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研究文章

一种抗生素的普遍效应在人类肠道微生物群,揭示了深16 s rRNA测序

  • 莱斯Dethlefsen,

    从属关系微生物学和免疫学,斯坦福大学,斯坦福大学,加州,美国,医学系,斯坦福大学,斯坦福大学,加州,美国

    ⨯
  • 苏休斯,

    联系约瑟芬湾保罗中心比较分子生物学和进化,海洋生物实验室,伍兹霍尔,麻萨诸塞州,美国

    ⨯
  • 米切尔,L·索金说

    联系约瑟芬湾保罗中心比较分子生物学和进化,海洋生物实验室,伍兹霍尔,麻萨诸塞州,美国

    ⨯
  • 大卫Relman

    人信件应该解决。电子邮件:relman@stanford.edu

    从属关系微生物学和免疫学,斯坦福大学,斯坦福大学,加州,美国,医学系,斯坦福大学,斯坦福大学,加州,美国,退伍军人事务部帕洛阿尔托卫生保健系统,帕洛阿尔托,加州,美国

    ⨯

文摘

人类肠道菌群对宿主的健康至关重要,在营养方面发挥重要作用,开发、新陈代谢、抗病原体和调节免疫反应。抗生素可能会扰乱这些交互协同进化,导致急性或慢性疾病在一些个人。我们理解antibiotic-associated干扰微生物群是有限的可怜的灵敏度,分辨率不足,目前的研究方法的重要成本。焦磷酸测序技术来生成大量的使用16 s rDNA序列标签绕过这些限制,可以揭示先前未知的方面的“罕见的生物圈。“我们调查了三个人类健康的远端肠道细菌群落与环丙沙星治疗前后,获得7000多个完整的核糖体rna序列和超过900000焦磷酸测序读从两个核糖体rna基因的变异度高的地区。一个同伴在公共科学图书馆遗传学(见休斯et al ., doi:10.1371 / journal.pgen.1000255)表明,这些方法的分类信息是一致的。焦磷酸测序V6和V3的变量地区确定了3300 - 5700年集体类群,占超过99%的可变区序列标签,可以获得这些样本。环丙沙星治疗影响了大约三分之一的丰富的肠道细菌类群,减少分类丰富,多样性和均匀度的社区。然而,这种效应的大小不同的个体,和一些类群显示个人间的变化对环丙沙星的回应。当个体间差异的社区组成的最大来源样本之间的差异,我们发现两个不相关的人共享一个令人惊讶的相似程度的社区。在所有的三个人,社区的分类构成其预处理状态相似到治疗结束后4周,但一些类群未能在6个月内恢复。这些普遍的环丙沙星对社区的影响成分与参与者的报告之前正常的肠道功能和假设只有温和的环丙沙星对肠道菌群的影响。这些观察结果支持假设人类肠道微生物群的功能冗余。迅速恢复到预处理社区组成的象征因素促进社会适应力,这值得未来调查的性质。

作者总结

肠道菌群对人体健康至关重要,影响营养、代谢、抗病原体,其他进程。抗生素可能会破坏这些相互作用,引起急性疾病,以及导致慢性健康问题,尽管技术挑战阻碍了在这方面的研究。一些最近的研究未受教育的特征和复杂的微生物群落通过应用一个新的、大规模并行技术获得成千上万的序列中的一个特定变量的区域小亚基核糖体rna基因。这些短序列提供了多样性的象征。我们使用这种技术来追踪人类肠道菌群的变化三个健康与抗生素环丙沙星治疗前后,高灵敏度和分辨率,不牺牲覆盖的广度。与以前的结果一致,我们发现这些个体的微生物群在属水平相似,但在细尺度个人间差异明显。环丙沙星减少肠道菌群的多样性,显著影响大约三分之一的细菌类群。尽管普遍的扰动,社区的成员在很大程度上4周内返回到预处理状态。

引用:ML, Dethlefsen L,针对S·索金说Relman DA(2008)的普遍影响抗生素在人类肠道微生物群,揭示了深16 S rRNA测序。公共科学图书馆杂志6 (11):e280。https://doi.org/10.1371/journal.pbio.0060280

学术编辑器:乔纳森·a·艾森,加州大学戴维斯分校美利坚合众国

收到:2008年5月27日;接受:2008年10月6日;发表:2008年11月18日

版权:©2008 Dethlefsen et al。这是一个开放的文章下分布式知识共享归属许可条款,允许无限制的使用、分配、和繁殖在任何媒介,被认为提供了原作者和来源。

资助:这项工作得到了多丽丝公爵慈善信托基金(DAR卓越临床科学家奖)和美国国立卫生研究院(主任先驱奖DP1OD000964 DAR)。支持也来自伍兹霍尔海洋和人类健康中心从美国国立卫生研究院和美国国家科学基金会(NIH / NIEHS 1 P50 ES012742-01和NSF /奥西0430724 - j斯蒂πHGM和美国职业足球大联盟)。

利益冲突:作者宣称没有利益冲突存在。

缩写:法,antibiotic-associated腹泻;Cp,环丙沙星;罗斯福,错误发现率;OTU操作分类单位;主成分分析,主成分分析

介绍

专门的微生物群居住在皮肤,粘膜表面,和胃肠道的人类和其他脊椎动物从出生到死亡,与迄今为止最大的人群结肠癌(1,2]。人类依靠本国对营养和抵抗病原体的入侵微生物群(3- - - - - -6];此外,最近的发现表明共生微生物发展做出重要贡献,新陈代谢,和宿主的免疫反应7- - - - - -10]。密切相关,有益的,human-microbe相互作用可以改变现代生活的许多方面,包括城市化、全球旅游,饮食改变(1),但在特定抗生素(11]。的急性影响本机的肠道微生物群作用抗生素治疗范围从自限性腹泻“功能性”危及生命pseudomembranous结肠炎(12,13]。这种扰动的长期后果的human-microbial共生更难以辨别,但慢性疾病如哮喘和过敏性疾病与童年有关抗生素使用和肠道菌群的改变14- - - - - -16]。因为许多化学转换在肠道是由特定的微生物种群17对癌症[],影响18,19和肥胖20.,21),在其他条件(22),改变肠道微生物群的组成有重要但未被发现的健康影响。近似回到预处理条件通常(但不总是)发生后几天或几周内停止抗生素治疗,所评估的主观判断肠功能和整体社会的性格特征成分使用技术系统分辨率较低(23- - - - - -25]。然而,一个疗程的抗生素的影响在特定的微生物种群体内可以持续数年(26- - - - - -28]。总的来说,antibiotic-induced干扰的持续时间和程度在整个肠道菌群特征仍不佳,尤其是在物种和应变水平,社区的多样性是最大的2,29日),而我们缺乏的信息比较这些干扰正常颞社区组成的变化。

的多样性和丰富人类微生物群,尤其是肠道社区,构成了挑战研究者调查社区组成随时间的变化。费力cultivation-based技术的主要微生物的一个世纪显示只有少数的物种生活在人类结肠30.,31日]。在过去的十年中,cultivation-independent分子技术,特别是基于小亚基的核糖体RNA基因(16 s rRNA),给了我们一个更广泛和更少的偏见观点肠道微生物群(32,33]。全长16 s rRNA序列提供了最高程度的分类解析使用这种基因,但双脱氧Sanger测序的成本限制了我们调查这个多元社会的成员的能力。研究比较肠道微生物群的变化随着时间的推移或治疗经常使用替代分子技术之间更快速、更便宜比排序,但只提供降低分类解析,揭示更多丰富的社区成员(23- - - - - -25,34- - - - - -37]。这些方法可以集中更多的局限于特定的分类群,促进风险的分类单元的调查,但以牺牲一个更广泛的观点的社区组成,可能揭示重要微生物的相互作用。

焦磷酸测序改善了这些约束通过生成一个更大数量的基因序列数据以更低的成本(38]。用这种方法和克隆的建立方法库测序,从样品提取DNA, PCR引物互补保守地区的16 s rRNA用于放大中介变量序列。16 s rRNA的多样性和相对丰度分析了扩增子的序列变异的代理的微生物种群多样性和相对丰富的样本。因为不文明的微生物种群的基因序列识别并不等同于传统的分类学分类、术语如“物种”或“应变”是不合适的。相反,人口推断存在序列数据的基础上被称为操作分类单元(辣子鸡),可以以不同的方式定义,在不同级别的分辨率。

克隆库和焦磷酸测序方法会受到偏见的影响PCR扩增的微生物种群的样本,但问题是减少短焦磷酸测序的扩增子(39]。焦磷酸测序克隆方法还避免了偏见的早期技术通过附加扩增子单独将珠子珠子和身体分离到picoliter-scale井放在一个专门的盘子里。更少的系统发育信息可以从单一焦磷酸测序读(最多∼230信息基地与最近技术)比从附近全长16 s rRNA基因序列与常用的引物(∼1400基地),但是跨特定变量的读取区域的基因是高度信息(40,41]。另一方面,超过200000短序列读取16 s rRNA,我们称之为标签,可以获得在一个运行的基因组定序器FLX系统。相比之下,两个先进的毛细管桑格音序器的运行需要获得最多384全长16 s rRNA序列。

Sogin和他的同事已经证明了焦磷酸测序获得的力量放大16 s rRNA的V6变量地区海洋深水和深海热液喷口样本,分析超过900000细菌和古细菌从通风系统和揭示更大的分类标签丰富(超过20000辣子鸡观测序列散度3%)比曾被报道对于任何微生物栖息地(39,42,43]。罗斯切等人遵循了类似的策略使用V9分析北美地区土壤样本(40,44),和一群由骑士都集中在一个更长的标签,包括V2地区猕猴肠道样品和在五个不同的混合微生物栖息地45,46]。计算机模拟的刘et al。43王),et al。41],Sundquist et al。47]表明,焦磷酸测序标记基因来自不同地区的不同在他们的效用的不同任务揭示微生物多样性和执行分类分类,两者都有助于使信息比较复杂的微生物群落。与从克隆生成数据库的建立方法,标签焦磷酸测序的实际表现某一特定研究的目标将取决于该地区的16 s rRNA基因分析,使用PCR引物,和微生物群落的组成样本。

在目前的研究中,我们使用焦磷酸测序标签横跨V6和V3区域以及全长16 s rRNA序列的细菌群落组成在时间序列分析粪便样本来自三个健康成人之前,期间和之后短疗程的抗生素环丙沙星(Cp)。一个同伴文献[48]报告高度的相似性在社区组成推断两个变量区域和完整的序列。在这里,我们描述人类肠道细菌的多样性更彻底,更精密的曾是不可能的。Cp有着广泛的和个性化的影响在这些社区的构成,但大多数社区成员在数周内返回了预处理丰富。

方法

参与者、治疗和抽样

健康的成年人没有采取任何抗生素在去年被招募捐粪便样本之前,期间,片刻后,环丙沙星(Cp)的5 d(500毫克,一天两次),典型的处理规定,例如,一个简单的尿路感染。大约5克样品被收集在无菌塑料容器由参与者自己并立即存储在家里冰箱直到带到实验室(几天内)存储在−80°C。从采集大量的样本,我们选择了五个时间点生成一个8-mo间隔的三个参与者分析使用全长16 s rRNA克隆库和焦磷酸测序16 s rRNA V6变量的地区。一个额外的三个样本的分析样品连同原来的15个参与者使用V3标签焦磷酸测序。参与者特点和采样和分析政权所示表1。对于每一个参与者,样本1和2(1、2、2和2 c对个人)收集Cp治疗之前,样品3(3和3 b为个人)是Cp-associated样本期间或之后立即治疗,和样品4和5是更遥远的后处理样本。从参与者获得知情同意,批准的研究协议是行政小组对人体医学研究机构审查委员会的斯坦福大学。

缩略图
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表1。

参与者和样本的特性

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.0060280.t001

DNA提取

大约200毫克的冷冻凳子的子样品添加到2.0毫升螺丝帽瓶含有玻璃珠1毫米,0.5毫米,0.1毫米直径(BioSpec产品),一直在冰上,直到1.4毫升的美国手语的缓冲QIAamp DNA凳子迷你包(试剂盒)。样本立即受到beadbeating (45 s, 4)使用FastPrep机初始孵化前(101年生物)和热化学裂解为7分钟。95°C DNA提取后的后续步骤QIAamp包协议。两个单独的抽取,每个样本的DNA池分子分析。提取控制缺乏处理粪便除此之外完全相同的通过整个过程包括进行PCR扩增(没有乐队可见),试图克隆PCR扩增子,这是不成功的。

全长16 s rRNA测序

放大全长16 s rRNA附近序列2毫升的提取的DNA作为模板在20-μl反应包含1单位AmpliTaq聚合酶(应用生物系统公司),1 x缓冲II, 1.5毫米MgCl2,20毫米tetramethylammonium氯,5% DMSO溶液,0.02% Triton x - 100,每个核苷酸的100海里,和20 nM每个正向和反向引物(集成DNA技术)。正向引物的混合物90%细菌底漆8 f (5′-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3′)和10% 8 f-bif瞄准双歧杆菌(5′-AGGGTTCGATTCTGGCTCAG-3′);三个域名反向引物配对1391 r (5′-GACGGGCGGTGTGTRCA-3′)。热循环涉及5分钟变性在95°C紧随其后日周期的94°C(30岁),55°C(30岁),和72°C(90年代),最后一个在72°C扩展了8分钟。尽可能少的周期被用来产生一个微弱的预期大小的乐队在紫外光照后在1%的琼脂糖电泳5-μl反应产品minigel含有溴化乙锭1毫米。两个4-cycle 50-μl整理每个样品进行PCR反应消除heteroduplexes [49],5-μl整除最初的PCR产物混合物PCR模板和其他条件不变。每样产品的两个整理PCR反应结合,纯化使用QIAquick PCR净化列(试剂盒)和发送到j·克雷格·文特尔研究所(马里兰州罗克维尔市)克隆和自动双向双脱氧法测序。

正向和反向测序读组装使用phr / Phrap /缺点程序套件默认参数(50- - - - - -52];装配序列一致通过NAST算法(53在绿色煤电网站()http://greengenes.lbl.gov/)[54]。对齐序列检查嵌合体使用版本2的柏勒罗丰的绿色煤电实现,有99%相似,一个值得信赖的1250个核苷酸的序列阈值绕过检查,和拒绝假定和阈下嵌合体无论分歧比率。10062装配序列,203并没有导致NAST对齐,其中包括V3和V6地区,7208年和2651年被排除在外嵌合体,留下完整的序列进行分析。不使用默认设置在柏勒罗丰识别嵌合体(散度比> 1.1)会排斥少766序列的分析,但排除这些序列没有明显影响社区的推断分类组成(文本S1)。全长序列的分类归属确定使用RDP的分类器工具,引导阈值(80%41]。

NAST-aligned全长序列导入ARB [55)和奥尔森的遗传距离矩阵计算距离校正使用Hugenholtz版本的车道面具(包括绿色煤电ARB数据库)排除可疑对齐的区域;1241列被保留。距离矩阵是使用0.01遗传距离最远邻阈值在DOTUR version 1.53 [561295操作分类单元(OTU)指定0.01)。全长序列存入基因库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Genbank/;加入数量:EU761594-EU768801)。

16 s rRNA标签焦磷酸测序

扩增子库为16 s rRNA V6地区焦生成推荐454生命科学,使用相同的DNA提取完整测序,与50 ng的模板DNA(由NanoDrop 1000分光光度计,NanoDrop技术)在50-μl 30-cycle反应。PCR试剂和热循环参数是那些建议的协议,除了退火温度从57°C减少到55°C。每个PAGE-purified融合底漆(集成DNA技术)是454平台的A或B链接器/引物序列,三核苷酸键(或条形码)为每个样本是独一无二的,和序列互补的保守区域侧翼V6变量区域16 s rRNA的基因。正向引物是两个非简并的克分子数相等的混合寡核苷酸5 ' -BxxxCAACGCGAAGAACCTTACC-3′, 5 ' -BxxxATACGCGAGGAACCTTACC-3′,B代表了B链接器(5′-GCCTTGCCAGCCCGCTCAG-3′),xxx代表样本识别关键,剩下的核苷酸位置对应于967 - 985年的16 s rRNA基因(大肠杆菌编号)。5 ' -退化反向引物AxxxCGACARCCATGCASCACCT-3′,包括一个链接器(5′-GCCTCCCTCGCGCCATCAG-3′),样品键,相应的核苷酸大肠杆菌1064 - 1046位置。为每个样本被两个或三个独立的放大反应池和纯化推荐使用Ampure珠子(Agencourt)。

库的扩增子长度和浓度估计使用生物分析仪微流体设备(安捷伦),和一个克分子数相等的所有15个V6的扩增子库是用来准备(即一个链和B-linked焦磷酸测序珠子。,双向读通过乳液聚合酶链反应扩增子)使用推荐的装备和协议(454生命科学)。平等的一个链和B-linked珠子装上这两个地区的铬尖晶石板(大约825000珠/地区)。焦磷酸测序的基因组定序器FLX系统(罗氏)490881年在斯坦福大学基因组技术中心造成读取,通过机器的长度和质量标准的软件。

V3区扩增子库的准备使用相同的DNA提取的长篇和V6序列,除了新DNA提取准备样品2 c和3 b从个人,和额外的样品2 A、2 b,和3从个体中,如上所述,在表1。V3扩增子图书馆准备V6地区,使用单一50-μl PCR反应/样本,使用以下PAGE-purified引物(集成DNA技术):5 ' -BxxxxxACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′(B链接器,五聚物样本识别关键,正向引物大肠杆菌338 - 357年)和5 ' -位置AxxxxxTTACCGCGGCTGCTGGCAC-3′(五聚物键,链接器反向引物大肠杆菌533 - 515年)。准备一个链和B-linked珠子和焦磷酸测序进行如上所述,估计有900000个珠子加载铬尖晶石板的每个地区,导致593088焦磷酸测序读通过机器质量过滤器。

焦磷酸测序读V6和V3地区通过附加质量过滤器来减少总体错误率(43]。任何读取包含一个或多个模棱两可的核苷酸和读取短于50个核苷酸被丢弃。预计样品键和引物序列被修剪的近端和远端读取,和那些缺乏预期样本键和引物序列两端进一步检查。在很多情况下,预期的序列中罕见的一种识别和修剪的阅读。的起源至少其中一些罕见的底漆变异寡核苷酸合成错误是由几个特定的副本的频繁出现罕见的变异在一个示例中,虽然没有变异出现在其他样本的例子。因为独特的引物(不同样本中键和单独合成)被用来生成每个样品的扩增子库,一个合成的错误可能会影响只有一个样本。读取缺乏一个可辨认的引物序列(包括罕见变异)两端,读取仅适用于变量的一部分地区,和读取不能明确分配给一个样品被丢弃;此外,18读取V3地区身份或接近身份真核核糖体rna序列被丢弃。由此产生的数据集含有441894和490699 V3 V6标记,所有后续分析的基础。

参考数据库和OTU定义标签焦磷酸测序

V6和V3参考数据库(V6 RefDB V3 RefDB)是由公开可用的,高质量,全长16 s rRNA序列从席尔瓦发布92 (http://www.arb-silva.de/)[57从RDP分类器(获得)与分类学分类41)(引导得分最低80%)中描述(48]。版本6的区域被定义为大肠杆菌位置对应986 - 1045之间的序列引物967 f - 1046 r。V3区域被定义为大肠杆菌职位358 - 514,对应序列引物338 f - 515 r。

焦磷酸测序标签被分配的分类学分类参考序列或序列最相似的V6RefDB或V3RefDB,基于多序列比对。在这种情况下,一个标签是等距多重参考序列,标签是最解决分类的分类单元共享的至少三分之二的参考序列的标签。例如,标签与精确匹配多个参考序列将解决属水平只有至少三分之二的序列包含标签是在同一属分类引导RDP分数的80%。

一个参考序列操作分类单元(refOTU)被定义为包含所有查询标签共享同一RefDB序列(或一组序列)作为他们的最近邻。绝大多数的人类肠道焦磷酸测序获得的标签在当前的研究中(不像海洋标签(39)有一个精确的匹配或接近相应的RefDB (图1),它简化了标签和分类的定义refOTUs栖息地。在这项研究中,我们将引用一个特定的refOTU V3_TaxonrefOTU_X,分类单元most-resolved分类单元的名称分配给refOTU,和X的等级次序refOTU内分类单元从本研究基于归一化总丰度数据。

缩略图
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图1所示。遗传标记之间的距离和参考序列

每个独特的V6标记之间的遗传距离(A)和V3标签(B)和其最佳资产(或点击)在适当的参考数据库显示在纵轴(见方法详情);大量的标签显示在水平轴上的对数刻度。横向箭头表示累积总数最少最丰富的标签。离散水平行附近的符号x设在一个整数对应的核苷酸变化相对于参考序列;垂直的箭头表示累积标签总数达0,1,或2的变化。丰富的标记可能是相同的参考数据库中序列;罕见的标签显示一个范围的距离。

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.0060280.g001

统计计算

距离最近的数据库标签的比较丰富,秩丰富情节,稀疏曲线和多样性总结统计计算实际使用标签的数量没有正常化标签获得每样的数量。全长序列OTU稀疏曲线0.01年代per-tag基础上计算使用DOTUR version 1.53 [58];稀疏曲线为变量地区refOTUs计算每个样本使用估计7.5版(59]。香农多样性指数H= -Σp我ln (p我)和香农被索引EH=H/ ln (年代)(p我的比例吗我th OTU和年代辣子鸡的总数)计算使用电子表格软件。汇总统计数据多样性Cp-associated样本值的降低尾其他样品相比,假设总结统计时通常将分布式计算样本反复来自一个不变的社区。

比较样本之间的V3 refOTU丰富了纠正后从每个样本获得的不平等数量的标签。所有标签的丰度值在一个样本是乘以总规范化标签所需的因素,丰富对所有样本是43405,这是V3标签的数量从样本C5,获得最大的样本。标准化因素对于其他样品从1.072到2.087不等。主成分分析的规范化refOTU大量使用prcomp的函数统计数据2.2.1包R统计语言版本(http://www.r-project.org/)。统计评估变化丰富的个人refOTUs参与者之间或与边缘对Cp进行软件版本1.1.291 [59),应用95%置信水平对个人类群声明意义,和10%的错误发现率(罗斯福)标准声明的所有类群比较重要的在一个给定的(额外的细节文本S1)。

结果

标签数量和序列

从15个粪便样本(5每个个体A、B和C),我们得到7208附近传统PCR扩增,全长16 s rRNA序列的克隆和毛细管双脱氧法测序。从同一组15个样品,我们获得441894 V6焦磷酸测序标签(平均长度59),和来自同一样品+三个附加的样本个体(18)样品,我们获得490699 V3焦磷酸测序标记(145年平均长度)(表2)。独特的标签或序列的数量显示在每个方法都遵循着相同的等级次序的总数标签或序列(V3版本6 > >长篇)。然而,数值差距焦磷酸测序和毛细管测序是独特的标签或小比所有标签序列或序列,反映出竞争趋势标记焦磷酸测序的更高的吞吐量,但更大的分辨率全长序列。V6和V3标签refOTUs分为3316年和5671年,分别通过对比(见参考数据库方法);1295辣子鸡被确定在全长序列使用1%遗传距离阈值后掩蔽序列对齐(指定为OTU位置不确定0.01)。独特的属的数量或其他most-resolved属以上分类单元(见方法)确定序列或标签要低得多,从56 - 130,确认结论基于早期的分子人类结肠细菌的多样性的研究集中在物种和应变级别(2,29日]。

缩略图
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表2。

数量的序列,每个参与者辣子鸡,类群(A、B和C)

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.0060280.t002

丰富的焦磷酸测序标签来自这三个参与者更有可能比罕见的标签是见过的,也就是说。,完全对应一个或多个完整的16 s rRNA序列可用在公共数据库。尽管只有9%的独特V6标签和7%的独特V3标签精确匹配的参考数据库,这些都代表了90%的V6标签和85%的V3标签,因为几乎所有的丰富的标签精确匹配。100年最丰富的V6和V3标记(分别占75%和80%的所有标签),97 94 V3和V6标记完美匹配参考数据库。丰富的肠道细菌从这些参与者少由栽培菌株;只有大约一半的100最丰富的标签(55 V3和51 V6标记)完美匹配16 s rRNA序列来自菌株在文化(数据集S1)。

焦磷酸测序错误和罕见,真正的标签

最近报道的平均精度的基础比99.75%焦磷酸测序的V6地区43](在应用附加的过滤器来消除容易出错的读取)低于毛细管双脱氧法测序,虽然大大优于96%的准确率最初报道(38]。毫无疑问,一部分独特的标签在我们的数据源自焦磷酸测序错误,但个别错误产品是罕见的相对频率的正确顺序标记他们。最丰富的V6和V3标签在我们的数据(完全匹配拟杆菌dorei序列)观察31788和41153次,分别在所有三个参与者。假设一个统一的错误率每59 0.25%或145个核苷酸,大多数标签预计将无错,和error-containing标签将只有一个错误。有177个独特的V6标签在不同的数据集b . doreiV6标签在一个单核苷酸位置和缺乏任何序列完全匹配的参考数据库。最丰富的这些潜在的错误产品发生只有60倍,0.19%错误的频率b . doreiV6标签。类似地,270个不同的V3标签的不同b . doreiV3标签在只有一个位置和缺乏一个完美的数据库匹配,最丰富的发生367次。但是,我们认为这是一种罕见的,真正的标签,因为这个标记在样品的分布显著不同的b . dorei标签,与模式焦磷酸测序错误产品的预期(后段;也文本S1和数据集S2)。最丰富的产品来自于潜在的V3错误b . dorei序列发生226次,0.55%的错误标签的频率。

Sogin等人建议使用引用数据库公共全长16 s rRNA序列的定义分类单元(即。refOTUs)焦磷酸测序标记会导致分类丰富的一个保守的估计39]。这个过程也将减少焦磷酸测序错误的影响比较社区组成,由于这些错误不会导致小说的定义(但人工)分类单元。相反,大部分焦磷酸测序错误的产品将被适当的成员包含几乎相同的错误标签的refOTU从它派生的。然而,这OTU定义本质上限制了可检测分类多样性序列已经出现在公共数据库,它掩盖了真正的生物多样性每当标记源自不同的生物体被分组到单个refOTU。我们调查这个diversity-masking效果最丰富的V6和V3类群通过计算,分别为每个示例,个别罕见的丰度比标记属于同一refOTU(最常见的标签文本S1和数据集S2)。对于一个给定的罕见的标记,这一比率显著变化在样品预计不会如果罕见的标签是焦磷酸测序错误产品,因为一个特定的错误的可能性是独立起源的标签。在此基础上,四个42罕见V6标签和33 87年罕见的V3标签,我们调查不容易焦磷酸测序错误的产品来源于最常见的标记在同一refOTU (G测试,p< 0.05)。虽然这种方法不能区分所有错误,罕见的标签从焦磷酸测序错误产品,很明显,焦磷酸测序标记的基础上,分析refOTUs会掩盖一些真正的生物多样性。尽管如此,我们选择接受这个成本以确保焦磷酸测序错误没有夸大报道分类丰富,也不影响社区之间的比较。因为绝大多数的丰富的标签有精确匹配的参考数据库,分类解析的损失在当前的研究中会影响主要是稀有类群的一个子集。

探索远端人类肠道中的罕见的生物圈

排名丰度曲线的辣子鸡、来自V6 V3标签和全长序列(图2)显示标签焦磷酸测序的程度加快了我们探索人类肠道的罕见的生物圈。之间有实质性的协议特定类群的相对丰度估计的方法从门属水平(48]。在细尺度分辨率,V6的等级丰富曲线有相似的形状和V3 refOTUs和长篇OTU0.01年代,少数优势类群和更丰富的类群的长尾(图2)。标签焦磷酸测序识别更多的辣子鸡比被一个大型的、传统的16 s rRNA调查,但也许更重要的,有许多的辣子鸡,焦磷酸测序提供了更精确的估计的相对丰度,和一种改进的信心的检测。例如,869 1295年OTU0.01年代克隆全长序列中检测到单例,只由一个序列。最好的估计每个单件OTU的相对丰度0.01在池社区1/7,208或1.4×10−4,但是这个估计的95%置信区间(假设检测事件)的泊松分布范围在近两个数量级,7.3×10−6-6.6×10−4。只有63%的几率为一个特定的分类单元为1.4×10−4相对丰度被发现在一个样本的7208个克隆,所以这些单例辣子鸡的存在(或缺乏)不提供一个健壮的基础对比样本。refOTU V6中出现65倍或V3标签会有相同的单例OTU估计的相对丰度0.01在克隆库,但更窄的95%置信区间为1.0×10−4-1.7×10−4。有1122 refOTUs汇集V6图书馆经常发生(≥5次)估计,其检测的概率至少99%;这些类群的相对丰度估计范围从7.4×10−21.1×10−5。汇集V3库有1759 refOTUs至少有99%的概率检测、相对丰度范围近4个数量级,从9.3×10−21.0×10−5因为焦磷酸测序获得的深度允许适度高信心的检测对于许多罕见的稀有类群,它们的存在与否是比较样品的信息。相比之下,在汇集克隆库,只有199 OTU0.01(相对丰度从4.8×10−26.8×10−4),至少有99%的概率估计检测。

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图2。排名丰度曲线

OTU富足是显示在垂直轴上的对数刻度;辣子鸡方法)中描述(定义为沿水平轴排序中列出。冲水平线的丰度5对应估计检测的概率为99%,外观的基础上一种罕见OTU在标签或序列库根据泊松分布。比较V6、V3和完整的库所示(一个);每个主题丰富V6和V3 refOTUs所示(B和C)。V3的最大V3 refOTU丰度和数量对个人refOTUs高于其他参与者(C),因为这个主题三个额外的样品进行了分析。

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排名丰度曲线的V6和V3类群在每个个体所示图2B和2V6 refOTUs c . 1673 - 1745和2592 - 3319 V3 refOTUs被发现个人,提供最小的估计数量的菌株存在于一个人在一个8月间隔。考虑所有的采样时刻在一起,V6 refOTUs之间539 - 552和680 - 810 V3 refOTUs被发现在每个99%信心的检测或以上,与66 - 98年的长篇OTU相比0.01每一个人。

稀疏曲线可以用来评估完成的程度分类的一项调查,即。,how closely the observed taxonomic richness approaches the endpoint of all the taxa detectable with a particular method for that set of samples [60]。图3表明OTU0.01稀疏曲线急剧上升超过V6或V3 refOTUs曲线,它反映了更大的分类解决这个典型OTU定义适用于完整的序列,而焦refOTU定义标签。另一方面,尽管这组7208序列是最大的全长16 s rRNA序列数据集从人类微生物群(或任何环境),V6和V3标记焦磷酸测序的稀疏曲线最终上升更高和显示曲率比OTU向水平0.01曲线。这些特性表明,单一运行FLX的音序器针对V6或V3标记的人类肠道微生物群可以揭示更多的类群,并获取更大比例的可检测的分类单元,比一个更广泛的努力指向全长16 s rRNA克隆测序。

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图3。稀疏曲线

纵轴显示的辣子鸡的数量将被发现后取样标签或序列的数量显示在水平轴上。曲率对水平表明所需增加的测序工作观察小说辣子鸡只有罕见的辣子鸡仍有待发现。文本框显示最终的观察OTU丰富(O),范围估计OTU丰富性的王牌,冰,曹国伟1和曹国伟2非参数估计(E) (61年- - - - - -63年),和良好的覆盖(C) (64年为每个方法。非参数估计表明,总OTU丰富性远远高于目前观察到的,但是被低估了真正的丰富当观测的数量(即。、标签或序列)是相对于小社区的大小(60,63年]。良好的覆盖,标签或序列中发现的比例辣子鸡至少包含一个成员,是一个估计的一个标签或序列的概率从池中随意抽出的扩增子将属于一个OTU已经被检测到。

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然而,基于调查绝不是完整的,如图所示,大量的单例refOTUs V6和V3数据(分别为1361/3316和2306/5671)。非参数估计的总refOTU丰富(61年- - - - - -63年]60 - 70%高于观察到的丰富性,在5300 - 5700的范围refOTUs V6标签和8875 - 9650年refOTUs V3的标签。这些大差异观察和估计丰富,估计20 - 35%增加丰富性过去一半的抽样(图S1)显示欠采样情况下,非参数估计低估真正的丰富性(60,63年]。许多稀有的生物学意义,未被注意的类群暗示了这些估计是未知的。

而稀疏和丰富性估计考虑调查完成识别和身份不明的分类群的角度来看,报道认为完成从个人的角度来看标签或序列。良好的覆盖64年),选择的可能性估计一个标签或序列的随机样本将属于一个OTU已经被确认的数据集,是V6和V3数据的99.2%和99.5%,分别与88%的全长序列。换句话说,我们预计超过100附加标记需要测序为了检测新refOTU变量地区,而平均不到10新全长序列将足以检测新的OTU0.01。

一个熟悉的社区能细微变化和无特征分类单元

的热图图4在18显示了相对丰富的样本1450 V3 refOTUs规范化总丰度至少10。(因为标准化因素高达两个样本,这对应于至少5观察标记,检测的阈值为99%概率)。所有统计对比样品,(例如,PCA分析和识别不同的类群响应治疗Cp)使用规范化的这1450个类群。规范化V3 refOTU丰度在三个最丰富的属,拟杆菌,Faecalibacter,Roseburia更详细所示图4B -4D,完成refOTU丰度矩阵作为样本S3数据集。最显著的特征图4符合我们目前的理解人类远端肠道微生物群(1,2,29日,30.):(1)社区的大多数成员属于少数属内的拟杆菌门和壁厚菌门类群,与变形菌门和放线菌发生更频繁。(2)属属类群的多样性比拟杆菌门更大的壁厚菌门。(3)同一属往往是丰富的或罕见的所有参与者和所有时间点在平静的状态,但在细分类尺度,肠道微生物群是individualized-some refOTUs丰富在只有一两个人。

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图4。相对丰富的类群样本

热图显示每个样本的相对丰度V3 refOTUs总丰度至少10,同等数量的标签/正常化后(见样例方法)。所有面板颜色强度成正比的对数归一化OTU丰富从0到300;473年最高refOTU丰富每个样本值,显示了从300年到19964年,在最大的颜色强度。热图中的每一列代表一个样本,在个人时间顺序从左到右排列;蓝色酒吧上面列表明Cp-associated样本。每一行代表一个V3 refOTU,字母顺序排列在分类层次结构从门到属,和减少属内丰富。(一)所有1450 V3 refOTUs总规范化的至少10。左边的交错酒吧表示门(Ac =放线菌,英航=拟杆菌门,Fi =壁厚菌门,公关=变形菌门,Ve = Verrucomicrobia)。右边的数字代表著名的属或更高的分类排名当refOTUs不能分类(见属水平方法详情):1。双歧杆菌,2。拟杆菌3。Parabacteroides4。Alistipes,5。Oscillospira6。Dialister7。梭状芽胞杆菌8。Dorea9。Faecalibacterium10。Subdoligranulum11。Clostridiaceae(家庭),12。真细菌,13岁。Anaerostipes,14。Coprococcus和毛螺菌属(2)薄带在这个位置),15。Roseburia16。瘤胃球菌属,17岁。Lachnospiraceae(家庭),18岁。梭菌属的(订单),19。厚壁菌门(门),20。Sutterella,21岁。Akkermansia。

(罪犯)归一化相对丰富的细节(相同的数据(A))的V3 refOTUs三个最丰富的属,拟杆菌,Faecalibacterium,Roseburia。

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可以用额外的观察图4和S3数据集也符合之前的数据,虽然可能不再那么广泛赞赏:(4)颞可变性与Cp无关治疗存在在每一个个体,(尤其是个人的),虽然它不是像个人间差异明显。(5)总共有十门的肠道微生物群中找到这些参与者(每人六十九),其中一些是最近才发现的。第五个最丰富的门是Verrucomicrobia(1997年)65年),在几乎所有标签都属Akkermansia(2004年)66年]。Akkermansia是相当的丰富整个家庭肠杆菌科包括大肠杆菌第一种描述结肠细菌。(6)2008年,丰富,但一个个细菌类群仍在人类肠道中找到。第六个最丰富的refOTU V3_梭菌属的_refOTU_2,占3.5%的V3标签。占主导地位的标签在这个refOTU完全匹配203 V3 RefDB克隆的序列,但没有从培养生物序列。203年这些序列,29日短于1200核苷酸或嵌合;剩余的174序列形成一个进化枝排除任何培养生物。成对遗传距离在这个进化枝平均为0.9%,而距离序列最相似的序列在进化枝从种植株平均10%,暗示小说的存在从培养细菌物种不同大致家庭级别(数据集S4和图S2)。

全社区的主人个性和Cp治疗的后果

一个戏剧性的Cp对许多类群的影响也可以看到图4,虽然在A和B的人效果明显强于个人c .生态多样性统计数据证实了这种印象,如图所示图5。Cp治疗显著降低Cp-associated样本分类丰富个人A和B (p< 10−4和p分别为< 0.005)但不是C (p= 0.24)。香农多样性指数降低Cp治疗H(p< 10−5在所有情况下)和香农被索引EH(p< 10−5对于A和B,p< 0.05 C)在所有的三个人,虽然影响较小的大小C Cp的大小影响多样性是最好由香农指数转换为一个有效传达的物种数量(67年,68年),这是减少82%,63%,36% Cp-associated样本,B和C,分别为(图S3)。没有一个指数显示治疗后4周Cp的检测效果。

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图5。多样性统计

(A)观察到的分类单元丰富(每个样本数量的V3 refOTUs);辣子鸡Cp-associated样本明显少于A和B预处理和post-Cp样本为个人(p< 0.005),而不是个人C (p= 0.129)。

香农多样性指数(B);Cp-associated样本多样性显著低于其他样本为所有个人(p< 0.001)。

(C)香农被指数;OTU丰富Cp-associated样品均匀分布显著低于OTU丰富在其他样本为所有个人(p< 0.001为A和B,p< 0.05 C)。公式多样性和均匀度的方法;意义是评估的概率Cp-associated值是来自低尾正态分布的均值和方差计算从其他样本。

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主成分分析(PCA)的对数转换的相对丰度V3 refOTUs (图6)确认样本之间的差异的主要来源inter-individual差异和Cp治疗。个体之间的差异主要由第一个B和其他人被抓获PCA轴,占35.8%的样本之间的差异。Cp-associated样品分开non-Cp样品相同的个体主要沿着PCA轴2,占18.6%的inter-sample可变性。Cp-associated样本的观察A和B是沿着轴相互接近1比non-Cp样本表明,这些个体之间的一些不同的丰富的类群在其他时间变得不那么丰富的Cp后治疗。第三主成分分析轴(9.7%的变异性)似乎主要由Cp-independent颞可变性在个人,三个样品在前一周的时间间隔收集治疗Cp集群在一个极端。

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图6。主成分分析的分类单元相对丰度

主成分分析(PCA)的日志2改变了规范化丰富1450 V3 refOTUs规范化总丰度的至少十(相同的数据图4A)。Cp-associated样本所示张开符号,其他样品了符号。

(一)PCA轴1(占intersample变异的35.3%)分离样品的个人与个人A和C B;PCA轴2 (intersample变异的18.2%)分离Cp-associated样本。他人Cp-associated样本的分离是最大的个人,中间为B和C,至少符合热图(图4)和多样性统计(图5)。

(B) PCA轴3 (intersample变异的9.7%)捕获颞可变性non-Cp样本的个体,并在较小程度上,个人c三个样本收集的个人在治疗前一周Cp集群在一个极端的轴3的范围值。

(C) PCA轴2与PCA轴3。

(D)小石子情节显示比例的方差解释第一个5 PCA轴;在0.059的虚线表示的数量为每个轴用随机方差期望,不相关的数据。

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个人间似曾相识的上下文的变化在人类微生物群(30.,69年- - - - - -71年),肠道社区个体的相似性A和C是意想不到的。没有一个研究参与者是相关的,他们也不一起生活或者工作,和个人B和C似乎是基于主机的最相似的特征,如性别、种族和地理起源(表1)。因此,其他因素(如饮食),没有调查研究中可能有重要影响肠道社区从个人的相似性和C。

日志转换分类单元的相对丰度PCA之前减少了丰富的类群的影响相对比较丰富的类群;它有一个影响执行任何转换之间的中间,使丰富的类群主导inter-sample可变性,并扩展数据样本之间的每个分类单元的可变性,从而是加权平均。毫不奇怪,第一轴的PCA untransformed refOTU数据解释更高比例的总变异性(因为少数类群占大多数的变化);在这种情况下,个别C的Cp-associated和non-Cp样本之间的区别是淹没在颞可变性non-Cp样本的个人(图S4)。另一方面,PCA,解释变异性初始轴的比例较低,但Cp-associated A和C都清楚地分离样品同一方向在轴2从一个集群包含所有个人non-Cp-associated样本(图S4B)。与多样性统计,PCA(无论丰富转换)并没有透露任何Cp效应4周治疗后,可以区别于其他来源的颞可变性。警告解释PCA与任何权重方案是每个refOTU同样被视为不同的所有其他人。初步结果分类技术,被认为是一系列refOTU亲缘显示小Cp-associated变异性的大小相对于个人间的大小不同的社区组成(未发表的数据)。

特定类群参与社区的变化

超过三分之一的归一化总丰度的V3 refOTUs十个或更多(528/1,450)在丰富参与者之间显著不同(p< 0.05,2.9%罗斯福)。之间不同的类群的受试者包括64 100最丰富的refOTUs,即。,那些代表0.2%或更多的标签。这些丰富的类群的考试证明保持较高的系统分辨率的重要性在标签焦磷酸测序数据的分析(数据集S5)。64 refOTUs丰富多样的主题之间代表23个不同的属或其他most-resolved类群在属的水平。然而,当这些属和更具包容性类群比较,发现只有11的23个类群不同个体间(p< 0.05)。例如,100年的19日最丰富的V3 refOTUs属于属拟杆菌明显,其中18个不同个体间(图7)。然而,大量的拟杆菌属个人之间没有显著差异。

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图7。丰富的属的分类单元拟杆菌

每个主题的相对丰度拟杆菌V3 refOTUs,表示为所有V3标签的比例从这个话题。19最丰富的拟杆菌refOTUs从第一到第91届最丰富的类群。十八岁的19拟杆菌refOTUs丰富主题之间的显著差异(p< 0.05,罗斯福= 1.9%,NS是例外),但丰富的拟杆菌作为一个整体不(属p= 0.075,富兰克林·德兰诺·罗斯福15%)。数字传说表明内refOTUs的等级次序标准化的丰度拟杆菌,对应于指定OTU根据公约的报告(即。,“1”代表V3_Bacteroides_refOTU_1)。的主要标记在15 19最丰富拟杆菌refOTUs有完美匹配参考序列栽培物种命名的传奇。

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我们测试分类单元的重要应对Cp通过寻找两种模式:一个区别Cp-associated样品和其他样品的相对丰度(模式1),或区别pre-Cp样本与样本收集的相对丰度在治疗期间和治疗后(模式2)。可检测Cp响应在一个特定的分类单元可以是一个Cp活动的直接影响,也可以是由生态与其他类群之间的互动。因为这些数据代表相对丰富,分类单元保持恒定的绝对丰度总社区丰度下降将代表越来越多的社区。比较所有人我们表示refOTU大量样本的异常日志数量从平均日志refOTU丰富的个体;这个过程而变化,相对的,不是绝对丰度在个人。Cp效应被发现在30%的refOTUs(442/1,450)测试所有个体,根据模式1(428类群,p< 0.05,7.7%罗斯福)和更少的根据模式2(46个类群,p罗斯福< 0.005,10%;32个类群都重要根据模式)(数据集S6)。模式1的优势是预期的基于主成分分析的结果所示图6;Cp-associated样品不同于其他在每一个主题,但没有明显的分离的预处理和post-Cp样本在主PCA轴。

许多丰富的类群发现显著变化对Cp参与者(中似乎有不同的反应图8),这表明测试Cp反应在每一个人可能只显示额外的类群,对Cp在某些科目。测试只有在,例如,显示,25% (314/1,260)refOTUs不同响应Cp(模式1:314重要类群,p罗斯福< 0.05,6.9%;模式2:1分类单元意义重大,p< 104,1.5%的罗斯福,这种分类是重要的模式1)(数据集S7)。略低于一半的类群(158/321)被发现时Cp响应测试所有个人;类群发现是重要的在一个和所有人都集中在更丰富的类群。从只有一个Cp-associated样本数据,我们还不能进行一个类似的比较在个人B和C,但肠道微生物群的Cp反应似乎是个性化的,特别是对于丰富社区的成员。

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图8。个性化的Cp的反应

规范化丰富的纵轴显示选定V3 refOTUs(尺度在不同板);样品是沿水平轴以及时间顺序排序。张开符号Cp-associated样本所示。(a) 8个分类群在90最丰富的V3 refOTUs显示对比对Cp个体的反应。颞可变性有时也很明显与Cp使用无关。

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讨论

我们应用16 s rRNA标签et al焦磷酸测序的策略·索金说。39)描述远端人类肠道细菌的数量,构成的主要社会人类微生物群和地球上人口最稠密的微生物栖息地之一。这种方法显示了一种抗生素的普遍影响,被认为是相对良性的肠道微生物群,和人类肠道微生物群的弹性扰动。如图所示与海洋、土壤和猕猴内脏样品(39,42,45),大规模并行焦磷酸测序允许探索微生物多样性在复杂的社区前所未有的深度。克隆库和传统双脱氧法测序相比,标签焦磷酸测序检测更多的类群,并提供更为精确的估计的相对丰度中等和low-abundance大量的分类单元。这些数据将有助于更好的人类微生物群的生态研究,与直接的临床应用。例如,微生物群的构成在抗生素治疗可能确定病原体生长的可能性和危及生命的antibiotic-associated腹泻(AAD) [72年,73年];调查这个假设将取决于社区的综合特征随着时间的推移,包括罕见的和丰富的类群。四种细菌病原体与严重的操弄,标签匹配克雷伯氏菌oxytoca和perfringens梭状芽胞杆菌很少被发现在当前的研究中(9个标签在两个主题,一个标签,分别);标签匹配艰难梭状芽胞杆菌或金黄色葡萄球菌也不见了。这些病原体的稀有和缺乏严重AAD在当前的研究中并不令人惊讶,因为只有一小部分健康的年轻人。这将是巨大的利益和实用价值进行类似的研究收集的粪便样本随时间从老年病人在医院或长期护理设施,具有更高频率的抗生素使用和使用这样严重的并发症。

Cp据报道,有一个常见的胃肠道副作用率低于其他广谱抗生素,对肠道微生物多样性和影响(检测到低分辨率“指纹”技术)比克林霉素或不怎么明显,Cp amoxicillin-clavulanic酸(25]。然而,大约30%的类群的相对丰度水平不影响肠道Cp治疗所有个体进行比较时,发现和额外的类群对Cp在单一的参与者。这些变化可能是直接影响不同类群之间的抗生素敏感性的肠道微生物群组成。后增加的相对丰度的refOTUs Cp与内在的抵抗抗生素治疗可能代表类群,通常Cp-sensitive菌株,但这项研究之前已经获得性耐药,或菌株发达Cp-resistance由于当前曝光。然而,许多社区的变化很可能是通过间接影响来解释,由生态类群之间的交互,如资源竞争,槽,或者合作溶解聚合物基质(74年,75年]。

尽管普遍的肠道微生物群的干扰,肠道功能仍然正常评估参与者的主观,和社区组成样本4周治疗后颞可变性的预处理样品的范围之内。尽管目前的研究不包括样品显示的时间特性的回归社会之前的状态,pyrosequencing-based调查这种快速转换在一个复杂的社会显然是感兴趣的,并继续在我们的实验室。肠道功能的明显的连续性支持假设微生物群落的多样性提供了功能冗余(2]。与此同时,社区的主要代谢活动的连续性,即。,hydrolysis and fermentation of polysaccharides, does not necessarily imply the continuity of more specialized activities [7,76年)如胆汁转换(77年),免疫调制(9,78年),或病原体抵抗由于特定的抑制(79年,80年]。然而,肠道的快速返回社区每个预处理状态表明,并不是所有社区都支持类似的功能是等价的。定量检查的代谢转换和宿主肠道微生物群的相互作用在扰动将需要评估功能稳定。此外,这将是重要的检查肠道内的微生物群在不同网站为了欣赏当地抗生素可能影响粪便标本中不显示。流行病学研究将antibiotic-induced肠道微生物群的变化与慢性疾病(15,81年)表明,社会变化的一些后果可能不会立即明显。

负责社区韧性的因素进行调查是十分必要的。选择性力量内在社区的混合物(例如,竞争层次结构基于相对增长率和底物亲和力或干扰机制)和实施的环境(例如,组成的饮食和host-derived基质)可能会参与其中,但非选择性力量如re-colonization肠道流明的保护环境(也许是粘膜)也必须加以考虑。

当前的研究可以比较年轻和施密特,他调查改变细菌种群AAD单个self-resolving患者粪便样本之后amoxicillin-clavulanic酸处理(82年]。这些研究人员指出,没有完整的序列梭状芽胞杆菌集群XIVa抗生素治疗的第四天(0天低于20%)和从33%减少到15%的序列隶属于属Faecalibacterium;这两个群体包括大多数butyrate-producing人类肠道中的细菌(83年]。(丁酸colonocytes的首选能源。)相比之下,所有的参与者在当前的研究中经验丰富的广告。而FaecalibacteriumrefOTUs拒绝所有参与者在应对Cp,每个个体都有其他refOTUs显性标记完全匹配已知butyrate-producing生物体维持或增加他们的富足在治疗Cp(例如,V3_Roseburia_refOTU_1 B在个人比赛丁酸弧菌属fibrisolvens和Roseburia intestinalis(84年),V3_Anaerostipes_refOTU_1个人A和C,匹配的匿名butyrate-producing菌株SS2/1和SSC / 285年])。

尽管社区作为一个整体显示大量返回pre-Cp组成Cp治疗,4周内受到Cp的类群中有很多例子,没有恢复。V3_梭菌属的_refOTU_23第41和52最丰富的分类单元在个人A和C Cp治疗之前,分别出现在所有pre-Cp样本(意味着206年和158年的标签/样本);这是完全缺席Cp治疗开始后所有样品。这refOTU包括完美的比赛获得的克隆人类肠道和猪肥料泻湖,但细菌培养。最相似的栽培物种piliforme梭状芽胞杆菌和c .该菌动物传染病的病原体。V3_Bilophila_refOTU_1是最丰富的第82和79 pre-Cp refOTU在个人和C(60和91标签/样本);这是减少到平均不到两个标签样本Cp治疗后开始的。V3_Bilophila_refOTU_1回应不同的个人B,在他缺席Cp-associated样本但随后回升至pre-Cp水平。的主要标记这refOTU完全匹配Bilophila wadsworthia,一种常见的肠道微生物,通常是孤立的阑尾炎,从肠道和extraintestinal脓肿(86年]。这些持久化Cp-induced变化的临床意义尚不清楚,但一些肠道细菌是已知重要的健康影响尽管出席中等或低丰度。例如,Oxalobacter formigenes是最重要的在人类肠道中草酸下降,一个活动发展的风险减少草酸钙肾结石(22]。o . formigenes在大多数孩子被发现在低丰度,但缺席许多成年人,通常归因于其对很多抗生素(22]。标签匹配o . formigenes没有发现在当前的研究中。

某些类群丰富回应不同在不同的个体,Cp所示图8。这一结果并不令人惊讶,当我们认为抗生素耐药性,甚至高层Cp阻力产生的染色体突变(87年),可以获得更迅速的进化速度16 s rRNA的基因。尽管参与者没有采取任何抗生素在今年之前的研究中,他们暴露在早些时候Cp或其他抗生素是未知的。连接建立后,抗生素耐药菌株都可以坚持人类肠道多年没有进一步使用抗生素(28]。另一个潜在的解释不同Cp反应相同的refOTU个体之间存在间接影响;反应可能由生态联系个体之间的不同。

所示的同伴论文针对et al。48),推断出细菌群落组成在这些样本在分类水平从门到属非常相似,是否基于标签的V6 V3变量地区或全长16 s rRNA序列。所有三个技术包括PCR扩增,因此无法检测某些系统团体或可能导致倾斜程度的标记或序列相对丰富的原始材料(88年,89年]。然而,相似的结果从三个不同的组引物表明,这些引物的PCR偏见(全长序列和克隆偏见)的细菌类群出现在这个栖息地是最小的。解释这些结果作为衡量肠道细胞的相对丰度的栖息地必须用警告关于微分细胞溶菌作用和每个基因组核糖体rna基因的不平等的数字,对于任何16 s rRNA-based技术(88年,89年]。

显然,完整的序列将为任何提供尽可能高的系统分辨率遗传位点。然而,焦磷酸测序标签从两个精心挑选,短16 s rRNA基因的可变区域有足够的分辨率来显示分类丰富,超过任何先前观察到的样本host-associated微生物群落,尽管这些栖息地多样性大部分集中在物种和应变级别(2,29日]。这个成功了尽管我们使用的参考数据库定义辣子鸡,一定约束的解决标签焦磷酸测序的多样性已经公开表示16 s rRNA序列数据库。更准确的评估微生物多样性小说16 s rRNA变异占发现通过焦磷酸测序将取决于定义辣子鸡,参照标签本身(例如,使用标签序列分歧),与适当的治疗潜在的焦磷酸测序错误。一个高比例的标签在当前的研究中有一个精确匹配在数据库中,由于大量的测序工作,已经指向人类肠道微生物群(7,30.,90年]。因此,定义辣子鸡对数据库的约束并不是那么严重的栖息地可能为他人(39,42]。然而,全长16 s rRNA序列的限制调查发现罕见的肠道生物圈的成员之间的对比证明了丰富的标签在这项研究中,几乎所有的数据库中有精确匹配,和罕见的标签,这发生在一系列距离他们最近的数据库匹配(图1)。

这项研究证实了超过5600的存在在人类肠道细菌类群,超过之前预测的基础上丰富非参数估计和全长16 s rRNA测序研究[29日,30.),但单例辣子鸡的存在在我们的数据仍然会导致更大的预测丰富的栖息地。一直感激,高度不均匀的丰度分布类群中这个社区(图1,S3数据集)阻碍通过传统的测序方法识别的稀有类群。然而,报道值超过99%为V6和V3数据对应估计,不到1%的所有检测16 s rRNA标记在这些样本属于类群尚未被发现。单独的罕见的,未被注意的类群在这些样品不太可能超过0.001%的16 s rRNA基因,我们大约99%有信心的相对丰度的检测。因为很多不同的参考标签完全匹配的标签获得在这项研究中,我们得出结论,大量的细菌类群之前确认为肠道居民的前16 s rRNA测序研究可以同时或顺序出现在一个单一的个体,尽管不同的丰度。建议在最近修订的格言主人召唤,“一切可能无处不在,但不是等量”(91年]。这个结果挑战微生物生态学家占持久的差异之间的微生物群的组成个体,通过持续的选择性力量,不同个体之间,如饮食和宿主基因型,或由创始人的影响等因素和特定的共生互动,稳定社会构成。然而,任何解释也必须占颞可变性一些类群所示,和社区的弹性扰动包括其组成群体的一个重要部分。

支持信息

数据集S1。RefDB丰富的V6和V3标签

文件列出所有全长序列包含变量的区域标记,是最好的RefDB(或包含一组等距最佳RefDB支安打)100年最丰富的V6和V3标签。

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.0060280.sd001

(7.57 MB XLS)

数据集S2。评估非惯用的标签在refOTU焦磷酸测序错误的产品

文件实现了G测试比较显性标记的样本分布在10个最丰富的V6和V3 refOTUs少的标记的样本分布在同一refOTU。通过识别样本分布存在显著差异,测试可以区分一些真正的low-abundance标签和焦磷酸测序错误的产品。

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.0060280.sd002

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S3数据集。V6和V3 refOTU丰度矩阵

文件给出了样本分布和分类分类的V6和V3 refOTUs。

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.0060280.sd003

(2.84 MB XLS)

数据集S4。V3_之间的遗传距离梭菌属的_refOTU_2和最近的栽培品种

文件包含一个距离矩阵包括174年全长16 s rRNA序列包含V3地区在V3_占主导地位的标签是一样的梭菌属的_refOTU_2以及54全长16 s rRNA序列从最密切相关的栽培品种。

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.0060280.sd004

(543 KB XLS)

数据集S5。参与者之间V3 refOTU比较丰富

文件包含边缘软件输出清单个人P值和累积罗斯福(称为Q值)为个人间V3 refOTU丰度变化的考验。

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.0060280.sd005

(189 KB XLS)

数据集S6。评估V3 refOTU Cp响应的丰度在所有参与者

文件包含边缘软件输出清单个人P值和累积罗斯福(称为Q值)的测试Cp反应V3 refOTU丰度在所有参与者根据模式1 (Cp-associated与其他样品)和2 (pre-Cp与post-Cp)模式。

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.0060280.sd006

(251 KB XLS)

数据集S7。评估V3 refOTU Cp响应的丰度在单独的一个

文件包含边缘软件输出清单个人P值和累积罗斯福(称为Q值)的测试Cp反应V3 refOTU丰富个人根据模式1 (Cp-associated与其他样品)和2 (pre-ciprofloxacin与post-Cp)模式。

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.0060280.sd007

(219 KB XLS)

图S1。稀疏的OTU丰富估计

稀疏曲线的四个OTU丰富的非参数估计,基于发病率(冰,曹国伟2)或相对丰度(ACE,曹国伟1)refOTUs的样品比较观察refOTU丰富性的V6 (A)和V3 refOTUs (B),观察和估计的巨大差距OTU丰富,和所有的上升轨迹估计过去一半的抽样(虚线)的权利,表明估计丰富太低,并将继续增加额外的取样。

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.0060280.sg001

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图S2。不文明的分类单元V3_梭菌属的_refOTU_2

最大似然的种系发生树(计算通过AxML Arb(使用默认参数55])显示了一个进化枝之间的关系包含174全身V3 RefDB 16 s rRNA序列与V3_精确匹配梭菌属的_refOTU_2从栽培菌株和最密切相关的序列。树的使用大肠杆菌序列作为外围集团(没有显示)。图中所示的菌株被选为最接近的邻国V3_梭菌属的_refOTU_2集团基于邻居加入树421序列组成的所有可用的模式菌株的序列梭菌属的和Lachnospirales和完整的,高质量的序列从栽培菌株被RDP SeqMatch函数41]20的最近的邻居的八V3 RefDB序列选择代表V3_中的多样性梭菌属的_refOTU_2进化枝。203 V3 V3_ RefDB序列匹配梭菌属的_refOTU_2, 29日被排除在分析怀疑嵌合体由于以下一个或多个:未能结合RDP自动调整器,被标记为“怀疑:在RDP数据库中,或被野鸭标记(92年)作为一个可能嵌合体相比,序列的集合中使用邻居加入树上面。

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图S3。Cp效果评估通过有效的分类单元的数量

Cp减少refOTUs[的有效数字67年]在肠道细菌多样性社区评估的顺序零(0D) (A)、订单(1两个(D) (B),和秩序2D) (C)多样性。不同的订单不同罕见的相对重要性在计算多样性指数和丰富的类群。使用一个有效的类群多样性的单位克服困难与传统措施如Shannon-Weiner指数(图5B)和Gini-Simpson指数测量单位不相称的,没有自然的解释。一个有效的分类单元的数量解释为同样丰富的类群的数量会导致相同的计算多样性社区进行调查。0D无视丰富考虑罕见和丰富的类群同样重要,因此,相当于分类单元丰富所示图5一个。1D认为类群多样性做出贡献比例相对丰度(如Shannon-Weiner指数,比较图5B和S3B),2D重类群比例相对丰度的平方(如Gini-Simpson指数)。Cp-associated样本中显著降低1D和2D所有个体比其他样本。

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图S4。Untransformed和按比例缩小的主成分分析

转换应用到分类单元大量数据样本的相似性,利用主成分分析法(PCA)评估的影响。PCA untransformed V3 refOTU丰富数据强调了少量的高度丰富的类群(A)。在这种情况下,第一主成分分析轴捕捉单个B和其他社区之间的差异,以及不同的社区Cp-affected样品和其他样品的个人答:第二个PCA轴Cp-associated样本的差异反映了个人社区组成的A和B的变化Cp-associated样本个体C不太明显比其他个人(图4- - - - - -6与untransformed丰度数据),个别C属于集群的Cp-associated样本non-Cp样本的个人和C的影响完全由扩展丰富可以删除数据,每个分类单元的inter-sample方差加权同样(B)。在这种情况下两个人的Cp-associated样本和C是流离失所的同一方向在PCA轴2从集群non-Cp这些个体的样本。然而,Cp-associated样品不太远离non-Cp样本内个人B一起考虑,这些结果表明,C Cp在个人的影响涉及身份的变化更丰富的类群,而在个别B的影响还包括大的变化丰富的类群。Cp-associated个人变化涉及许多相同的类群,在个别C,但丰富的类群的变化更明显。

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文本S1。支持方法

支持嵌合体识别方法,分析焦磷酸测序错误,和罕见的真正的标签,和比较丰富的分类单元在使用罗斯福标准样品

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.0060280.sd008

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确认

我们感谢凯伦Nelson和曼尼Torralba援助的测序长篇rDNA库j·克雷格·文特尔研究所和罗克珊娜贾利利,Farbod Babrzadeh,和Baback Gharizadeh斯坦福基因组技术中心的杰出的援助和焦磷酸测序。我们也感谢Relman实验室成员的有益的讨论。

作者的贡献

LD、MLS和DAR的构思和设计实验。LD进行了实验。LD、SMH MLS, DAR分析数据。LD、SMH MLS, DAR贡献试剂/材料/分析工具。LD和DAR写道。

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