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基因组分析识别GATA6作为一个候选癌基因放大Pancreatobiliary癌症

  • 凯文·a·Kwei,

    贡献同样处理:凯文·a·Kwei Murali Bashyam

    联系病理学系,斯坦福大学,斯坦福大学,加州,美国

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  • Murali d Bashyam,

    贡献同样处理:凯文·a·Kwei Murali Bashyam

    这些作者是联合的高级作者这项工作。

    从属关系病理学系,斯坦福大学,斯坦福大学,加州,美国,实验室分子肿瘤学、DNA指纹分析和诊断中心Nacharam,海得拉巴,印度国家基因组和转录组设施,DNA指纹分析和诊断中心Nacharam、海得拉巴,印度

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  • 杰西卡·花王

    联系病理学系,斯坦福大学,斯坦福大学,加州,美国

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  • 拉曼Ratheesh,

    联系实验室的分子肿瘤学、DNA指纹分析和诊断中心Nacharam、海得拉巴,印度

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  • Edumakanti c . Reddy

    联系国家基因组和转录组设施,DNA指纹分析和诊断中心Nacharam、海得拉巴,印度

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  • 年轻的h·金,

    联系病理学系,斯坦福大学,斯坦福大学,加州,美国

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  • 凯利蒙哥马利市

    联系病理学系,斯坦福大学,斯坦福大学,加州,美国

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  • 克雷格·Giacomini

    联系病理学系,斯坦福大学,斯坦福大学,加州,美国

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  • Yoon-La崔

    从属关系病理学系,斯坦福大学,斯坦福大学,加州,美国,病理学系三星医疗中心,韩国成均馆大学医学院的首尔,韩国

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  • Sreejata Chatterjee,

    联系实验室的分子肿瘤学、DNA指纹分析和诊断中心Nacharam、海得拉巴,印度

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  • 柯林斯a . Karikari

    联系约翰霍普金斯大学病理学系,巴尔的摩,马里兰州,美利坚合众国

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  • 柯桥柯岩力,

    从属关系病理学系,斯坦福大学,斯坦福大学,加州,美国,遗传学,斯坦福大学,斯坦福大学,加州,美国

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  • 裴王

    联系公共卫生科学分工,弗雷德哈钦森癌症研究中心,西雅图,华盛顿,美国

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  • 蒂娜Hernandez-Boussard,

    联系遗传学、斯坦福大学,斯坦福大学,加州,美国

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  • Gowrishankar Swarnalata,

    联系病理学系阿波罗医院,海得拉巴,印度

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  • Matt van de Rijn

    联系病理学系,斯坦福大学,斯坦福大学,加州,美国

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  • Anirban Maitra,

    联系约翰霍普金斯大学病理学系,巴尔的摩,马里兰州,美利坚合众国

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  • […),
  • 乔纳森·r·波拉克

    pollack1@stanford.edu

    这些作者是联合的高级作者这项工作。

    联系病理学系,斯坦福大学,斯坦福大学,加州,美国

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文摘

Pancreatobiliary癌症中死亡率最高的癌症类型。发现分子基因改变可能会建议的全光谱治疗的新途径。目录基因改变,我们进行了基于数组的基因组分析31外分泌胰腺癌症和6远端胆管癌,扩展为肿瘤细胞异种移植丰富分数。我们确定了无数焦DNA扩增、缺失,包括获得18 q11.2 cytoband pancreatobiliary病例的19%,一个轨迹非同寻常的放大在其他肿瘤类型。最小的共享放大18岁q11.2包括在内GATA6,一个转录监管机构此前与胰腺的正常发展。当放大,GATA6在mRNA和蛋白过表达水平,和强大的免疫染色观察的25 54(46%)主要胰腺癌相比0 33正常胰腺标本调查。GATA6表达在异种移植与特定的微阵列基因表达模式,丰富但GATA结合位点和线粒体氧化磷酸化的活动。siRNA介导击倒的GATA6与放大导致降低胰腺癌细胞株细胞增殖、细胞周期进展,和集落形成。我们的发现表明GATA6放大和过度导致胰腺癌细胞的致癌表型,并确定GATA6在pancreatobiliary癌症候选人lineage-specific致癌基因,对新的治疗策略的影响。

作者总结

胰腺癌是一种破坏性疾病,任何癌症的存活率最低之一。更好的理解的分子基础原理治疗胰腺癌可能导致改善。我们报告的发现放大(即额外的副本)GATA6在许多人类胰腺癌基因。GATA6是基因表达的调节和功能在正常胰腺的发展。我们的发现表明其放大和异常的超表达有助于胰腺癌的发展。GATA6加入越来越多的癌症基因在正常人类发展但致病性与关键角色的角色在癌症时异常表达。我们发现GATA6放大提供了一个新的立足点理解胰腺癌的潜在致病机制,并建议通过针对GATA6或基因治疗新策略调节。

引用:Kwei KA, Bashyam MD,花王J, Ratheesh R, Reddy EC,金正日YH, et al。(2008)基因组分析识别GATA6作为一个候选癌基因放大Pancreatobiliary癌症。公共科学图书馆麝猫4 (5):e1000081。https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1000081

编辑器:韦恩·n·弗兰克尔杰克逊实验室,美利坚合众国

收到:2007年8月30日;接受:2008年4月25日;发表:2008年5月23日

版权:©2008 Kwei et al。这是一个开放的文章下分布式知识共享归属许可条款,允许无限制的使用、分配、和繁殖在任何媒介,被认为提供了原作者和来源。

资助:这项工作是由美国国立卫生研究院拨款支持,CA112016 (JRP) CA09151(谷湖)GM07365 (KS),胃肠道癌症孢子CA62924 (AM),从lustgarte基金会(JRP),并由一个核心格兰特中心DNA指纹分析和诊断的生物技术,印度政府(MDB)。我们还要感谢家人的玛格丽特·李和索尔高盛胰腺癌研究中心支持异种移植努力约翰霍普金斯。MDB支持生物技术的部分海外为准会员的生物技术,科学技术部,印度政府。RR和SC支持高级研究奖学金和初级研究奖学金分别从科学与工业研究理事会,印度政府。发起人或出资人都没有任何角色的设计和开展研究,在收集、分析、和解释的数据,或准备,审查或批准的手稿。

利益冲突:作者宣称没有利益冲突存在。

介绍

胰腺癌死亡率最高的癌症之一,指着一个关键需要更有效的治疗方法。虽然已经取得了很大进展了解胰腺癌发病机制,更全面的表征分子基因改变的需要定义新的分子靶点和治疗机会[1]。

基因组DNA拷贝数的改变(CNAs)在胰腺癌频繁,在那里他们改变剂量和癌基因的表达。放大致癌基因包括喀斯特(也通常由点突变激活),AKT2和MYB。同样,肿瘤抑制基因(次数)包括删除CDKN2A,TP53和SMAD4(灭活突变和启动子甲基化)[2]。映射CNAs已成为一个重要的起点为发现新的癌症基因,实际上导致了最初的识别CDKN2A和SMAD4随着次数[3],[4]。

在开发期间,腹侧部分胰腺起源于原始的胆管[5]。虽然少即是已知的肝外胆管癌,他们似乎与胰腺癌分享许多功能,包括频繁的分子变化喀斯特,CDKN2A,TP53和SMAD4等位基因的丧失,以及全球模式[6],[7]。由于其解剖接近和相似的组织学,胰腺癌和远端胆管癌有时很难区分,几乎和从临床和研究的角度往往结合的伞下pancreatobiliary癌症。

最近,基于阵列比较基因组杂交(全息阵列)提供了一个强大的目录必须在癌症基因组的方法[8],[9]。剖析pancreatobiliary癌症,然而,呈现独特的技术挑战由于强烈的间质反应,肿瘤细胞通常占了不到20%的细胞标本。不足为奇的是,迄今为止的基因组分析胰腺癌的研究一直局限于派生的细胞系[10]- - - - - -[13]。策略来丰富肿瘤细胞从原发肿瘤包括物理显微解剖,这是在技术上要求,低收益率的基因组DNA,偏见在后续目标放大。另外一个策略是扩大肿瘤裸鼠异种移植,这有效地丰富了肿瘤细胞比例> 95%,(剩下的基质细胞的小鼠来源),同时保留亲代肿瘤的基因改变[14]。这里,我们基因组分析应用到一组胰腺和远端胆管癌生长在裸鼠异种移植,其中改变我们识别和描述GATA6作为一个小说在pancreatobiliary癌症候选人lineage-specific致癌基因放大。

结果

综合目录CNAs pancreatobiliary癌症,我们进行数组CGH-based 37癌症基因组分析一组(31外分泌胰腺癌症和6远端胆管癌)扩大作为肿瘤细胞异种移植丰富,用代表∼22000个基因的互补脱氧核糖核酸微阵列平均interprobe间距∼15 Kb。我们确定了无数CNAs,其中17焦高层DNA扩增(即荧光比率≥3,对应至少5倍放大[8])和7的纯合子缺失(如荧光率≤0.25)特别信息在确定已知或小说候选癌基因(表1)。通过并行分析基因表达,我们也定义的子集放大基因表现出升高表达式(表1),一个致癌基因的特征。假定的纯合缺失的一个子集,我们验证纯合子的损失由使用人类gene-specific引物聚合酶链反应(PCR) (表1和图S1)。

缩略图
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表1。高级放大和纯合子缺失。

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1000081.t001

焦点放大中,我们发现19%的18岁获得q11.2 pancreatobiliary癌症(5 31胰腺癌,2 6胆管)。值得注意的是,我们发现收益生成18 q11.2在其它不太常见的肿瘤类型我们有异形在同一阵列平台,包括乳癌(3 89年涨幅(3%)肿瘤,1在49(2%)细胞株)、前列腺(0 64年(0%)肿瘤)、肺(4 76年肿瘤(5%),在52个(8%)细胞株)和结肠29(3%)细胞株(1)[15]- - - - - -[17](和未发表的数据),在这些其他类型的肿瘤增长目前没有焦点时,表明假定的司机致癌基因在这个轨迹可能是特定于pancreatobiliary癌症。引人注目的是,最小的共享区域放大在异种移植中标本横跨两个注释的基因,GATA6(叫结合蛋白6)CTAGE1(皮肤t细胞淋巴瘤(CTCL)相关抗原1)(图1一个)。GATA6[18]属于GATA转录监管机构、家庭因素的成员表达在不同的发育和修复基因的表达模式和规范cell-restricted项目[19]。因为GATA6被调节正常胰腺发展[20],[21],我们试图探索可能的功能连接GATA6基因扩增和pancreatobiliary癌症。

缩略图
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图1所示。 GATA6在pancreatobiliary癌症局部放大。

(A) CGH在互补脱氧核糖核酸微阵列基因谱的胰腺(P)和胆管(B)癌症在cytoband 18 q11.2异种移植。基因是由基因组的位置。红色代表阳性肿瘤/正常aCGH比率(如图所示)规模,和样品获得18岁q11.2显著低于由封闭的圆(收益以黄色突出显示)。基因和est序列克隆ID(图片所示)内的微阵列驻留扩增子核心表示。CTAGE1(星号)不存在数组但驻留的地方。(B)基因资料的B291 CGH在安捷伦超高清定制芯片花砖18 q11.2,映射到UCSC基因组浏览器(http://genome.ucsc.edu)[55]。两个基因的扩增子的高峰期间,GATA6和CTAGE1。(C) Q-PCR验证的GATA6在B291放大。注意,杂交测量全息往往会低估真实CNA比率[8]。(D)鱼的验证GATA6放大在父的肿瘤(石蜡切片)异种移植B291派生(左),GATA6在胰腺癌细胞系AsPC1 (中心)和Panc3.27 (正确的)。获得明显的增加的比例GATA6(红色)/ centromere-18(绿色)信号。DAPI(核)对比染色灰度图所示。

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1000081.g001

单个胆管癌异种移植标本(B291)焦高层DNA扩增尤其定义扩增子边界信息。使用自定义安捷伦超高定义全息阵列探测器花砖18 q11.2平均343元间距,我们第一次在B291扩增子边界确诊时,发现只是张成的扩增子峰确实GATA6和CTAGE1(图1 b)。我们也验证了GATA6在B291放大定量(Q) pcr (图1 c),并通过荧光原位杂交(鱼)的母公司肿瘤B291异种移植是派生(图1 d,左面板),后者除放大在异种移植产生增长的可能性。焦18 18 q11.2增益也出现在3(17%)胰腺癌细胞系(AsPC1, Panc3.27和Capan1)我们曾报导了全息阵列([13])(图1一个发现和数据未显示),我们证实了鱼(图1 d)。

符合一个致癌作用,GATA6表现出在B291 mRNA表达增加了微阵列(图2一个)和异种移植的组织标本18 q11.2获得(图2 b;P= 0.003,Mann-Whitney紫外线测试),发现也证实了Q-reverse转录(RT) pcr (图2 c)。相比之下,邻近的基因的表达CTAGE1没有被Q-RT-PCR(数据没有显示)。我们还观察到GATA6蛋白水平增加了免疫印迹在胰腺癌细胞株18 q11.2增益,而胰腺癌细胞系没有获得或nontumorigenic人类胰腺导管上皮行HPDE (图2 d),通过免疫组织化学(包含IHC)在父B291的肿瘤异种移植是派生(图2 e)。评估GATA6表现出高的频率表达式在初级胰腺癌,我们执行包含IHC组织微阵列(TMA),包括例正常胰腺,胰腺炎,胰腺导管腺癌。我们观察到温和的和强大的GATA6核染色分别15(28%)和25(46%)的54个主要胰腺癌相比只是3(9%)和0(0%)的受访33正常胰腺标本(P< 0.001,χ2测试)(图3)。GATA6表达式也提高胰腺炎(图3 e)。没有明显关系GATA6染色和肿瘤年级(P= 0.18,χ2测试)。

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图2。 GATA6是过表达时放大。

(A)的DNA(通过全息阵列)与mRNA(通过表达式分析)比率为标本B291显示基因18号染色体上GATA6(表示)是最高度表达基因在18 q11.2扩增子。(B)GATA6信使rna水平,衡量微阵列,升高pancreatobiliary异种移植相比,没有获得DNA在18 q11.2 (GATA6)。箱形图显示25th,50th和75年th百分位数;P值(Mann-Whitney紫外线测试)成对比较。(C) Q-RT-PCR验证microarray-measured GATA6转录水平在八个标本,四18 q11.2获得每个有或没有。(D)免疫印迹分析代表胰腺癌细胞系GATA6(56 kD)过表达在蛋白质水平放大;GAPDH作为加载控制。(E)包含IHC GATA6分析蛋白表达(布朗核染色)显示高表达在父的肿瘤异种移植B291派生(左),相比正常胰管从相同的石蜡切片(正确的)。

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1000081.g002

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图3。 GATA6是主要在胰腺肿瘤。

显示代表包含IHC染色GATA6蛋白表达在正常胰腺(A),和(B)在胰腺导管腺癌,(C)温和,(D)强大的核染色。箭头显示胰腺导管上皮细胞(一个),或者胰腺癌细胞(B- - - - - -D)。开放箭头(一个)显示非特异性胞质染色观察胰腺腺泡的细胞。(E)的分布GATA6表达式代表不同的诊断之间的组织微阵列。IHC染色分数认为细胞染色强度和分数与核染色(见材料和方法)。相比,胰腺癌GATA6表达显著升高正常胰腺(P< 0.001,χ2测试)。

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1000081.g003

由于GATA6转录监管机构,我们试图识别中的基因,其中可能包括其下游转录目标和建议功能关系。使用意义的微阵列分析(山姆)[22],我们发现的86个基因表达明显(罗斯福,错误发现率< 1%)增加(73个基因)或减少(13)基因在异种移植高架GATA6表达式(图4一)。SAM-identified基因设置横跨不同的生物过程,包括已知的癌症基因FGF1和邪恶。基因集富集分析(GSEA)[23]证实一个浓缩的假定的上游GATA因子结合位点基因的表达与GATA6水平升高(P= 0.004)(图4 b)。有趣的是,通过GSEA顶部高架GATA6表达相关的功能基因集所有相关的线粒体活动与氧化磷酸化(图4 c)。

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图4。 GATA6表达式的签名。

(A)基因被山姆的热图表示分析显著(罗斯福< 1%)增加(73个基因)或减少(13)基因表达在异种移植GATA6 mRNA水平高于均值。标本下令GATA6表达水平;基因在山姆的降序排名分数上是有序的。表达水平是由比色比例尺度表示(如图所示)。(B)叫GSEA标识浓缩的基因与假定的结合位点在异种移植GATA6表达水平高于均值。浓缩是证明的早期积极的偏转Kolmogorov-Smirnov运行总和。最大运行总和(的意义年代)是评价相比之下500次试验,随机排列类标签;的P值的频率年代在实际的数据等于或超过在交换数据。(C)一流(罗斯福)显示功能基因集被GSEA浓缩在异种移植与GATA6表达水平高于平均水平。柠檬酸:三羧酸(柠檬酸)循环。

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1000081.g004

直接评估的功能意义GATA6放大和超表达在胰腺癌中,我们使用RNA干扰(RNAi)目标GATA6击倒两个胰腺癌细胞株,AsPC1 Panc3.27,GATA6获得和超表达。两个独立的转染On-TARGETplus短干扰rna (siRNAs)目标GATA6,设计和化学改性脱靶效应降到最低[24],[25],导致减少GATA6蛋白质水平(图5一个),并减少细胞增殖而负控制核池(图5 b)。而减少细胞增殖是相对温和,这是统计学意义和可再生的多个独立的实验(没有显示)。相比之下,siRNA胰腺癌细胞系转染,PL45,没有GATA6放大和超表达(图2 d)没有减少细胞增殖(图5 b,正确的面板),支持的特异性GATA6目标。我们更详细地检查GATA6击倒在AsPC1细胞的影响,在细胞增殖减少是由于降低了细胞循环过程(就是明证分数降低s阶段;图5 c),但不增加细胞凋亡(图5 d)。GATA6击倒AsPC1细胞也导致减少集落形成液体培养(图5 e)。

缩略图
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图5。 GATA6放大/过度导致细胞增殖。

(一)确认siRNA-mediated击倒GATA6 AsPC1和Panc3.27细胞。两个不同的siRNAs (GATA61,GATA62)被用来GATA6目标,以及一个新核池(控制)。通过免疫印迹GATA6化验水平;GAPDH水平提供了一个加载控制。(B) GATA6击倒的结果在降低血清细胞增殖下降,衡量WST-1化验,在细胞(AsPC1 Panc3.27)但不是没有(PL45)GATA6获得/超表达。*,P< 0.05;* *,P< 0.01(学生的学习任务;GATA6而控制)。(C) GATA6击倒减少AsPC1细胞细胞循环发展,证明了这一点分数降低s阶段BrdU标记后,通过流式细胞仪量化。*,P< 0.05;(学生的学习任务;GATA6而控制)。(D) GATA6击倒不显著改变的细胞凋亡水平,量化的膜联蛋白V染色。(E) GATA6击倒减少殖民地AsPC1液体培养细胞的增长。箱线图展示了25th,意思是,75th百分位;P值(t)表示。代表领域Giemsa-stained殖民地所示(正确的)。

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1000081.g005

在互补实验中,我们试图通过逆转录病毒转导GATA6过表达在人类胰腺导管上皮细胞HPDE nontumorigenic,和胰腺癌细胞系PL45窝藏激活喀斯特但没有18 q11.2增益。尽管GATA6表达最初发现在感染细胞免疫印迹(数据未显示),表达了在扩张下细胞池的选择,建议GATA6授予-健身在这些细胞环境。

讨论

我们研究的主要目的是为了全面目录CNAs pancreatobiliary癌症。基因组分析31胰腺和6远端胆管癌异种移植确定众多焦点高层DNA扩增和纯合子缺失,从而精确定位和候选癌基因。已知的癌症基因包括焦点放大MYC(8 q24.21),喀斯特(12 p12.1)AKT2(19 q13.2)和纯合子缺失TGFBR2(3 p24.1)CDKN2A(9 . 3)。其他重点提出全新的病理学变化。例如,纯合子的删除TLR3(toll样受体3)(4 q35.1),在先天免疫反应和功能也在胰腺中高度表达[26],[27]指出,一个可能的感染在胰腺癌生成的作用。

著名的小说致癌基因候选人中我们确定了GATA6在18 q11.2放大。GATA6是六名成员之一的哺乳动物GATA转录监管机构的家庭,每一个有两个锌指域和绑定共同的DNA序列元素(A / T)叫(A / G)[19]。GATA因素1 - 3表达主要在造血血统,虽然叫因素4 - 6表示各组织来源于中胚层和内胚层,包括心脏、肝脏、肺、肠道,卵巢和睾丸,它们在细胞谱系的规范功能[19],[28]。与胰腺发展鼠标,GATA4和GATA6表达在内分泌和外分泌细胞前体,在成人胰腺的表达GATA4 GATA6仅限于外分泌和内分泌室,分别[20],[29]。最近,GATA4和GATA6都被证明是需要正常胰腺规范和发展[20],[21]。而GATA6与胰腺的发展,我们的发现现在还联系吗GATA6胰腺癌,GATA6放大和合成超表达显著贡献(尽管在适度水平)致癌表型(细胞增殖,细胞循环发展和集落形成)的胰腺癌细胞。

鉴于其发展和细胞连接规范,致癌作用GATA6看起来令人惊讶。的确,GATA6一直认为次数在其他细胞环境[30],[31]已确定,灭活突变在人类恶性星形细胞瘤[31]。尽管如此,其他细胞lineage-specific转录因子放大在发现了癌症,包括MITF在黑素瘤[32],基于“增大化现实”技术在hormone-independent前列腺癌[33],ESR1在乳腺癌[34],最近NKX2-1(TITF)在肺癌[17],[35]- - - - - -[37]。改变表达的转录监管机构,拥有正常的角色在天堂增殖或生存,可能需要对肿瘤生存和发展在某些细胞和遗传背景,表明“lineage-dependency”状态[38]。更普遍的是,管制的转录因子的表达与角色在正常发展反映了“肿瘤学概括个体发生”的原则[39]。当我们发现GATA6放大主要在pancreatobiliary癌症,GATA6表达并不局限于发展中胰腺,因此它还有待决定GATA6可能有致癌作用,其他细胞谱系。

lineage-specific致癌基因的另一个特点是,他们的致癌活性似乎是高度依赖细胞和遗传背景。MITF表达是正常的人类黑色素细胞生长抑制[40]的上下文中,但BRAF激活(TP53和RB1通道失活)导致生长因子和锚固独立成长[32]。同样,TITF1增长抑制表达在人类肺上皮细胞永生化[35],但促进肺癌细胞增殖和生存,当放大[17],[37]。与这些研究结果一致,GATA6表达的负面健康在人类胰腺导管上皮细胞永生化(HPDE)在胰腺癌细胞系(PL45)喀斯特激活但没有18 q11.2增益。进一步的研究需要阐明的遗传背景GATA6致癌作用。

而GATA6是放大在异种移植标本的19%,高蛋白质水平的表达主要调查的胰腺肿瘤的46%。这一发现表明,GATA6表达式可能升高的机制是在大量的子集情况下基因扩增。我们还指出增加胰腺炎GATA6表达式,为发展中胰腺癌是一种已知的危险因素[41],并建议一个可能的机械联系。如上所述,GATA4也表示在正常胰腺发展,虽然不像GATA6表达式是保留在成年人的外分泌胰腺。感兴趣的,我们也观察到DNA收益生成GATA4在8 p23.1异种移植的一个子集(未显示),虽然没有焦点的DNA扩增。需要额外的研究检查功能,如果有的话,pancreatobiliary GATA4的癌症。

我们与GATA6转录水平的基因表达模式的分析揭示了一个有趣的关联基因功能的线粒体氧化磷酸化。这种改变线粒体活动可能导致致癌作用通过改变细胞代谢,活性氧(ROS)生产,或(通过改变线粒体膜电位)mitochondrial-associated凋亡通路[42],[43]。在后者方面,值得注意的是,我们没有观察到一个GATA6击倒对细胞凋亡的影响,而是在细胞循环发展。线粒体氧化磷酸化而确切的联系还有待阐明,感兴趣的是,类似的“OxPhos”表达式模式是最近发现的一个子集弥漫型大b细胞淋巴瘤[44]。

自GATA6表达在正常成人组织内分泌胰腺、肺、肝脏和心脏[18],它本身是不可能成为一个有用的治疗目标。然而,未来的研究将更精确地定义转录效应物和通路通过GATA6调和其致癌作用,其中一些可能成为重要的分子靶点。总之,我们的基因组分析和功能研究定义GATA6候选人在pancreatobiliary癌症lineage-specific致癌基因,发现这应该给治疗带来新的机遇。

材料和方法

标本

胰腺和远端胆管癌异种移植生成的所述[14]约翰霍普金斯医院的机构审查委员会(IRB)和机构动物保健和使用委员会的批准。简单地说,一个1毫米3原发肿瘤的块浸泡在基底膜基质(生物医学研究协作),然后植入皮下注射ν/ν鼠标。道肿瘤收获当他们到达1 - 2厘米直径。证实了肿瘤细胞浓缩H&E-stained冰冻切片。从相邻的异种移植,DNA片段分离使用试剂盒DNeasy组织工具,使用试剂盒和RNA(表达载体)方法。胰腺癌细胞系得到来自美国文化集合类型,和HPDE细胞系[45]请提供了明曹博士(多伦多大学)。

全息阵列和表达分析

互补脱氧核糖核酸微阵列从斯坦福大学获得功能基因组学工具,包括39632名人类的互补,代表22279绘制人类基因(18049 UniGene集群[46]4230,加上额外的映射est序列不分配UniGene id)。全息阵列和表达进行了分析根据我们的出版协议[47],[48]。全息阵列,4µg每个测试样本的基因组DNA random-primer贴上Cy5和co-hybridized芯片连同4µg Cy3-labeled sex-matched正常白细胞参考DNA从单一捐赠者。总RNA的基因表达分析,50µg从每个样本和50µg“普世”引用RNA(人类细胞系来自11个不同的建立)差异会被贴上Cy5 Cy3,分别和co-hybridized互补脱氧核糖核酸微阵列。一夜之间杂交和洗涤后,数组在使用GenePix 4000 b扫描仪(分子设备)。荧光比率提取使用SpotReader软件(奈尔斯科学)和斯坦福微阵列数据上传到数据库(SMD)[49]储存、检索和分析。完整的微阵列数据集在SMD和基因表达综合(GEO)(入世GSE11152)。

微阵列数据分析

Background-subtracted荧光比率被意味着规范化定心基因为每个数组。对于全息阵列分析,我们只包括后续分析有效度量基因Cy3 reference-channel荧光信号强度至少1.4倍以上背景至少50%的样本。地图位置排列cDNA克隆被分配使用NCBI基因组大会,通过UCSC基因组浏览器访问数据库(NCBI建立36)。对由多个基因排列的互补,平均荧光比例使用。DNA损益确定拉索的融合方法[50]。我们定义高级DNA扩增和假定的纯合缺失与相邻地区被融合套索至少50%的基因显示荧光比率≥3或≤0.25,分别。表达分析,荧光比率被规范化为每个数组,然后有效度量基因(荧光强度Cy5或Cy3通道至少1.5倍以上背景)随后被“mean-centered”(即报告每个基因相对于均值比率在所有样本)。

山姆分析[22]使用双阶级执行方法,比较异种移植标本和上方和下方的意思是GATA6 mRNA水平。GSEA[23]进行描述[51]。基因与假定的叫结合位点(在第一个1 kb上游启动子序列)是使用匹配定义软件([52];默认设置设置为减少假阳性),应用于常见的结合位点矩阵V $ GATA_Q6(所有六个叫因素共同的DNA结合位点,叫(a / T) (a / G)[19])。评估叫浓缩的结合位点,GSEA度量的绝对值(皮尔森相关)是为了考虑调节和表达下调目标。GSEA使用522个功能基因集进行了描述[23]。

高清18 q11.12 CGH微阵列

自定义超高清CGH微阵列设计和安捷伦科技[53]。数组包括4362探针花砖1.5 Mb -19.0 (17.5 Mb) 18 q11.2 inter-probe间距平均344元,和一个额外的23652探测跨越剩下的基因组数据规范化。dna是上面贴上,然后杂化到安捷伦阵列制造商的指示后,除了使用40小时杂交时间(而不是推荐的24小时)。数组使用安捷伦G2505B扫描仪进行扫描和数据提取和规范化使用安捷伦特征提取与默认设置软件(版本9.1)。

PCR检测

验证纯合缺失(见表1),我们使用gene-specific primer-pairs从异种移植PCR扩增基因组DNA标本。Primer-pairs纯合缺失的基因侧翼区域,并设计有一个区分片段大小,包含在PCR反应作为内部控制,和正常的DNA被用作底漆对积极的控制。PCR进行一个应用生物系统公司GeneAmp 9700,使用40 ng DNA模板,1×PCR缓冲(应用生物系统公司),200年µM核苷酸,2.0毫米MgCl210 pmol每个引物(表S1),1 U AmpliTaq黄金DNA聚合酶(应用生物系统公司)在10µl反应。反应条件:95°C 10分钟初始变性,紧随其后的是35周期(94°C 30年代;退火温度(见表S130年代);30年代72°C),最后一个扩展72°C的7分钟。PCR产品解决了凝胶电泳TAE 1.8%琼脂糖凝胶,并使用UVP凝胶文档可视化系统。

来验证GATA6在B291放大,我们进行了使用Quantitect Q-PCR SYBR绿色PCR试剂盒(试剂盒)ABI 7500序列检测系统按照制造商的指示。PCR是在95°C 15分钟(激活修改Taq),紧随其后的是40个循环扩增(95°C 15秒,58°C 30年代,30年代72°C)。融化曲线分析,以确保特定PCR产品而不包括引物二聚体。我们使用了比较CT方法[54]计算相对DNA水平正常化NPC1(基因定位在18 q11.2扩增子而不是展示CNA),然后我们表示为一个比例的Ct值GATA6(也归一化NPC1)获得正常的DNA。PCR引物序列中列出表S1。

验证microarray-measured GATA6 mRNA水平,我们开展Q-RT-PCR使用QuantiTect SYBR绿色rt - pcr设备根据制造商的指示。第一次孵化反应混合物在50°C为逆转录30分钟,然后Q-PCR如上所述。对于每一个标本,相对水平的GATA6记录计算的Ct值的比值GATA6 GAPDH。比率值被转换成日志2意味着所有样本规模和规范化。PCR引物序列中列出表S1。

鱼

探针标记和鱼进行使用Vysis试剂根据制造商的协议。locus-specific BAC映射GATA618岁q11.2 (rp11 - 1083 g24;BACPAC资源中心)与SpectrumOrange标记,和co-hybridized SpectrumGreen-labeled 18号染色体着丝粒探针(CEP18;Vysis)。正常中期染色体的位置BACs验证使用幻灯片(没有显示)。幻灯片与DAPI复染色,并使用一个奥林巴斯BX51成像与应用荧光显微镜成像Cytovision 3.0软件。

免疫组织化学

组织微阵列(TMA)是构建组织使用一个数组(比彻仪器)和归档formalin-fixed,胰腺组织石蜡包埋标本从斯坦福大学,IRB的批准。TMA包含1.2毫米核心代表正常胰腺(33例)、胰腺炎(16),其他良性诊断(9),胰腺导管腺癌(54)。免疫组织化学,4µm部分被切割的组织微阵列块,在Citrisolv de-paraffinized(费舍尔科学),和水化分级系列酒精的解决方案。在柠檬酸燥热引起抗原检索是由微波预处理(1毫米,pH值6.0)染色前15分钟。内源性过氧化物酶被预孵化与磷酸盐1%的过氧化氢。GATA6鼠标使用单克隆抗体(研发系统)在1∶10稀释30分钟。显色检测进行了使用peroxidase-conjugated二级抗体和民建联设想提供的试剂检测设备(Dako)。核染色强度(缺席,弱、中、强;0 - 3规模)和部分上皮细胞染色(25%,50%,75%,100%;1 - 4)规模都记录下来,然后总结最后染色分数。

核转染

On-TARGETplus siRNAs目标GATA6以及负控制核池(ON-TARGETplus siCONTROL新池),从Dharmacon获得。siRNAs序列中列出表S1。细胞系都维持在37°C完成媒体rpmi - 1640(表达载体),10%的边后卫,50 U /毫升青霉素,链霉素50 U /毫升。转染,每6-well板100000 - 250000细胞被播种,并使用Lipofectamine 2000转染试剂(英杰公司)根据制造商的协议。细胞转染的最终浓度小干扰rna 6小时50 nM,随后降低血清(2%的边后卫)增长取代媒体,siRNA-mediated表型效应更可再生产地观察到的地方。

免疫印迹

72小时post-transfection,细胞细胞溶解1×里帕裂解缓冲(北部/ Chemicon)补充1×完整的蛋白酶抑制剂(罗氏,印第安纳波利斯),0.1毫米钠原钒酸盐,1毫米氟化钠和1毫米PMSF和蛋白质量化使用直流试验(Biorad)。免疫印迹,批准µg蛋白溶菌产物电泳三羟甲基氨基甲烷/液10%甘氨酸(Biorad)和聚丙烯酰胺梯度凝胶转移到PVDF膜(Biorad)。阻塞后TBS-T缓冲区(20毫米Tris-HCl pH值7.4,0.15 M氯化钠,渐变20 0.1%)与5%的奶粉30分钟,屁股被孵化顺序主要抗体在4°C一夜之间,然后HRP-conjugated二级抗体在室温温度45分钟。抗体被用于如下:anti-GATA6兔多克隆抗体(1∶200;圣克鲁斯生物技术);anti-GAPDH兔多克隆抗体(1∶5000加载控制;圣克鲁斯生物技术);HRP-conjugated anti-rabbit免疫球蛋白g(1∶20000,皮尔斯)。检测进行了使用ECL工具包(Amersham生物科学)。

细胞增殖实验

post-transfection 24日,72年和96年小时,细胞增殖是由比色法是基于量化的代谢乳沟四唑盐WST-1可行的细胞,根据制造商的协议(罗氏)。WST-1试剂添加在1/10th文化体积和孵化30分钟的37°C。那时吸光度测量在450 nm,参照650海里使用光谱Max 190板读者(分子设备)。转染进行了一式三份,平均(±1 SD) OD报道。

细胞循环分析

72小时post-transfection,细胞循环分布分析是由流式细胞术使用BrdU-FITC流工具包(BD生物科学)制造商的指示。细胞孵育10µM BrdU在37°C 4小时,然后固定和permeabilized Cytofix / Cytoperm缓冲区(BD生物科学)。细胞DNA处理DNase 37°C 1小时暴露事务局BrdU,然后细胞沾anti-BrdU FITC抗体(量化合并BrdU)和7-aminoactinomycin D (7-AAD;量化总DNA含量)。10000事件是由FACSCalibur得分(BD生物科学)和分析使用CellQuest软件(BD生物科学)。转染进行了一式三份,平均分数(±1 SD)细胞循环报道。

液体集落形成试验

24小时post-transfection, 200细胞被镀上十10厘米的菜肴在完整的媒体。2周后,幸存的细胞被染色和染色(Sigma-Aldrich) 15分钟,灯箱和可见的菌落数。

细胞凋亡检测

转染后72小时,细胞凋亡是由膜联蛋白V染色,化验量化通过流式细胞术使用Vybrant凋亡分析工具包(英杰公司)按照制造商的指示。漂浮细胞,使胰蛋白酶化附着细胞池,并在200年resuspendedµl膜联蛋白绑定缓冲。2.5µl Alexa萤石488膜联蛋白V和1 100年µlµg /毫升propidium碘(PI)解决方案添加和细胞孵化15分钟在临时房间。然后resuspended在相同体积的膜联蛋白绑定缓冲和立即通过流式细胞术分析。10000事件是由FACSCalibur得分和分析使用CellQuest软件。转染进行了一式三份,平均百分比(±1 SD)细胞凋亡。

支持信息

图S1。

代表PCR-validations纯合子的删除。(一)3 p24.1删除。假定位于纯合缺失,TGFBR2扩增从正常菌进行基因组DNA,但不是从胰腺癌异种移植P224。(B) 9 p21.2删除。内删除,MOBKL2B扩增从正常菌进行基因组DNA从P201但不是。

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1000081.s001

(0.22 MB PDF)

表S1。

底漆/核序列。

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1000081.s002

(0.02 MB XLS)

确认

我们希望感谢SFGF芯片制造、数据库支持的SMD, Ilana加尔佩林(斯坦福细胞遗传学实验室)援助与鱼分析,Eon里奥斯寻求帮助和流式细胞仪分析。我们也感谢波拉克实验室的成员有益的讨论。

作者的贡献

构思和设计实验:KK MB JP。进行了实验:KK MB JK RR ER YK SC GS。分析了数据:KK MB JK RR ER YK CG YC SC KS PW GS JP。造成试剂/材料/分析工具:公里CK PW TH MV。该报写道:KK MB JP。

引用

  1. 1。Bardeesy N, DePinho RA(2002)胰腺癌生物学和遗传学。Nat牧师癌症2:897 - 909。
  2. 2。Maitra Kern SE, Hruban RH(2006)分子胰腺癌的发病机制。最好Pract Res反应20:211 - 226。
  3. 3所示。Kamb A Gruis NA Weaver-Feldhaus J,刘问,Harshman表示K, et al。(1994)细胞周期监管机构可能涉及在《创世纪》中许多肿瘤的类型。科学264:436 - 440。
  4. 4所示。哈恩SA舒特等人,霍克,Moskaluk CA, da Costa LT, et al . (1996) DPC4,候选人在人类染色体18 q21.1肿瘤抑制基因。科学271:350 - 353。
  5. 5。Kozu T,须K,岐F(1995)胰腺癌发展和解剖变异。Gastrointest Endosc N点5:行。
  6. 6。拉希德(2002)胆道肿瘤的细胞和分子生物学。河南N点11:995 - 1009。
  7. 7所示。Iacobuzio-Donahue CA, van der Heijden女士,费利克斯先生,特鲁普WJ,罗姆JM, et al。(2004)本文主要的大规模等位型癌提供了定量估计的全基因组等位的损失。64:871 - 875。
  8. 8。小波拉克,Perou厘米,Alizadeh AA,艾森MB, Pergamenschikov, et al .(1999)全基因组分析DNA的人类基因组变化使用互补脱氧核糖核酸微阵列。Nat麝猫23:41-46。
  9. 9。Pinkel D,预示将DG(2005)阵列比较基因组杂交及其应用于癌症。Nat麝猫37:SupplS11-17。
  10. 10。Heidenblad M, Schoenmakers EF,琼森T, Gorunova L, Veltman是的,et al .(2004)全基因组基于阵列比较基因组杂交显示多个放大目标和小说在胰脏癌细胞系纯合缺失。64:3052 - 3059。
  11. 11。贝利Aguirre AJ,布伦南C, G, Sinha R,冯B, et al。(2004)胰腺腺癌基因组的高分辨率特性。101年《美国国家科学院刊年代:9067 - 9072。
  12. 12。Holzmann K, Kohlhammer H, Schwaenen C, Wessendorf年代,Kestler哈,et al .(2004)基因组基因芯片杂交揭示基因组扩增在胰腺癌的发病率高于传统的比较基因组杂交和导致了新的候选基因的识别。64:4428 - 4433。
  13. 13。Bashyam MD,拜尔R,金正日YH,王P, Hernandez-Boussard T, et al。(2005)基于阵列比较基因组杂交确定本地化DNA扩增和纯合子缺失在胰腺癌。瘤7:556 - 562。
  14. 14。哈恩SA,西摩AB,霍克,舒特等人M da Costa LT, et al。(1995)等位型使用异种移植胰腺腺癌的浓缩。55岁:4670 - 4675。
  15. 15。Bergamaschi,金正日YH,王P, Sorlie T, Hernandez-Boussard T, et al。(2006)不同的DNA拷贝数改变模式与不同的临床病理的功能和相关基因表达的乳腺癌亚型。癌症基因染色体45:1033 - 1040。
  16. 16。Lapointe J,李C, Giacomini CP,力K,黄年代,et al。(2007)基因组分析揭示了替代前列腺肿瘤发生的基因通路。67:8504 - 8510。
  17. 17所示。Kwei KA,金正日YH,吉拉德L,花王J, Pacyna-Gengelbach M, et al .(2008)基因组分析识别TITF1 lineage-specific致癌基因放大在肺癌。致癌基因。
  18. 18岁。员工铃木H, Gabrielson E,陈W, Anbazhagan R, van Engeland M, et al。(2002)基因组屏幕脱甲基的基因调节和抑制组蛋白脱乙酰酶在人类结肠直肠癌。Nat麝猫31:141 - 149。
  19. 19所示。Molkentin JD(2000)锌finger-containing转录因子GATA-4, 5、6。无所不在地表达了监管机构组织的基因表达。275年J临床生物化学:38949 - 38952。
  20. 20.Decker K,高盛,Grasch CL, Sussel L (2006) Gata6小鼠胰腺是一个重要的监管机构的发展。Dev杂志298:415 - 429。
  21. 21。瓦特AJ,赵R,李J,邓肯SA(2007)哺乳动物肝脏和胰腺腹侧的发展依赖于GATA4。BMC Dev杂志7:37。
  22. 22。呸! VG,朱Tibshirani R, G(2001)意义的分析微阵列应用于电离辐射响应。98年《美国国家科学院刊年代:5116 - 5121。
  23. 23。萨勃拉曼尼亚,Tamayo P,而VK,慕克吉年代,艾伯特提单,et al。(2005)基因集富集分析:一个基于知识的方法解释全基因组表达谱。102年《美国国家科学院刊年代:15545 - 15550。
  24. 24。伯明翰,安德森EM,雷诺兹,Ilsley-Tyree D, Leake D, et al。(2006) 3′UTR种子匹配,而不是整体的身份,与RNAi非目标相关联。Nat方法3:199 - 204。
  25. 25。杰克逊,今后J, Leake D,雷诺兹,Schelter J, et AL . (2006) Position-specific化学改性siRNAs降低“脱靶”转录沉默。Rna 12: 1197 - 1205。
  26. 26岁。岩石FL,此外,G, Timans JC, Kastelein RA, Bazan摩根富林明(1998)人类受体的家庭结构与果蝇人数有关。95年《美国国家科学院刊年代:588 - 593。
  27. 27。Alexopoulou L,霍尔特AC, Medzhitov R, Flavell RA(2001)识别的双链RNA和激活的NF-kappaB toll样受体3。自然413:732 - 738。
  28. 28。病人RK, McGhee JD(2002)叫家庭(脊椎动物和无脊椎动物)。当今麝猫Dev 12: 416 - 422。
  29. 29。Ketola我Otonkoski T Pulkkinen妈,尼米H, Palgi J, et al。(2004)转录因子GATA-6表达在内分泌和外分泌胰腺GATA-4。226年摩尔细胞性:51-57。
  30. 30.Capo-chichi CD,罗兰•IH Vanderveer L,包R,山形T, et al。(2003)异常表达上皮differentiation-determining GATA卵巢肿瘤发生的因素。63:4967 - 4977。
  31. 31日。Kamnasaran D,钱B, C·霍金斯,斯坦福王古(2007)GATA6是星形细胞瘤肿瘤抑制基因的基因诱捕小鼠神经胶质瘤模型。104年《美国国家科学院刊年代:8053 - 8058。
  32. 32。Garraway洛杉矶,Widlund人力资源,鲁宾,斯坦利·G·伯杰AJ, et al .(2005)综合基因组分析识别MITF作为家族生存在恶性黑色素瘤癌基因放大。自然436:117 - 122。
  33. 33。Visakorpi T, Hyytinen E, Koivisto P,坦纳米,Keinanen R, et al。(1995)体内雄激素受体基因的扩增和人类前列腺癌的进展。Nat麝猫9:401 - 406。
  34. 34。霍尔斯特F,斯塔尔公关,Ruiz C, Hellwinkel O,接过话头Z, et al。(2007)雌激素受体α(ESR1)基因扩增是频繁的在乳腺癌。Nat麝猫39:655 - 660。
  35. 35。田中H,平贺柳泽K, Shinjo K,田口,Maeno K, et al。(2007) Lineage-specific依赖监管机构TTF-1肺肺腺癌的发展。67:6007 - 6011。
  36. 36。肯德尔J,刘问,Bakleh Krasnitz,阮KC, et al。(2007)致癌合作和coamplification发育转录因子基因在肺癌。104年《美国国家科学院刊年代:16663 - 16668。
  37. 37岁。堰英航,吴女士,斯坦利·G,佩尔奈年代,丁L, et al。(2007)描述肺腺癌的癌症基因组。自然450:893 - 898。
  38. 38。Garraway洛杉矶,卖家WR(2006)血统依赖和lineage-survival致癌基因在人类癌症。Nat牧师癌症6:593 - 602。
  39. 39岁。莱希摩根富林明,Fugaro JM,黄Y,嗨,哈里斯CC, et al。(2001)的观点:细胞分化理论推进早期发现和治疗肺癌。Radiat Res 155: 235 - 238。
  40. 40。Loercher AE,坦克EM, Delston RB,港口JW (2005) MITF链接在黑色素细胞分化和细胞周期阻滞INK4A的转录激活。J细胞168:35 - 40。
  41. 41岁。Algul H, Treiber M, Lesina M,施密德RM(2007)疾病的机制:胰腺慢性炎症和癌症的潜在作用胰腺星状细胞吗?Nat中国Pract杂志4:454 - 462。
  42. 42。伯齐-麦辰马(2006)线粒体在衰老中的作用和致癌作用。Exp北京医学31:548 - 552。
  43. 43。Galluzzi L, Larochette N, Zamzami N,获得G(2006)线粒体作为癌症化疗的治疗靶点。致癌基因25日:4812 - 4830。
  44. 44岁。蒙蒂,野蛮KJ, Kutok杰,Feuerhake F,尔廷P, et al .(2005)弥漫型大b细胞淋巴瘤的分子分析识别健壮的亚型包括宿主炎性反应的特征。血105:1851 - 1861。
  45. 45岁。刘N, T,古河道Kobari M,曹女士(1998)比较表型研究的胰腺导管上皮细胞系来源于正常的人类和胰脏癌。是中草药153:263 - 269。
  46. 46岁。舒勒GD(1997)的难题:人类基因的表达序列标签和目录。J摩尔75:694 - 698。
  47. 47岁。小波拉克,Sorlie T, Perou厘米,里斯CA, Jeffrey党卫军et al .(2002)微阵列分析揭示了DNA拷贝数改变的主要直接作用在人类乳腺肿瘤的转录程序。99年《美国国家科学院刊年代:12963 - 12968。
  48. 48。Lapointe J,李C,希金斯JP, van de Rijn M,拜尔E, et al。(2004)基因表达分析确定临床相关的前列腺癌的亚型。101年《美国国家科学院刊年代:811 - 816。
  49. 49。得墨忒耳J, Beauheim C, Gollub J, Hernandez-Boussard T,金H, et al。(2007)斯坦福微阵列数据库:实施新的分析工具和开源版本的软件。核酸Res 35: d766 - 770。
  50. 50。王Tibshirani R P(2008)空间平滑和热点发现全息数据使用熔融套索。生物统计学9:29。
  51. 51。金YH,吉拉德L, Giacomini CP,王P, Hernandez-Boussard T, et al。(2006)结合微阵列分析小细胞肺癌显示改变凋亡平衡和不同的表情签名MYC基因扩增。致癌基因25日:130 - 138。
  52. 52岁。凯尔AE, Gossling E,路透社,Cheremushkin E, Kel-Margoulis OV, et al。(2003)匹配:一个工具搜索转录因子结合位点的DNA序列。核酸Res 31: 3576 - 3579。
  53. 53岁。巴雷特太,雅伯,Ben-Dor sampa N,利普森D, et al。(2004)使用寡核苷酸微阵列比较基因组杂交和总基因组DNA。101年《美国国家科学院刊年代:17765 - 17770。
  54. 54。Livak KJ, Schmittgen TD(2001)相对基因表达数据的分析使用实时定量PCR和2(−δδC (T))的方法。方法25:402 - 408。
  55. 55。肯特WJ Sugnet CW、弗瑞TS Roskin公里,普林格尔TH, et al。(2002)人类在UCSC基因组浏览器。基因组Res 12: 996 - 1006。