE已在多种细胞和组织中被发现[7]现在被认为是一种模式识别受体(PRR)，具有广谱配体，包括高迁移率基团盒-1 (HMGB1)和S100蛋白[8］．RAGE激活启动下游信号通路，促进炎症、支持细胞生存、抑制凋亡和诱导血管生成，导致炎症微环境中的肿瘤生长和侵袭[9］．其表达已在包括结直肠癌在内的多种肿瘤中检测到[10]和癌前病变，如结肠腺瘤[11］．来自体外研究和大鼠模型的数据表明RAGE与CRC肿瘤的发生、进展和转移显著相关[12］．

内源性乙醛酶清除系统可减弱AGEs的细胞毒性[13］．Glyoxalase (GLO)-I和GLO- ii是普遍表达的酶，通过降低AGEs前体的水平来保护蛋白质、核苷酸和磷脂不受晚期糖基化反应的影响[14］．具有高糖酵解速率的肿瘤细胞从乙醛酶解毒系统中获益最多。如果留意-我基因扩增和过表达已在乳腺癌、肺癌、膀胱癌、胃癌和其他几种癌症中被发现[15］．对于CRC，放大如果我据报道是罕见的[15]，尽管早期研究表明肿瘤结肠上皮的活性比正常结肠上皮增加2倍[16］．

脂联素，一种专门由脂肪组织产生的肽激素，与葡萄糖代谢有关，似乎可以降低胰岛素抵抗。与正常体重的人相比，肥胖患者血清脂联素水平较低[17]，而流行病学研究显示该激素水平与各种类型的癌症(包括结直肠癌)呈负相关[18］．脂联素通过两种受体AdipoR1和AdipoR2发挥作用，这两种受体的分布和潜在功能部分不同[17］．在胰腺中检测到AdipoR1和AdipoR2的表达[19]，胃的[20.]及人类结肠癌[21- - - - - -25］．然而，一些研究CRC表达水平与患者临床病理参数的关系，导致了不确定或有争议的结果。

此外，脂联素与AGE/RAGE血清比值呈负相关[26]和类似的血浆水平N-(羧甲基)赖氨酸(CML)，一种突出的AGE类型，与超重患者的脂联素水平呈负相关[27］．体外实验支持AGE和脂联素表达之间的联系，暗示后者的抗氧化性能[28]，并支持其对ages诱导的内皮功能障碍的保护作用[27］．

目前关于AGE-RAGE轴在CRC中的作用，特别是与GLO-I和adipor1或AdipoR2表达有关的数据还不够充分。本研究旨在阐明上述分子表达与临床病理特征以及CRC患者生存之间的潜在相关性。为此，我们分析了大量具有临床病理特征的结直肠癌患者AdipoR1、AdipoR2、AGE、RAGE和GLO-I的表达，重点是后者，并对正常结肠黏膜新鲜组织和结直肠癌组织以及三种结肠癌细胞系进行western免疫印迹检测，验证了我们的发现。

病人

这是一项回顾性研究，对2000年至2010年间在雅典大学医学院第一病学系、“Tzaneio”总医院病学系和“Agios Andreas”总医院病学系诊断的133例原发性结直肠腺癌的档案组织标本进行了研究。该研究的方案由雅典大学生物伦理委员会(PN 5106/2012)批准，并遵循赫尔辛基宣言的原则。包括61名男性和72名女性，中位年龄为70岁(范围41-87岁)。所有患者在参与研究前均获得知情同意。所有患者术前均未接受化疗或放疗。

所有病例由两名经验丰富的病理学家(PK, SS)根据世界卫生组织最新的结直肠癌分类评估分化程度。为了在黏液性癌(19例)中分配分化等级，肿瘤MSI状态通过免疫组织化学和分子分析进行评估。评估了各自MMR蛋白的核表达水平，而在免疫组化模式无法定义MSI状态的情况下，则确定了其他MSI标记物的分子谱(BAT25, BAT26, NR24, BRAF) [29］．缺乏错配修复(MMR)蛋白表达，因此表现为MSI (MSI-high, MSI-h)的病例被归类为低级别癌。另一方面，未表现出MSI (MSI稳定或MSI低，MSS或MSI-l)的肿瘤被归类为高级别癌。患者队列包括22例高分化(I级)，90例中分化(II级)和21例低分化(III级)腺癌。

根据第六版TNM分类系统，肿瘤被分为I期(n= 7例)，第二期(n= 52例)，第三期(n= 53例)及第四期(n= 12箱)。在9例病例中，对应于切口肿瘤活检，TNM分类评估是不可行的。表中总结了患者的临床病理特征1．

到本研究开始时，35例患者在中位生存期19个月(范围1-57)后死于疾病，9例失去随访。其余89例患者的中位随访时间为56个月(范围12-84个月)。119例患者有复发信息，其中27例复发。

免疫组织化学分析

采用两步过氧化物酶缀合聚合物技术(DAKO Envision kit, DAKO, Carpinteria, CA)，对新鲜切割的、石蜡包埋的福尔玛固定肿瘤组织的4 μm切片进行AGE、RAGE、乙醛酶- i、脂联素受体1型和脂联素受体2型的免疫染色。为了提取抗原，组织切片在pH为6.0的柠檬酸钠缓冲液的微波中处理20分钟。切片与一抗在4℃下孵育过夜，抗脂联素受体1型抗体除外，其孵育时间为4℃下60分钟。所使用的主要抗体的详细信息列于表中2．阴性对照组用非免疫血清代替一抗。

免疫组化评估由两名病理学家(PK, PF)进行，不了解临床信息。记录每种抗体的染色分布(细胞质、细胞核、膜质、管腔)以及染色模式(弥漫性或颗粒性)。分别评价肿瘤细胞阳性百分率和染色强度(1:弱染色，2:中染色，3:强染色)。中度染色被定义为与邻近淋巴细胞聚集物相当。根据肿瘤细胞染色百分比乘以染色强度计算histos -score (H-score)。最后，为了研究AGE、RAGE、AdipoR1和AdipoR2在正常和肿瘤组织中的表达差异，还记录了在正常相邻结肠黏膜中观察到的染色程度和强度(在那些有染色的情况下)。

西方免疫印迹

从两个正常结肠粘膜、2个CRC肿瘤组织和3个结肠癌细胞系(SW480、HT29、HCT116)中提取蛋白质，使用含有蛋白酶和磷酸酶抑制剂的冰冷RIPA裂解缓冲液(#9801，细胞信号技术)，并额外添加PMSF (Sigma Aldrich)。采用Bradford法(Bio-Rad)测定提取物中蛋白质的浓度。蛋白质通过sds -聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，并转移到硝化纤维膜(Porablot NCP, machery - nagel)。膜在室温下用5%的脱脂牛奶在磷酸盐缓冲盐水Tween-20 (PBST)中阻塞1小时。随后，将膜与以下一抗在4℃下孵育过夜:抗age (Abcam, ab23722，稀释1:1000)，抗rage (Santa Cruz Biotechnology, sc-8230，稀释1:200)，抗乙醛酶(GLO-I) (sc-133144，稀释1:200)。一抗在含1%脱脂牛奶的PBST中稀释。然后将膜与HRP偶联二抗在室温下孵育1小时。二抗山羊抗兔IgG-HRP (12-348, Millipore)和山羊抗小鼠IgG-HRP (12-349, Millipore)稀释为1:2000。使用SuperSignal WestPico Chemiluminescent HRP Substrate试剂盒(Thermo Scientific)检测免疫反应条带。使用Image J软件(La Jolla, CA, USA)通过密度分析评估相对蛋白量，并归一化至相应的肌动蛋白水平。 All experiments have been performed at least 3 times and representative results of one experiment are shown.

统计分析

将AGE、RAGE、AdipoR1、AdipoR2作为连续变量。使用非参数试验评估与肿瘤分期、分级和组织学类型的相关性，必要时对多重比较进行校正(Bonferroni校正)(Mann Whitney校正)U检验、Kruskal Wallis方差分析、Spearman相关系数和Fischer精确检验)。

以CRC导致的死亡为终点进行生存分析。根据Kaplan-Meier法绘制生存曲线，采用对数秩检验进行组间比较，并采用多变量分析(Cox's模型)评估各参数(年龄、性别、肿瘤位置、分期、分级和age、RAGE、AdipoR1和AdipoR2表达)对临床结局的影响。在生存分析(单变量和多变量)中，连续变量根据ROC(受试者工作特征)曲线的结果进行分类。还对所检查的参数进行了按TNM状态分层的单因素生存分析，以调整它们对肿瘤期生存的影响。为了评估每个参数独立于其他参数的预测能力，针对那些在单变量分析中被证明显著的参数调整了多变量生存模型。统计计算使用统计包STATA 11.0 for Windows (STATA Corp.， College Station, TX, USA)进行。双侧p水平≤0.05的结果均被认为具有边际显著性。

验证组

采用一组独立的CRC患者来验证在单变量分析中选择的GLO-I表达的截止值。人群中GLO-1表达的单因素生存分析结果用于计算验证组所需的患者数量(80%)进行充分动力分析。为了检测患者组中计算的2.8836的危险比(使用双侧对数秩检验)，并在0.05显著性水平下达到80%的功率，将需要47名患者。

我们使用的验证组由55例患者组成，其人口统计学数据见表1．患者于2010年至2014年期间在雅典大学医学院病理第一系、“Tzaneio”总医院和病理学系、“Agios Andreas”总医院诊断，并在雅典大学“Laikon”总医院、“Tzaneio”总医院和“Agios Andreas”总医院治疗。

AGE和RAGE在正常结肠组织、结直肠癌和结肠细胞系中的表达

122/124例(98.39%)有AGE表达，h评分在0 ~ 300之间(中位数:90)。因此，除1例(124/ 125,99%)外，其余病例均表达RAGE, H-score在0 - 285之间(中位数:100)。两种分子都有弥漫性细胞质染色模式(图。1 f)．

89例患者的AGE和RAGE抗体在邻近正常结肠组织中均具有免疫反应性。虽然在正常和肿瘤组织中AGE和RAGE的免疫表达程度无差异，但在肿瘤组织中AGE和RAGE的表达强度均较高(p= 0.0001)1 c．western免疫印迹法对免疫组化数据的验证显示，在两例受测病例中，CRC组织中AGE和RAGE的表达高于邻近正常结肠(图2)。2)．

此外，western blot分析结肠癌细胞系、SW480结肠腺癌、HT29 II级结肠腺癌、HCT116结肠癌，发现AGEs和RAGE蛋白的高表达。2摄氏度)．

有趣的是，黏液性腺癌的AGE表达略高(Mann-WhitneyU测试中,p= 0.0997，图1 d)．此外，AGE h评分与肿瘤组织学分级(Mann-WhitneyU测试I vs II vs III，p= 0.0157，图1 a, b和无花果。3、表3.)，在II级个案中可见较低的水平。AGE、RAGE与肿瘤分期、部位无相关性(p> 0.10)。

GLO-I在正常结肠组织、结直肠癌和结肠癌细胞系中的表达

细胞质GLO-I表达(图;4得了)的检出率为94.17%(113/120)。h评分中位数为140(范围0-300)。

正常邻近结肠黏膜大多为GLO-I阴性，其中20例(20/ 91,22 %)为轻度至中度阳性(图。4)．此外，虽然与肿瘤组织学分级无关(p> 0.10)， GLO-I表达与肿瘤t型呈负相关(Mann-WhitneyU测试T1/T2 vs T3/T4，p= 0.0246，图3 d、表3.)．通过免疫印迹法检测正常和CRC样本中GLO-I的表达，发现肿瘤组织中蛋白表达较高(图2)。2和4)．同样，结肠癌细胞系显示出高表达的GLO-I(图。2摄氏度)．免疫组化和western blot分析显示，在正常结肠黏膜和结肠癌细胞系中，GLO-I与AGE的表达呈明显的负相关关系，而在CRC组织中则不太明显。

GLO-I与RAGE或Adipo1 H-score呈显著正相关(Spearman相关系数、R= 0.2909,p= 0.0017为前者关系和R= 0.4096,p后者= 0.0001)。另一方面，GLO-I与AGE呈反比关系，GLO-I H-score(≥140)水平的升高与AGE H-score的降低相关(Mann-Whitney)U测试中,p= 0.0731)，但存在显著性差异。

AdipoR1和AdipoR2在正常结肠组织和结直肠腺癌中的表达

AdipoR1和AdipoR2免疫反应在大多数病例中被观察到(分别为93/ 100,93 %和90/ 96,93.7%)。两种蛋白的h评分范围都很广(0-300，中位值分别为85和60)，胞质(图。5 f)，常呈颗粒状染色，在管腔表面附近更明显(图。5度)．

在70例可以评估的病例中，与肿瘤组织相比，邻近的正常结肠组织显示出略微更强烈的AdipoR1表达(Mann WhitneyU测试中,p= 0.0530)(图5度)．相反，正常区和肿瘤区AdipoR2表达无差异(前者70例)(p> 0.10)(图5)．

粘液腺癌的AdipoR1和AdipoR2表达水平略高(Mann-WhitneyU测试中,p= 0.0739和0.0993)(图5 b, e)．此外，AdipoR1 h评分与肿瘤组织学分级呈负相关(图。5模拟)， (Kruskal Wallis方差分析，I vs II vs III，p= 0.0080，图3 b、表3.)和t类(曼·惠特尼)U测试，T1/2 vs T3/4，p= 0.0363，图3 e)．相反，与低级别(I/II)肿瘤相比，III级肿瘤倾向于具有更高水平的AdipoR2表达[Mann WhitneyU测试中,p= 0.0210(图3 c)．AdipoR1、AdipoR2与肿瘤TNM分期、部位的相关性不显著(p> 0.10)。

生存分析

单因素生存分析显示，根据TNM状态(I/II vs III/IV，p= 0.0001)，有无淋巴结转移(p= 0.0005)，存在远处转移(M) (p= <0.0001)， AdipoR2 h评分增加(<60 vs≥60)p= 0.0465，图6)，以及更高的GLO-I h评分(300 vs <300，p= 0.0046，图6 d)，均与缩短生存期相关(表4)．根据TNM状态进行分层生存分析，AdipoR2和GLO-I对早期肿瘤患者生存的影响均显著(TNM I/II期，pAdipoR2 = 0.0002，图;6 b,p= 0.0499 for GLO-I, Fig。6 e)与晚期(TNM III/IV期)相比，这两种蛋白都未能保持其统计学意义(图。6 c f)．AdipoR1、AGE和RAGE在这方面没有增加显著的预后信息。

在多变量生存分析中，在两个独立的Cox回归模型中调整了GLO-I或AdipoR2对TNM状态的影响后，结果仍然显著，支持两种分子对TNM无关的预后作用(HR = 2.76，pGLO-I = 0.010, HR = 2.53，pAdipoR2 = 0.050)。有趣的是，在一个多变量模型中，包括在单因素分析中被证明显著的所有三个参数(GLO-I、AdipoR2和TNM状态)，GLO-I成为不良预后的独立预测因子(HR = 2.98，p= 0.036)，以及TNM状态(HR = 7.53，p< 0.0001)。

生存分析-验证组

本组患者的单因素生存分析显示，与GLO-I高表达组相比，GLO-I低表达组的总生存期显著降低(H-score 300 vs <300, log-rank检验，p< 0.0001，图;7一个)．这种影响在早期病例中仍然显著(TNM I/II期，log-rank检验p< 0.0001，图;7 b)，而在晚期病例中具有边缘性意义(TNM III/IV期，log-rank检验p= 0.0527，图7 c)．

本队列研究检测了CRC与邻近非肿瘤组织中AGEs的免疫组化定位及其受体RAGE的表达。此外，解毒酶GLO-I和AdipoR1、AdipoR2的表达也被评估，以试图揭示可能的相互关系、与临床病理特征的关联或对CRC患者生存的潜在影响。

先前对癌细胞系和动物模型的研究指出了AGE-RAGE轴在CRC发展中的意义。我们对3个结肠癌细胞系的western blot分析证实了这一观点，记录了AGE和RAGE表达的增加。Kuniyasu等。[12]首次表明RAGE在所有检测的CRC细胞系中表达，其表达与体外癌细胞迁移和侵袭有关。在同一项研究中，age -牛血清白蛋白对细胞的处理部分影响了细胞的生长、迁移和侵袭，这意味着AGEs在CRC进展中的直接作用很小。在另一项研究中，RAGE在Caco-2人结肠癌细胞系中表达，AGE治疗导致p44/42 (ERK1/2) MAP激酶以时间和剂量依赖的方式激活[30.］．此外，Turovskaya等人[31]表明RAGE促进了结肠炎相关癌变小鼠模型中分子肿瘤-基质相互作用，导致结肠肿瘤的发展。同样，也有假说认为RAGE与上皮细胞向间充质转化途径协同作用可以触发癌症干细胞的产生[32］．

尽管在该领域进行了大量的实验研究，但关于人类正常结肠直肠上皮和肿瘤结直肠上皮中AGE和RAGE表达的数据仍然很少。在本研究中，与非肿瘤上皮相比，肿瘤上皮中的AGE和RAGE倾向于更强烈，这也通过在两个正常和两个癌组织中的western免疫印迹验证。在此背景下，Zill等人[30.]通过RT-PCR方法观察RAGE在非肿瘤人肠道组织中的表达。Kuniyasu等。[33]报道了3例正常结肠粘膜中RAGE mRNA的缺失。在同一研究中，对大量CRC样本的免疫组化分析未能显示正常结肠黏膜的AGE阳性。上述不一致可能是由于应用方法的可变性和/或不同的抗体使用。然而，需要进一步的研究来澄清这个问题。值得注意的是，在海曼斯等人的一项实验调查中。34]，在研究小鼠的正常肠上皮细胞中，RAGE均呈阳性。

在我们的队列中，我们发现AGE表达与癌症组织学分级相关，在II级病例中观察到较低水平。这一发现提示在结直肠癌发生的早期和晚期可能发挥作用。AGE表达与CRC分级之间的相关性此前未见报道。然而，在胃癌患者中，Kuniyasu等人[35]发现RAGE阳性与肿瘤分级直接相关。在我们的调查中，AGE和RAGE与分期或任何参数无关，尽管之前的研究显示RAGE与淋巴结和远处转移显著正相关[33］．

对于AGEs的内源性解毒酶，我们的免疫组化和western blot分析与之前的报道一致，表明GLO-I在CRC中比邻近正常上皮更频繁表达[16］．此外，我们的结果通过western blotting在正常结肠粘膜和结肠癌细胞系中证实了预期的GLO-I和AGE表达呈反比关系。然而，在CRC组织中，这种关系在免疫组化和western blot水平上都不明显。这些发现概括了乙二醛酶清除系统对AGEs细胞毒性的衰减[13］．高GLO-I免疫反应的病例也表现出高RAGE阳性，可能反映了一种适应机制，癌细胞表现出RAGE上调，以克服GLO-I诱导的AGE水平下降。上述结果表明，AGE-RAGE-GLO-I系统在CRC中起着重要作用。在本队列中，高GLO-I表达的肿瘤更常属于低T类型。

此外，AdipoR1和R2在结直肠癌和正常结肠黏膜均有表达。后者AdipoR1免疫染色更强烈，肿瘤阳性细胞百分比无明显差异vsnon-neoplastic上皮。根据我们的发现，最近的研究报告了AdipoR1和R2在癌性和正常结肠组织中的检测，尽管在表达水平上存在分歧。Gialamas等人[21]和威廉斯等人。[24]使用免疫组化，Yamamoto等人[25]通过RT-PCR，发现CRC中AdipoR1和R2的表达高于正常结肠上皮[21，24，25］．相反，日本最近的一项调查显示[23]， AdipoR1和R2 mRNA水平在肿瘤组织中明显低于正常。基于上述结果，作者认为减少AdipoR可以使癌细胞逃脱血清脂联素的抑瘤作用。由于上述差异难以解释，因此需要更大的前瞻性研究来比较评估AdipoR1、R2蛋白和mRNA在正常、异常发育和癌变结肠组织中的表达。

在我们的队列中，AdipoR1免疫阳性与肿瘤组织学分级和T分类呈负相关，这与之前的报道一致[22］．与这些发现相一致的是，血清脂联素在结直肠癌患者中的预后作用，因为这种激素的浓度已被发现与结直肠癌分期呈负相关[18，36]，高瘦素/脂联素比值已被报道为不良结局的预测因子[37］．在一项研究中，脂联素血清水平也与CRC分级呈负相关[21］．相反，在另一份报告中[38]，该激素在结肠肿瘤组织中的免疫组化表达与肿瘤分级呈正相关。最近对各种癌细胞系的研究表明，脂联素具有抗增殖和促凋亡的作用[22，39，40］．对于CRC细胞系，脂联素处理后的生长抑制和凋亡诱导归因于MAPK/mTOR通路的激活[41，42］．此外，最近的研究表明，AdipoR1在淋巴结转移肿瘤中的表达降低[21，23]及静脉侵入[25］．上述结果支持AdipoR1过表达是CRC肿瘤发生的早期事件，也表明AdipoR1对肿瘤进展具有保护作用。

关于AdipoR2，我们发现与年级呈正相关。III级肿瘤的表达水平高于I/II级，这一发现与Byeon等人的观点不一致。[22］．但与分期或任何分期参数均无显著关系。有趣的是，关于AdipoR2和分期的文献似乎存在争议。一组与T类型、TNM分期呈正相关[21]，而其他研究者则发现AdipoR2与T类、N类、肿瘤分期、淋巴血管浸润呈负相关[22，23］．有趣的是，GLO-I与AdipoR2直接相关，而与AdipoR1没有关联。

我们还检测了AdipoR1、AdipoR2、AGE、RAGE和GLO-I在粘液性和非粘液性肿瘤中的表达差异。我们发现，在黏液性癌亚组中，除Rage外，所有这些标记物的表达均呈较高趋势，尽管具有边缘性意义，但AdipoR1和AGE似乎更为突出。据我们所知，就上述标志物而言，这是第一次对粘液性结直肠癌进行研究。

最后，在本队列中，生存分析未能揭示AGE或RAGE作为预后因素，与之前的报道相反，Dukes ' B和C病例显示RAGE阳性患者预后明显较差[33］．有趣的是，即使在TNM和AdipoR2调整后，GLO-I表达被证明是一个加重因素，尽管与低T类相关。这些发现在一组独立的患者身上得到了验证。在分期分层后，对于患者和验证队列，GLO-I的预后影响在早期维持，支持了GLO-I在CRC进展中的重要作用，最可能与糖基化副产物(如甲基乙二醛)的细胞解毒有关。CRC过表达GLO-I似乎有一个优势，可以避免甲基乙二醛诱导的细胞凋亡，导致肿瘤侵袭性和患者生存率低。考虑到最近乙醛酶抑制剂的发展[14]，我们的研究结果提出了CRC作为靶向治疗的潜在候选者。

此外，AdipoR2高表达患者的生存期明显较短，早期患者分期分层后仍然如此，多变量分析中也是如此。这一发现在一定程度上是意料之中的，因为AdipoR2免疫表达在III级肿瘤中更为突出。这是第一个脂联素受体表达与生存相关的研究，因为之前的研究未能证明如此显著的相关性[22］．有趣的是，Baressi等人[20.]研究了胃癌病例，并注意到AdipoR1阳性与较长的生存期显著相关，尽管多变量分析没有显示AdipoR1是一个独立的预后因素。脂联素受体与患者生存的关系还需要进一步的研究。更重要的是，我们的结果指向AdipoR1和R2在CRC中的不同作用，第一个与有利的表型有关，第二个与侵袭性表型有关。

在本研究中，我们为结直肠癌中AGE-RAGE轴、GLO-I和脂联素受体之间可能的相互作用提供了新的证据。有趣的是，这些被检测的分子似乎在结直肠癌的发生中发挥着不同的作用，而AdipoR2，特别是GLO-I的表达被引入作为潜在的新型独立预后生物标志物，对早期疾病患者具有不良意义。进一步的研究是必要的，以扩大我们的观察，以及调查其潜在的治疗意义。

AdipoR:

脂联素受体

年龄:

高级糖基化最终产物

CML:

羧甲基赖氨酸

儿童权利公约:

结直肠癌

如果留意:

乙二醛酶

HMGB1:

高机动性群箱-1

PRR:

模式识别受体

愤怒:

晚期糖基化终产物受体

我们要感谢Helen Sarlanis医学博士，她提供了先进的英语写作技能。

作者指出

作者及隶属关系

1. 雅典大学" Laikon "总医院第一病理科，医学院，Mikras Asias 75, Goudi, 11527，雅典，希腊

   Stratigoula Sakellariou, Paraskevi Fragkou, Georgia Levidou, Angelica Saetta, George Agrogiannis, Irini Theohari, Panagiota Tsioli, Efstratios Patsouris和Penelope Korkolopoulou

2. 雅典大学医学院生物化学系，希腊雅典

   Antonios N. Gargalionis, Christina Piperi, Georgia Dalagiorgou和Christos Adamopoulos

3. 希腊雅典大学医学院" Laikon "总医院病理生理科

   达沃Sougioultzis

4. 雅典大学医学院" Laikon "总医院外科第一科，希腊雅典

   Ioannis Karavokyros

5. 希腊雅典大学医学院" Laikon "总医院肿瘤科病理生理科

   Nikolaos Tsavaris

6. 希腊雅典大学医学院" Laiko "总医院辅助手术第二科

   扬尼斯·d·科斯塔基斯

7. 希腊比雷埃夫斯市" Tzaneio "总医院病理科

   Adamantia Zizi-Serbetzoglou

8. 希腊帕特雷斯"阿吉欧斯·安德烈亚斯"总医院病理科

   格拉西莫斯·p·范多罗斯

相应的作者

对应到萨凯拉里欧Stratigoula．

相互竞争的利益

作者宣称他们之间没有利益冲突。

作者的贡献

党卫军起草了手稿。PF评价免疫组化。GL进行统计分析。AG进行了标本的采集和数据库的形成。CP参与了研究的设计和手稿的编辑，并进行了Western immunoblotting。GD进行Western免疫印迹。CA进行Western免疫印迹。AS进行了MSI状态分析。GA提供新鲜组织。进行免疫组化。 SS provided the fresh tissue. PT carried out the MSI status analysis. IK performed the clinical follow up. NT performed the clinical follow up. IDK performed the clinical follow up of the cases included in the validation study. AZ evaluated the cases included in the validation study. GPV evaluated the cases included in the validation study. EP revised the manuscript. PK conceived the study and participated in the evaluation of the immunohistochemistry. All authors read and approved the final manuscript.

Stratigoula Sakellariou, Paraskevi Fragkou和Georgia Levidou对这项工作做出了同样的贡献。

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