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研究文章

多聚IC刺激后，树突状细胞的成熟和代谢转移到糖酵解需要直接I型IFN而不是MDA5/TLR3的激活

  • 奥斯汀Pantel，

    与Austin Pantel, Angela Teixeira共同为这项工作做出了贡献

    联系美利坚合众国纽约洛克菲勒大学细胞生理学和免疫学实验室和克里斯托弗·h·布朗免疫和免疫疾病中心

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  • 安吉拉•特谢拉，

    与Austin Pantel, Angela Teixeira共同为这项工作做出了贡献

    联系美利坚合众国纽约洛克菲勒大学细胞生理学和免疫学实验室和克里斯托弗·h·布朗免疫和免疫疾病中心

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  • 伊莱亚斯哈达德,

    联系美国佛罗里达州圣露西港佛罗里达疫苗和基因治疗研究所

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  • 伊丽莎白·g·伍德，

    联系英国伦敦玛丽女王伦敦大学巴特威廉哈维研究所和伦敦医学和牙科学院

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  • 拉尔夫·m·斯坦曼__,

    __已故。

    RMS和MPL对这项工作也做出了同样的贡献。

    联系美利坚合众国纽约洛克菲勒大学细胞生理学和免疫学实验室和克里斯托弗·h·布朗免疫和免疫疾病中心

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  • M.宝拉·朗吉

    m.longhi@qmul.ac.uk

    RMS和MPL对这项工作也做出了同样的贡献。

    从属关系美利坚合众国纽约洛克菲勒大学细胞生理学和免疫学实验室和克里斯托弗·布朗免疫和免疫疾病中心，英国伦敦伦敦玛丽女王伦敦大学巴特威廉·哈维研究所和伦敦医学和牙科学院

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摘要

I型干扰素(IFNs)在直接抗病毒防御以及连接先天和适应性免疫反应中发挥重要作用。在树突状细胞(dc)上，ifn促进它们的激活并促进CD8+和CD4+T细胞启动。然而，IFNs在体内调控树突状细胞成熟和免疫原性的精确分子机制尚未得到深入研究。本研究表明，在TLR配体聚IC的体内刺激后，IFNs主导了dc的转录变化。与TLR3/mda5直接信号通路相比，IFNs在所有与DC免疫原性相关的通路中都需要上调。此外，代谢途径，特别是从氧化磷酸化到糖酵解的转换，也受到ifn的调节，是DC成熟所必需的。这些数据为伴随DC成熟的代谢重编程提供了证据，并提供了ifn调节DC成熟的新机制。

作者总结

免疫反应是由一种被称为树突状细胞(dc)的特殊细胞类型协调的。为了获得持久和强大的免疫力，树突状细胞需要经历一个复杂的分化过程，称为成熟。目前人们对这一过程知之甚少。Poly IC模仿病毒RNA，是病毒模式识别受体(PRRs)的激动剂，向免疫系统发出“危险”信号，它可以诱导dc完全成熟，已经证明这需要I型IFN信号。在这项研究中，我们开始检查直流成熟所需的直接PRR或IFN刺激所提供的特定信号。我们惊奇地发现，I型IFN可以调节DC成熟过程的几乎所有步骤，而不需要直接参与PRR。我们还发现I型IFN调节几个对保持DC完整性至关重要的代谢开关:它刺激缺氧诱导因子1α (Hif1α)的表达，该因子控制从氧化磷酸化(休眠细胞用来产生能量)到有氧糖酵解的代谢转移，这是一个效率较低但产生能量更快的过程。需要这种代谢转移来满足激活树突状细胞增加的能量需求，并防止它们过早死亡，从而维持对病毒感染的免疫反应。

引用:Pantel A, Teixeira A, Haddad E, Wood EG, Steinman RM, Longhi MP(2014)直接I型IFN而不是MDA5/TLR3激活树突状细胞是成熟和代谢转移到糖酵解的必要条件。生物工程学报12(1):e1001759。https://doi.org/10.1371/journal.pbio.1001759

学术编辑器:阿维纳什·班杜拉，美利坚合众国宾夕法尼亚大学

收到:2013年5月3日;接受:2013年11月20日;发表:2014年1月7日

版权:©2014 Pantel等人。这是一篇开放获取的文章创作共用授权协议它允许在任何媒体上无限制地使用、分发和复制，前提是注明原作者和来源。

资助:拨款支持由NIAID AI13013提供给RMS, Robert Mapplethorpe基金会和NIAID AI81677提供给MPL, HEFCE提供给EGW, NCRR UL1RR024143提供给AP。资助方对研究设计、数据收集和分析、发表决定或稿件准备没有任何作用。

利益冲突:作者宣称不存在竞争利益。

缩写:DC，树突状细胞;ECAR:细胞外酸化率;GSEA，基因集富集分析;FDR，错误发现率;干扰素干扰素;IP,腹腔内;KO,淘汰赛;MLR，混合白细胞反应;OCR，耗氧率;氧化磷酸化; PRR, pattern recognition receptor; ROS, reactive oxygen species; SD, standard deviation; WT, wild type

简介

树突状细胞(dc)是启动初级免疫反应的主要抗原呈递细胞[1]．树突状细胞在血液和组织中巡逻，以感知来自细菌、病毒或毒素的危险信号。在暴露于这样的刺激后，它们经历一个广泛的成熟过程，这导致吞噬活性的丧失，共刺激分子的表达，细胞因子的产生，并增强迁移到引流淋巴结，在那里它们向幼稚的T细胞提出抗原。这种复杂的分化过程对于诱导免疫至关重要，因为树突状细胞可以在没有"危险"信号的情况下产生耐受[２]．

促炎细胞因子在体外上调HLA和共刺激分子的发现，导致了细胞因子鸡尾酒(如TNF-α， IL-1β， IL-6, PGE)的想法2)可用于成熟dc[3]，[4]．然而，这些树突状细胞不能产生IL-12，免疫原性较弱，因此不能用于临床［5］，[6]．相反，在TLR激动剂作用下成熟的树突状细胞释放出更强的免疫反应。Reis e Sousa等。[7]，[8]证明了一个稳健的Th1反应需要直接的模式识别受体(PRR)刺激。我们之前报道过合成的dsRNA聚IC，一种TLR3和MDA5激动剂，有效地刺激树突状细胞的功能成熟，并提供免疫原性，其效果严重依赖于直接刺激I型IFN受体[9]．已知炎症细胞因子为T细胞激活提供第三个信号[10]．然而，关于它们在DC成熟过程中所提供的具体信号却知之甚少。

I型干扰素是一种有效的抗病毒细胞因子。I型IFN信号的缺失增加了对某些病毒感染的易感性，如IFNAR所示−−/在I型IFN信号通路中具有天然突变的小鼠和人类中[11]，[12]．这种增加的易感性部分是由于干扰素刺激基因(ISGs)的表达，通过多种直接抗病毒效应功能控制病毒感染[13]但I型ifn也与适应性免疫的产生有关。已知IFNs可以促进抗原特异性CD8的克隆扩展和存活+T细胞[14]，［15］并诱导树突状细胞成熟，树突状细胞是启动免疫的关键抗原呈递细胞[9]．我们和其他人已经证明了ifn促进共刺激分子的表达，增加DC的迁移，并促进CD8的交叉启动+T细胞和CD4的抗原呈递+T细胞[9]，[16]- - - - - -[19]．虽然I型ifn在DC成熟过程中发挥着重要作用已经被证实，但其中涉及的生化途径以及ifn在这一过程中的确切贡献仍然知之甚少。

在这项研究中，我们开始检查直流成熟所需的直接PRR或IFNs刺激所提供的特定信号。使用混合嵌合体模型，我们确定了仅受干扰素控制的基因和生化途径，并得出了一些有趣的发现。首先，IFNs，而不是PRR，主导了多聚IC刺激诱导的基因表达变化。其次，在正常的炎症反应和I型IFN存在的情况下，直DC成熟不需要直接的PRR刺激。第三，干扰素控制各种各样的细胞过程。除了与DC成熟相关的途径(如抗原处理)外，我们的研究还揭示了ifn在调节几种对保存细胞完整性至关重要的代谢开关方面的重要作用。我们发现，直接IFNAR刺激可诱导缺氧诱导因子1 (Hif1α)的表达，该因子负责从氧化磷酸化(OXPHOS)到糖酵解的代谢过渡，并预防dc细胞过早死亡。

结果

I型IFN主导对Poly IC的转录反应

长期以来，PRRs被认为是通过诱导DC发生一系列表型和功能变化，从而导致T细胞免疫，从而授予免疫原性。然而，正如我们之前的研究所证明的那样，阻断I型IFN会消除多聚IC刺激所赋予dc的免疫原性[9]．这表明IFNAR下游与I型IFN结合后的细胞内事件不同于PRR下游的细胞内事件，并且是启动免疫反应所必需的。为了区分IFNAR和PRR在体内dc上直接导致的事件，我们生成了混合嵌合小鼠，其中一半的骨髓来自野生型(WT) CD45.1供体，另一半来自PRR−−/或IFNAR−−/老鼠(CD45.2)。该系统使我们能够评估暴露于同一WT炎症环境下，由于各自受体缺乏而导致的树突状细胞的内在差异。小鼠腹腔内注射50µg的聚IC, 4 h后收集脾dc，根据CD45.2标记的表达进行分类，用微阵列(图1一个)．纳入两类阴性对照。首先，混合嵌合体小鼠被注射PBS以评估WT与敲除(KO) DC在稳态下的发育和成熟。第二,PRR−−/(MDA5/TLR3双KO是聚IC的受体)用聚IC刺激小鼠，以评估佐剂制剂中的杂质或其他物质是否可通过与PRR无关的通路产生刺激。在稳定状态(PBS)或多ic刺激的PRR树突状细胞中，WT和KO树突状细胞的基因表达变化均无统计学意义−−/老鼠。与单一阴性对照或联合阴性对照的多ic刺激dc相比，同样没有观察到差异(表S1而且S2)．因此，所有阴性对照被合并。聚IC处理导致WT树突状细胞中988个基因发生变化(2倍变化，错误发现率[FDR]<0.05) (图1B及1D)．早在刺激后4小时，超过700个基因上调，而只有269个基因下调。引人注目的是，这些变化大部分依赖于I型IFN，而不是PRR刺激(图1 b-1c)．PRR−−/除了26个基因的表达外，树突状细胞表现出与WT树突状细胞相似的特征，包括所有I型IFN细胞因子基因，这些基因需要直接的PRR刺激才能诱导其表达(图1 e；表S1)．相比之下，只有354个基因在IFNAR中改变了表达−−/聚IC后的dc (图1 d)．这些结果证实了IFNs在控制DC成熟过程中的重要性。

缩略图
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图1所示。dc对多聚IC的转录反应高度依赖于I型干扰素。

(A)骨髓混合嵌合体小鼠注射50µg聚IC IP。4 h后，在CD45.2表达的基础上对dc进行FACS排序，并用Illumina芯片进行基因表达分析。热图表示聚ic处理WT(绿色)、PRR的表达值(2倍变化，FDR<0.05)−−/(粉色)对比未治疗的dc(蓝色)(B)或WT, IFNAR−−/(紫色)和未处理的dc (C)。每一列代表一个单独的样本。红色和蓝色分别表示高表达和低表达。(D)类似的结果可以观察到柱状图，其中上调的基因显示为红色，下调的基因显示为绿色。(E)如(B)，但热图表示属于I型IFN细胞因子的基因的表达值。每一列代表一个单独的样本。图表示WT、IFNAR中上调或下调的基因数量−−/，及PRR−−/多IC刺激后的dc。

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.1001759.g001

I型IFN控制与DC成熟相关的通路的激活

除了众所周知的抗病毒功能外，越来越多的人认识到IFNs有助于DC的成熟。IFNAR下游转录谱的显著变化表明IFNs影响导致免疫原性的分子通路。为了识别这些通路，我们使用基因集富集分析(GSEA)对转录变化进行了通路分析(FDR<0.25)。[20]．我们的分析表明，在poly IC处理的响应，WT和IFNAR−−/DCs激活了与一般炎症相关的通路，包括NFκβ、IL6、IL-15和IL10，这表明炎症环境的刺激与IFNAR无关(图2一个；表S2)．为了证实这些发现，我们首先记录了混合嵌合体中炎症细胞因子的全身释放。聚IC注射后，混合嵌合体小鼠在注射后1小时早期产生TNF-α， 6小时后释放IL-6和IFN-α，如之前对WT小鼠所述(图2 b）[9]，表明两种树突状细胞暴露在相同的炎症环境中。为了证明细胞因子对树突状细胞的刺激，我们通过磷酸流分析评估了STAT (p-STAT)转录因子的激活。正如预期的那样，在WT和IFNAR中检测到IL-6、IL-10和IL-15通路等信号转导因子p-STAT3和p-STAT5−−/而只有WT树突状细胞显示STAT1磷酸化，这是I型IFN通路的标志性换能器(图2 c)．在WT或IFNAR中均未检测到参与IL-12通路的换能器STAT4的激活−−/如前所述，脾树突状细胞对多聚IC的反应不产生IL12p70[9]．

缩略图
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图2。IFNAR抗原提呈受损−−/DCs。

混合嵌合体小鼠骨髓注射50µg聚IC IP。4 h后，用Illumina芯片检测纯化的树突状细胞的基因表达。(A)使用GSEA进行通路分析。图中显示了多聚IC刺激(FDR<0.25)后WT dc上调的前十大通路以及IFNAR中相应的通路−−/DCs。柱状图表示每组核心富集基因的百分比(定义为富集分数之前或峰值的那些基因)。显著通路(FDR<0.25)用*表示。(B) WT / IFNAR−−/混合嵌合体小鼠用50 μ g聚IC处理，在不同时间点分析血清中IL-6、TNF-α和IFN-α。误差条表示平均值±SD (n= 4)。(C)混合嵌合体小鼠用50µg poly IC处理IP，在不同时间点，通过Phospho Flow对磷酸化活性形式进行细胞内染色，评估STATs转录因子的激活情况。直方图代表三个独立的实验。(D)热图表示属于I型IFN、细胞因子/趋化因子和抗原呈递途径的基因表达值。每一列代表一个单独的样本(6只老鼠的集合)。WT dc以绿色IFNAR表示−−/橙色，未处理的dc为蓝色。(E)聚ic处理的WT, IFNAR−−/，以及MHCII−−/dc与DEC-p24抗原在体内脉冲，过继转移至naïve小鼠。启动-刺激后用细胞内细胞因子评估抗原特异性反应。图表示CD3的百分比+CD4+T细胞产生IFN-γ。平均值±SD显示三个独立实验共9只小鼠。(F) WT / IFNAR−−/在体内用聚IC刺激混合嵌合体小鼠。4 h后，WT和IFNAR−−/树突细胞经细胞分类纯化，并在1×10上镀5圆底96孔中的细胞/孔。18 h后收集上清，用多重ELISA法检测细胞因子的产生。柱状图表示三个独立实验的平均值±SD。(G)混合嵌合体小鼠接种5µG α- 12 -p24, 50µG聚IC, 25µG αCD40单抗IP+CD4+来自脾脏的T细胞，检测gag p24肽混合物或对照gag p17肽混合物的应答。柱状图代表两个实验的平均值±SD，共6只小鼠。

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.1001759.g002

与此形成鲜明对比的是IFNAR−−/dc未能增加RIG-like helicase以及I型IFN通路中其他基因的表达，包括编码PKR和IFIT蛋白、2-5A合成酶系统(OAS2/3)和Mx通路(MX1/2)等主要抗病毒通路相关蛋白的基因(表S2）[13]．有趣的是，与WT相比，INFAR−−/DC未能激活许多与DC免疫原性直接相关的基因。这些包括参与抗原处理和呈递途径的基因，如MHCII，利用，lamp2，以及dc -自然杀手(NK)的相声，以及IL15的产生等Il18而且Il15（图2A及2D；而且表S2)．为了证实这一结果，我们在体内研究了HIV gag特异性免疫启动。混合嵌合体小鼠分别用抗dec - hiv gag和poly IC或PBS免疫。4小时后，收集脾脏dc，经细胞分选纯化，用于naïve小鼠接种(静脉注射[IV])。MHCII−−/dc作为阴性对照。正如预期的那样，只有聚ic处理的WT，而没有IFNAR−−/或MHCII−−/树突状细胞诱导抗原特异性T细胞反应(图2 e)．此外，IFNAR−−/树突状细胞，尽管在体内受到炎症反应的刺激，却无法产生在T细胞启动和记忆命运中起重要作用的细胞因子(图2 f)．综上所述，我们的数据表明IFNAR信号通路在诱导聚IC治疗后DC的免疫原性中起着不可或缺的作用，并提出了一个重要的问题。DC免疫原性是否需要直接的PRR刺激?为了回答这个问题，我们制造了混合嵌合小鼠，其中一半的骨髓来自MHCII−−/捐赠者和另一半来自WT, PRR−−/，或IFNAR−−/并分析了接种后口腔特异性T细胞的反应。尽管I型ifn的产生需要PRR信号(图1 e)，在完全诱导的炎症反应下，直接的PRR刺激并不像之前认为的那样需要DC成熟(图2 g）[7]．此外，没有观察到T细胞增殖和分化的差异(未发表的数据)。IFN α A/D(通用型I型IFN)作为单独的佐剂无法启动T细胞(未发表的数据)，表明I型IFN是必要的，但不是成熟dc的充分条件，其他因素是需要的。

DC代谢重编程需要ifn

我们的数据显示，早在4小时内，超过900个基因就以I型ifn依赖的方式改变了它们对聚IC的表达。在刺激14小时后，当大多数基因表达变化由ifn调节时(2倍变化，FDR<0.05)，也观察到类似的结果(图3一)．令人惊讶的是，一组在WT dc中缺失的基因在IFNAR中被发现上调−−/14 h后树突细胞对炎症的反应(图3一箭头)。为了了解这组似乎被IFNAR信号抑制的基因，我们使用GSEA对这些基因和生化通路进行了分类。我们的分析显示，IFNAR中的顶部通路不受调控−−/与细胞代谢有关，例如OXPHOS (图3 b；表S3)，在4 h后也很明显。与OXPHOS和线粒体呼吸增强一致，IFNAR中的线粒体膜电位(电子传递链使用的指标)显著增加−−/与多聚IC刺激后的WT dc相比(图4一)而线粒体质量则没有变化(图4 b)．为了证实线粒体活性的下降，我们使用代谢通量分析(Seahorse XF分析仪)通过测量在基础条件下和药物诱导线粒体应激后的耗氧率(OCR)来评估线粒体呼吸[21]．与未处理的dc相比，多聚IC刺激后WT dc的基础OCR显著降低。相比之下，PBS和聚ic处理的IFNAR之间没有显著差异−−/DCs (图4 c)．连续添加线粒体atp合酶抑制剂(寡霉素)，线粒体解耦子FCCP，以及线粒体复合物抑制剂抗霉素- a和鱼藤酮鱼藤酮，在WT和IFNAR的稳态下，随着时间的推移，诱导了OCR的特征“漂移”−−/而在聚ic活化的WT dc中，OCR值没有变化(图4 c)．对比鲜明的是PBS和聚ic处理的IFNAR−−/树突状细胞在线粒体功能受到药物干扰时，OCR值也发生了类似的变化(图4 c)．为了确定聚ic刺激树突状细胞线粒体呼吸减少是否是代谢向糖酵解转移的结果，我们分析了细胞外酸化率(ECAR)作为乳酸生产和糖酵解的指标。多聚IC刺激WT树突状细胞导致糖酵解率增加。然而，与OCR一致，治疗和未治疗IFNAR之间的ECAR值相似−−/DCs (图4 d)．

缩略图
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图3。IFNAR的代谢反应改变−−/DCs。

(A)骨髓混合嵌合体小鼠注射50µg聚IC IP。14 h后，根据CD45.2表达情况对dc进行FACS排序，并用Illumina芯片进行基因表达分析。热图表示聚ic处理WT(绿色)、IFNAR的表达值(2倍变化，FDR<0.05)−−/(橙色)对比未治疗的dc(蓝色)。每一列代表一个单独的样本。(B)通路分析采用GSEA (FDR<0.25)。表中列出了IFNAR中上调的前十大通路−−/与WT dc相比。

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.1001759.g003

缩略图
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图4。多IC刺激后线粒体功能的变化。

WT/IFNAR混合嵌合体小鼠骨髓注射50µg聚IC IP。14 h后，取脾脏，用膜电位依赖性染色剂MitoTracker Red CMXRos (A)或MitoTracker Green FM (B)在37°C孵育20分钟。细胞染色评价CD11c+MHCII+B220−DX5−流式细胞术检测树突状细胞。直方图代表三个独立的实验。(C) As (A)和(B)，但14 h后，CD11c+MHCII+B220−DX5−dc在Seahorse XF-24分析仪中进行分类和播种。在加入寡霉素、FCCP和抗霉素- a /鱼藤酮后实时测定OCR。(D) ECAR值。数据为四次重复的均值±SD。数据代表了三个实验。(E) WT小鼠注射50 μ g聚IC IP 18 h后，用FACS检测细胞内iNOS的表达。作为阳性对照，单核细胞来源的树突状细胞被LPS刺激。直方图代表三个独立的实验。(F)与(A)相同，但WT注射50µg聚IC IP, 4 h后取脾，在SEITU ON存在下进一步培养。直方图代表三个独立的实验。 (G) Chimera mice were stimulated with poly IC 4 h in vivo. Total RNA was isolated from sort-purified CD11c+MHCII+DCs。用RT -PCR或细胞内染色法分析HIF1α的相对表达。静息dc中mRNA水平设为1。

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.1001759.g004

这一发现表明，聚IC的DC激活诱导了几种代谢变化，最可能的是在支持迁移、细胞因子分泌和其他效应功能等生物能量需求过程的同时，保持细胞完整性，而该过程由I型ifn调节。最近，Pearce和他的同事发现，树突状细胞的糖酵解过程是由OXPHOS的NO抑制所介导的[22]．然而，这一机制仅限于炎性单核细胞衍生的dc，与他们的数据一致，我们无法检测到聚IC刺激后iNOS的产生或NOS抑制剂s -乙基异硫脲(SEITU)存在时线粒体膜电位的降低(图4E和4F)．然而，我们可以检测到IFNAR中Hif1的表达减少−−/与WT DCs (图4 g)，它被证明可以调节其他系统的糖酵解过程[23]，[24]．这些结果表明干扰素与树突状细胞代谢途径的控制之间存在关联，并提示这一过程可能受到Hif1α的调控。

代谢转向糖酵解受Hif1α调控，是DC免疫原性所必需的

Hif1作为氧稳态的主调节因子，通过将葡萄糖代谢从OXPHOS转换到糖酵解，减少氧消耗，并抑制线粒体活性氧(ROS)的产生。Hif1α通常在缺氧时被激活，但TLR刺激可诱导其表达，但机制和后果尚不清楚[25]．为了研究IFNAR信号在TLR刺激、Hif1α上调和代谢重编程之间的链接作用，我们通过交叉Hif1α在树突状细胞中产生条件缺失Hif1α的小鼠液氧/−CD11c-Cre小鼠。小鼠是健康的，与对照组相比，稳定状态下的DC数量和激活标记没有差异(未发表数据)。我们没有检测到Hif1α之间有任何差异液氧/液氧和Hif-1α+ /−因此是Hif-1α+ /−小鼠作为对照组。与IFNAR一致−−/实时OCR分析显示，在Hif1α中，DCs和支持其控制糖酵解开关的作用，线粒体呼吸得以恢复−−/DCs (图5一个)．此外，聚ic刺激Hif1α−−/dc显示的ECAR水平与静息dc相当(图5 b)．同样，线粒体膜电位，以及Hif1α的线粒体总质量−−/dc在多聚IC刺激后不变(图5 c)．活性氧是线粒体呼吸的自然副产物[26]；因此，糖酵解开关可以保护细胞免受氧化应激，显著延长细胞寿命。为了测试抑制Hif1α是否会导致高水平的ROS，我们用CellROX Deep Red染色细胞，CellROX Deep Red是一种非荧光试剂，在活性氧氧化时变成荧光。相对于对照dc, Hif1α−−/TLR刺激后树突状细胞荧光染色增加(图5 d)．为了确定Hif1α敲除对细胞能量平衡的影响，在体内测量聚IC刺激后ATP水平(图5 e)．多聚IC刺激后，WT树突状细胞中ATP水平适度升高，表明增加的糖酵解速率足以维持ATP池。相比之下，Hif1α的ATP水平明显较低−−/DCs。ATP是维持细胞内稳态和促进细胞生存所必需的，因为细胞内ATP的丢失会导致细胞坏死或凋亡[27]．事实上，我们可以检测到Hif1α中细胞死亡的增加−−/，与多聚IC刺激后的WT dc相比(图5 f)．罗布辛对NADPH氧化酶的抑制作用仅部分降低了Hif1α−−/在较小程度上，WT dc凋亡(未发表的数据)表明ROS水平不是这种影响的唯一原因。总之，这表明IFNAR信号通路导致Hif1α的上调，而Hif1α可能通过抑制活性氧的产生和维持细胞内ATP水平来促进DC存活。

缩略图
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图5。Hif1α是DC免疫原性所必需的。

条件Hif-1α液氧/−．CD11c-Cre+(HIF1α−−/)或HIF1α+ /−对照组小鼠注射50 μ g聚IC IP。14 h后取脾，CD11c+MHCII+B220−DX5−在Seahorse XF-24分析仪中对DCs细胞进行分类和播种。(A)连续添加寡霉素、FCCP和抗霉素-A/鱼藤酮后的实时OCR。(B) ECAR值。数据表示重复数的均值±SD。数据代表了三个实验。(C)如(A)所示，但细胞与MitoTracker Red CMXRos或MitoTracker Green FM一起孵育，并用流式细胞术分析。直方图代表三个独立的实验。(D) Hif1α−−/对照组小鼠注射poly IC 50µg, 14 h后用CellRox Deep Red试剂在37°C或(E)活纯化CD11c孵育30 min+MHCII+酶联免疫吸附法测定树突状细胞的ATP水平(n= 3)。(F)在体内用聚IC刺激14 h后，脾脏dc被7-AAD染色。直方图代表三个独立的实验。(G) HIF1α−−/或HIF1α+ /−对照组小鼠用50µg的聚IC刺激18 h后，CD11c+MHCII+树突细胞通过细胞排序、固定和分级编号添加到2×10进行纯化5异基因Balb/C T细胞。用CFSE稀释CD3检测T细胞增殖+细胞。数据代表了三个实验。(H)小鼠分别在4周后用5 μ g α- 12 -p24和50 μ g聚IC引物，1周后，门控CD3分泌IFN-γ+CD4+来自脾脏的T细胞，检测gag p24肽混合物或对照gag p17肽混合物的应答。柱状图代表两个实验的平均值±SD，共6只小鼠。

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.1001759.g005

为了探索ifn、Hif1、DC存活和免疫原性之间的因果关系，我们评估了Hif1α的能力−−/DCs诱导T细胞反应。为了首先测试dc的功能，我们对CD11c进行了排序+MHCII+聚IC注射18 h后从脾脏中分离出树突状细胞，并进行混合白细胞反应(MLR)。来自Hif1α的dc+ /−但没有Hif1α液氧/−CD11c-Cre+小鼠成为异基因MLR的活跃刺激物，诱导两种CD4细胞的健壮增殖+和CD8+T细胞(图5克)．然后，我们用poly IC和12 - hivp24靶向疫苗免疫小鼠，并分析了启动/增强后的免疫T细胞反应，以评估dc在体内抗原捕获后的免疫原性能力。与MLR一致，Hif1α降低了T细胞的反应液氧/−CD11c-Cre+与WT小鼠相比(图5 h)，表明细胞死亡增加导致T细胞刺激减少。

讨论

DC成熟是一个高度复杂的分化过程，其特征包括但不限于共刺激分子的上调、炎症细胞因子的产生、内吞/吞噬活性的下调、细胞形态和迁移的改变以及抗原加工机制的上调。激活反式已被证明可以诱导表型成熟的dc。然而，这些树突状细胞不能诱导适应性免疫。越来越多的证据表明，通过PRR直接刺激病原体是诱导完全成熟的dc和提供“信号3”，如T细胞启动的细胞因子[8]，[28]．在我们之前的工作中，使用聚IC作为成熟刺激，我们发现直接的PRR刺激不足以诱导DC成熟，免疫原性需要通过I型IFN受体直接信号[9]．在这项工作中，我们旨在识别直接PRR或IFNAR刺激调节的DC成熟的关键生化途径。为此，我们对混合嵌合体小鼠进行了基因阵列分析。在该模型中，来自WT骨髓的dc可以直接对多聚IC和I型IFNs产生反应，并产生正常的炎症反应，而来自KO骨髓的dc只对一种受体(PRR或IFNAR)产生反应。然而，这两种树突状细胞从炎症环境中接收到相同的次级信号(激活在反式由于WT抗辐射和辐射敏感细胞的多IC响应)。此外，微阵列分析此前已用于研究PRR和干扰素刺激在体外分离细胞中的整体效应[29]- - - - - -[31]在体内，炎症是几个细胞群对各种刺激的复杂反应的结果，目前还没有关于PRR和I型干扰素直接调节的基因的信息。

本文给出的数据表明，旁观者激活PRR−−/dc诱导的基因表达谱与WT dc相似，但I型IFN基因需要直接的PRR参与。然而，这与Sporri及其同事此前发表的论文形成鲜明对比[28]与微阵列数据一致的是，只要炎症环境中存在I型ifn，直接的PRR刺激并不需要DC免疫原性。这种差异可能是由于研究的是多克隆T细胞反应而不是tcr转基因模型。这一发现对蛋白质疫苗的设计具有重要意义。目前的范式是佐剂应该被设计成激活特定的PRR受体选择性地表达在不同的DC亚群上。DC子集表达不同的PRR数组，这需要佐剂和抗原提呈细胞的完美匹配。我们的数据反驳了这个模型，并表明dc可以被激活在反式不同的PRR激动剂。

虽然直接PRR刺激对聚ic刺激的dc的基因表达谱几乎没有影响，但IFNAR的整体反应显著降低−−/DCs。这尤其令人惊讶，因为聚IC诱导了高水平的促炎细胞因子，特别是TNF-α，它被描述为激活dc[32]，[33]；然而我们发现，在缺乏IFNAR信号的情况下，促炎细胞因子或直接PRR参与无法上调与DC成熟相关的通路，包括共刺激分子的上调，并且对DC免疫原性是不可或缺的。更引人注目的是，这里提出的数据表明I型ifn也可以调节代谢途径。线粒体活性短暂增加后，激活的dc从线粒体OXPHOS转变为好氧糖酵解作为ATP的主要来源[22]，[34]．糖酵解产生ATP的效率较低，但速率比OXPHOS快[35]．我们证实了在体内树突状细胞中类似的代谢变化。WT树突状细胞中Hif1α转录上调，线粒体呼吸降低，糖酵解速率增加。令我们惊讶的是，IFNAR中的代谢重编程受到了损害−−/DCs。IFNAR−−/树突状细胞利用OXPHOS作为ATP的主要来源，试图通过增加呼吸来平衡它们的能量供应，这可以通过OXPHOS、柠檬酸循环和丙酮酸途径的上调来证明。有人可能会说，转向糖酵解的失败与其说是DC失活的原因，不如说是结果。我们的实验方法依赖于混合嵌合小鼠，使两种树突状细胞暴露在相同的炎症环境中。我们可以检测到共刺激分子以及STAT3和STAT5磷酸化的部分上调，表明IFNAR−−/dc受其他细胞因子和炎症介质刺激。此外，与稳态ifnar相比，聚ic刺激下的膜电位增加−−/显示这些树突状细胞对炎症有改变的代谢反应。

代谢重编程似乎可以防止生物能量崩溃，以应对与信号转导和转录相关的能量消耗的初始增加。近年来，人们认识到T细胞的代谢调节支持细胞增殖和控制细胞运输[36]但它如何影响DC成熟尚不清楚。转录因子Hif1可以被低氧张力或TLR刺激激活，促进氧化代谢向糖酵解代谢的转变[37]．低氧下lps刺激的小鼠dc增加了共刺激分子、促炎细胞因子的表达和MLR的诱导。siRNA抑制Hif1α表达，显著降低葡萄糖使用量，抑制DC成熟和MLR刺激[38]．然而，在暴露于低氧张力和Hif1激活后，其他细胞显示迁移能力降低和DC成熟受损[39]- - - - - -[42]．实验是在体外人工培养条件下进行的，而不是在体内用遗传方法，这可能可以解释这些矛盾的结果。利用条件KO小鼠，我们发现Hif1α的上调是代谢转换到糖酵解以及DC存活和体内免疫原性所必需的。在本文的修改过程中，发表了两篇关于Hif1α在DC功能中重要作用的报道[43]，[44]．作者使用类似的基因靶向方法删除Hif1α的表达，并显示了骨髓来源DC的细胞因子表达和抗原呈递能力的调节。然而，确切的机制和与细胞代谢的关系尚未被研究。

虽然这项研究的重点是确定PRR和ifn在树突状细胞激活中的作用，但这些数据也有助于阐明干扰素在细胞代谢中的其他作用。对辅助聚IC启动并由ifn直接控制的转录程序的探索，扩展了我们对这些细胞因子的整体作用的理解，并提高了我们对DC成熟所需的许多步骤的理解。

材料与方法

老鼠

Hif1 C57BL / 6,α液氧/液氧和CD11c-Cre+小鼠购自杰克逊实验室;IFNAR−−/, MDA5−−/， MDA5xTLR3−−/小鼠由K. Murali-Krishna(华盛顿大学，西雅图)和M. Colonna(华盛顿大学，圣路易斯，密苏里州)提供。为了提高CRE重组效率，Hif1α液氧/液氧小鼠首先与EIIA-CRE杂交获得Hif1α液氧/−．然后将小鼠与CD11c-Cre杂交。用引物检测Hif1α缺失TTGGGGATGAAAACATCTGC而且GCAGTTAAGAGCACTAGTTG．根据机构动物护理和使用指南，小鼠在特定的无病原体条件下维持，并在7-8周龄时使用。

DC先天反应

小鼠注射含50µg聚IC的IP，在体内刺激4 h后取取脾脏进行细胞因子生产。CD11c+MHCII+树突状细胞经细胞分选纯化(FACSAria;BD Biosciences)，并在5×10上发布4细胞/孔在96孔板中放置18小时，然后用多重ELISA法测定上清液中的细胞因子(研发系统;eBioscience)。另外，在聚IC注射后1和6小时收集血清样本。用于磷酸化STAT的细胞内检测，纯化CD11c+MHCII+混合嵌合体小鼠的dc，用25µg/ml的聚IC体外培养，在不同时间点采集。混合嵌合小鼠注射50µg的聚IC 4 h，细胞用2%多聚甲醛固定，80%冷甲醇通透，用PE-抗磷Stat抗体(BD Bioscience)或纯化抗Hif1α抗体(Novus biicals)染色，然后用Alexa Fluor 555山羊抗兔二抗(Invitrogen)染色。WT和IFNAR阳性百分比−−/流式细胞术分析树突状细胞。

代谢分析

线粒体质量和电位分别用MitoTracker Green FM和MitoTracker Red CMXRos (Invitrogen)测量，按照制造商说明采用流式细胞术。根据制造商说明，用CellRox Deep Red (Invitrogen)和流式细胞术评估氧化应激。用于ATP分析，小鼠注射50µg的聚IC, 14 h后，CD11c活嗨CD3−DX5−B220−树突细胞按100 μ l/10进行细胞分选、洗涤和重悬6PBS细胞。煮沸5 min，用ATP测定试剂盒(Invitrogen)测定ATP浓度。为了实时分析ECAR和OCR，使用了Seahorse XF-24代谢细胞外通量分析仪(Seahorse Bioscience)。简单地说，小鼠注射PBS或50µg的聚IC, 14 h后，CD11c活嗨CD3−DX5−B220−细胞分选，洗涤，并在XF测定培养基中重悬(未缓冲的DMEM添加10 mM葡萄糖，2% FCS, 100 U/ml青霉素/链霉素，2 mM l-谷氨酰胺和丙酮酸)，并在4×10上镀到海马X24细胞板上5/好。添加1µM寡霉素，1.5µM氟羰基氰基苯腙(FCCP)， 100 nM鱼藤酮+ 1µM抗霉素A (Sigma-Aldrich)，可实现线粒体功能的扰动。寡霉素是一种ATP合酶抑制剂，FCCP是一种原胞子，将ATP合成从电子传递链上解耦，鱼藤酮和抗霉素a分别是复合物I和III抑制剂。根据制造商的说明(海马生物科学)，在添加指定药物之前和之后测量OCR。

DC抗原呈递

目的:检测脾和淋巴结CD11c异体刺激能力+MHCII+聚IC注射18 h后，细胞分选分离出树突状细胞。dc与1%多聚甲醛在冰上固定10分钟，并将分级编号添加到2×105cfse标记的(分子探针)Balb/C T细胞。培养5 d后，用活/死固定紫活性染料(Invitrogen)、alexafluor700 -抗cd3、percp - cy5.5 -抗cd4、apc - efluor780 -抗cd8染色，在BD LSR II流式细胞仪上采集。DC抗原在体内呈递，嵌合体小鼠和MHCII−−/小鼠作为阴性对照，分别注射gag-p24 5µg和poly IC 50µg。4 h后，脾WT或IFNAR−−/CD11c+MHCII+以CD45.2的表达为基础进行细胞分选纯化后，转染naïve小鼠(IV)。另一种方法是，小鼠每隔4周接种2次IP, 5µg HIV gag-p24 + 50µg poly IC, 1周后，用p24或p17阴性对照肽混合物重新刺激脾细胞(如上所述)[9]．启动-增强后用细胞内IFN-γ评价抗原特异性反应。

微阵列分析

混合嵌合小鼠骨髓注射50 μ g聚IC ip4和14 h后，WT和KO CD11c嗨CD3−DX5−B220−dc，根据CD45.2表达进行FACS排序。使用Trizol (Invitrogen)和RNeasy minelute cleanup试剂盒(Qiagen)分离总RNA。RNA采用Nanodrop 1000D分光光度计定量(ThermoScientific)，质量检测采用Agilent 2100生物分析仪(Agilent Technologies)。根据制造商的说明，将cRNA标记并杂交到mouseRef-8 Expression BeadChips v2.0 (Illumina)上，并使用BeadStudio软件(Illumina)提取数据。至少3个重复样本进行分析，具有统计学意义。使用genspring 10.0软件对Illumina单色芯片的原始数据进行分析。将背景强度以下的强度替换为背景强度。对数据进行对数变换，采用分位数归一化算法。对数据进行过滤，以消除低表达强度的探针。基线转换为所有样本的中位数。 Multiple t-tests were used to find differentially expressed genes (p-值用Benjamini-Hochberg法调整，FDR为0.05)。差异表达定义为多聚IC刺激WT、IFNAR增加或减少2倍−−/，或称PRR−−/而非受刺激dc。GSEA (FDR为0.25)识别出显著差异的调控途径。微阵列数据可通过国家生物技术信息基因表达综合中心(GEO)获得，注册号为GSE46478。

实时聚合酶链反应

总RNA的分离如前所述。高容量RNA-to-cDNA Kit (Applied Biosystems)用于cDNA反应，并保存在−80°C。HIF1α和GAPDH引物从Applied Biosystems Gene Expression Assay Selection购买。GAPDH基因作为管家基因归一化结果。定量实时PCR在7900HT实时PCR仪(Applied Biosystems)中使用TaqMan Universal PCR Master Mix进行。

统计分析

图中报告的数据代表了至少三个独立实验的平均值。采用双尾Student t检验确定差异有统计学意义p-小于等于0.05的值。误差条表示平均值±标准差(SD)。使用Prism 5 (GraphPad Software)分析数据并生成图表。

支持信息

表S1。

PRR中差异表达基因列表−−/多IC刺激后对WT dc的影响(4小时)。折叠变化用FC表示，用Benjamini-Hochberg法调整的p值为adj . Pval。

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.1001759.s001

(XLSX)

表S2。

所有通路的核心富集基因(GSEA)列表图2．表显示了与聚ic处理的WT dc相比，在阴性对照(池)中核心富集的每个通路的基因列表。折叠变化表示为FC和p-用Benjamini-Hochberg方法调整的值为adj Pval。此外，与稳定状态、单一、阴性对照相比，也显示了基因的FC和Pval。

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.1001759.s002

(XLSX)

表S3。

所有通路的核心富集基因(GSEA)图3．表显示了GSEA分析后各通路核心富集的基因列表及其折叠变化(FC)和p价值。

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.1001759.s003

(XLSX)

致谢

我们感谢M. Nulty、A. Gallimore、A. Godkin和K. Liu对手稿的帮助。我们感谢洛克菲勒大学临床和转化科学中心(UL1 TR000043 NCATS, NIH)的技术支持。

作者的贡献

作者(s)对他们的贡献作出了以下声明:构想和设计实验:MPL RMS。进行了AP AT EGW实验。分析数据:AP AT。贡献试剂/材料/分析工具:EH。撰写论文:AP MPL。

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