数据
作者总结
Kindlin-1蛋白突变FERMT1、编码,导致人类Kindler综合症,表现为皮肤起泡,萎缩,和癌症。最近的报告表明,另外一些Kindler综合症患者患有溃疡性结肠炎。然而,尚不清楚这是由于失去Kindlin-1还是由不相关的异常,如感染或额外的突变。我们切除Fermt1基因在小鼠体内的直接分析和分子病理后果Kindlin-1的作用方式。Kindlin-1-deficient老鼠发展严重的表皮萎缩,但缺乏水泡。所有突变小鼠出生后不久死于一个戏剧性的,剪切及分离的肠上皮细胞,后跟一个深刻的炎症和器官的破坏。肠道表型是非常相似,尽管更严重,Kindler综合症患者中观察到。体外研究表明,整合素激活受损,因此受损的粘附,细胞外基质的肠壁引起肠上皮细胞分离。因此,我们表明,肠道上皮细胞需要粘附功能的整合蛋白抵抗剪切力应用的凳子上。此外,我们提供证据表明与Kindler综合症相关的结肠炎Kindlin-1的障碍引起的,而不是由Kindlin-1-independent事件。
引用:Ussar年代,莫泽M, Widmaier M, Rognoni E,大厦C, Genzel-Boroviczeny O, et al。(2008)损失Kindlin-1引起皮肤萎缩和致命的新生儿肠上皮功能障碍。公共科学图书馆麝猫4 (12):e1000289。https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1000289
编辑器:维罗妮卡·范·Heyningen英国医学研究理事会人类遗传学单位
收到:2008年5月16日;接受:2008年11月3日;发表:2008年12月5日,
版权:©2008 Ussar et al。这是一个开放的文章下分布式知识共享归属许可条款,允许无限制的使用、分配、和繁殖在任何媒介,被认为提供了原作者和来源。
资助:这项工作得到了BMBF,奥地利科学基金会(SFB021)和马克斯·普朗克的社会。
利益冲突:作者宣称没有利益冲突存在。
介绍
Kindler综合症(KS;人类:173650)是一种罕见的、隐性的FERMT1基因的突变引起的遗传性皮肤病(C20ORF42 / KIND1)[1],[2]。KS病人患有皮肤异常,发生在不同的阶段不同的生活[3]。出生后皮肤水泡发展和消失,其次是皮肤萎缩,色素缺陷最后皮肤癌。个人症状的严重程度患者个体之间有广泛的差别。FERMT1分布沿整个基因和突变可以产生不同的截断Kindlin-1蛋白质[4]。有趣的是,不同的课程不能与KS FERMT1在特定区域的基因突变[3]表明额外的环境和/或遗传因素导致的疾病。
Kindlin-1属于小说细胞质蛋白激酶家族组成的三名成员(Kindlin-1-3)[5]。Kindlins由一个中央丰贸(带4.1、ezrin radixin, moesin)领域,中断的pleckstrin同源性(PH)域。他们本地化cell-matrix粘附网站(也称为局部粘连,FAs)调节整合素的功能。符合Kindlins整合素功能的作用,从KS病人和角化细胞Kindlin-1-depleted角质细胞显示受损细胞粘附和延迟细胞扩散[6],[7]。机制如何Kindlin-1调节整合素功能不理解和争议。Kindlin-2 (Fermt2)和Kindlin-3 (Fermt3)显示绑定到膜远NxxYβ1的主题(Itgb1)和β3 (Itgb3)整合蛋白胞质域。这个绑定,与蛋白(Tln1)招聘膜近端NPxY主题,导致β1激活(由内向外信号)和β3类整合蛋白使他们结合配体。配体结合后,Kindlin-2和Kindlin-3呆在基质粘附网站链接ECM的肌动蛋白细胞骨架招聘家族和Migfilin (Fblim1) FAs(由外向内的信号)。符合Kindlins适配器功能,KS患者角化细胞和角化细胞耗尽Kindlin-1显示受损细胞粘附和延迟细胞扩散[6],[7]。然而,重要的是,据报道,Kindlin-1比Kindlin-2和3个不同的属性,因为它展示了像蛋白绑定到近端NPxYβ1的主题整合素尾巴[6]。
Kindlins有特定的表达模式。Kindlin-1表达在上皮细胞,而Kindlin-2表达几乎无所不在。他们都是在整合素粘附网站和/或cadherin-based信息连接。Kindlin-3只表达造血细胞,控制多种功能在血小板从信号转导[8]稳定成熟的红细胞的膜细胞骨架[9]。
虽然FERMT1基因表达在上皮细胞的几乎所有组织和器官[5],只有异常的皮肤和口腔黏膜与KS相关联。最近,据报道,然而,一些KS患者还出现溃疡性结肠炎(UC)[4],[10],[11]与克罗恩病,属于特发性炎症性肠病。
加州大学通常发生在第二或第三个十年的生活,虽然在儿科患者发病率不断上升[12],[13]。加州大学是局限于结肠癌和特征是粘膜浅表溃疡。目前认为,粘膜溃疡由它引发的复杂混合物的释放炎症介质导致严重的炎症和随后的上皮细胞的破坏[12]。符合这种模式大量的小鼠结肠炎模型先天和适应性免疫反应时发生改变[12]。遗传连锁分析的人导致了几个易感性位点的识别[14],[15]。
疾病与加州大学课程的大部分KS开发他们的第一个加州大学症状的患者在成年。然而,有趣的是,其中一个患有一种严重的新生儿的加州大学,被诊断出患有一种零FERMT1基因的突变后发展伤害皮肤起泡[10]。因为只有少数KS病人患肠道症状的报道,目前讨论加州大学发展这些患者是否直接联系FERMT1基因突变或次要由微生物引起的感染或异常炎症反应。
直接在这项研究中,我们调查的角色Kindlin-1体内通过生成老鼠携带本构零Kindlin-1基因的突变。我们证明Kindlin-1缺陷小鼠开发皮肤萎缩和致命的肠上皮功能障碍,类似报道,加州大学的KS的病人。肠道上皮功能障碍是由缺陷引起的肠上皮细胞整合素激活导致广泛上皮脱离了严重的炎症反应。
结果
Kindlin-1损失导致致命的肠上皮功能障碍
为了揭开Kindlin-1体内流失的后果,我们建立了一个鼠标应变破坏Fermt1基因,导致完全丧失Kindlin-1 mRNA和蛋白(图1 a - c)。杂合的(Kindlin-1 Kindlin-1老鼠+ /−)没有表型,肥沃。Kindlin-1-deficient老鼠(Kindlin-1−−/)出生在一个正常的孟德尔式比例(+ / + 29.6%;+ /−44.1%;−/−26.3%;在P0 n = 203),出现正常出生时。产后两天(P2),所有Kindlin-1−−/老鼠分析到目前为止脱水(图1 d),未能茁壮成长(图1 eP3-P5之间)和死亡(图1 e)。Kindlin-1血糖和甘油三酯水平−−/老鼠正常显示正常营养的吸收在小肠(图S1)。尿液显示渗透性增加,蛋白质含量进一步指向严重脱水(图1 f,图S2A和B)。组织学的Kindlin-1−−/肾脏在P3显示正常的肾小球和肾小管形态系统(图S2C)。因此,这些发现表明,peri-natal杀伤力不是肾脏功能障碍引起的。
(A) Fermt1基因中断代替ATG起始密码子含有新霉素抗性盒外显子2。(B) Kindlin-1 mRNA水平测定PCR从互补dna来自P3肾脏。(C)的损失Kindlin-1蛋白质在结肠IEC溶解产物经免疫印迹。(D)新生儿(P0)和两天的照片老老鼠(P2)。规模酒吧代表5毫米。(E)体重Kindlin-1曲线−−/(n = 8)和控制同窝出生(+ / +);n = 8;+ /−;n = 9), __表明老鼠死后。* * *表示p值< 0.0001。误差标准差。P2 Kindlin-1 (F)渗透性−−/和控制(+ / +)尿液每个基因型(n = 3)。误差标准差。* * *表示p值< 0.0001。
接下来我们分析是否皮肤异常导致围产儿死亡率。尽管Kindlin-1−−/KS的老鼠显示特征如皮肤萎缩和角化细胞增殖减少(图2 a和B),粘附基底角质细胞的基底膜(BM)是不变的(图2一个和图S3)。组织学backskin部分从不同发展阶段显示正常角化细胞分化(图S4),正常表皮屏障的发展(图S5A和图2 c和D),可比在E18.5表皮厚度,P0 (图S5B)。符合发展增殖缺陷量化角质细胞阳性细胞周期的数量标记Ki67 (Mki67),减少表皮厚度首次观察到P1 (图S5B)。有趣的是尽管轻度体内表型,Kindlin-1−−/角化细胞显示严重粘连和传播文化(缺陷图S6A和B)进一步表明Kindlin-1−−/角化细胞从老鼠和人显示类似的缺陷[7]。
(一)P3 backskin)染色显示严重的Kindlin-1表皮萎缩−−/老鼠。大英博物馆是由虚线表示和分离表皮真皮(d) (e)。sc:角质层。50µm比例尺表示。(B)的百分比Ki67-positive interfollicular角质细胞,增殖细胞,在不同的年龄(n = 7 /基因型)。误差线显示标准错误的意思。(C) Kindlin-2(红色;与α6 co-stained整合素(α6 int;在绿色)和钙粘蛋白(绿色,co-stained胶原IV(红色)胶原IV)染色的P3 backskin部分。细胞核蓝色所示。10µm比例尺表示。 (D) FITC-Lucifer yellow stain of P3 backskin overlaid with DIC. Lack of lucifer yellow dye penetration shows normal skin barrier in Kindlin-1−−/老鼠。50µm比例尺表示。
这些结果表明,另一个缺陷是负责他们的围产儿死亡率。当Kindlin-1的胃和小肠−−/老鼠了,肿胀,充满了牛奶和气体(图3一)建议严重的肠道功能障碍可能是死亡的原因。牛奶在胃的存在与口腔和食管粘膜的正常组织学显示受损造成的杀伤力不是喂养(图S7)。在P2,末端回肠和结肠缩短和远端结肠和狭窄明显肿胀,急性炎症的迹象(图3 b)。P3,大多数突变小鼠死亡时,超过80%的结肠上皮细胞分离(图3 c和图S8A-C),成为凋亡(图S9)和渗透的巨噬细胞、粒细胞(Mac-1;Itgam染色)和T细胞(你的染色)(图3 d)。缩短结肠既不是由于细胞凋亡增加,只看到在分离上皮,也由于减少肠道上皮细胞(IEC)扩散(图S9)。
(一)打开腹部P2小鼠的小肠。箭头指示空气Kindlin-1的胃和小肠−−/老鼠。提单;膀胱。比例尺表示5毫米。(B)整个肠道准备从P2老鼠。比例尺表示5毫米。箭头表示远端结肠狭窄。盲肠是突出红色圆圈和冒号标记绿线。(C))染色P3结肠和回肠。Kindlin-1−−/老鼠显示没有完整的结肠上皮细胞(e),暴露的黏膜下层肠道流明(陆)和严重的炎症在结肠和回肠。规模50µm酒吧代表。(D)巨噬细胞和粒细胞渗入P3结肠与Mac-1染色显示绿色。t细胞浸润在P3结肠与Thy1.2染色显示绿色。纤连蛋白(FN)在红染色。规模50µm酒吧代表。
上皮细胞分离和严重的炎症扩展到回肠(图3 c)。相比之下,近端小肠(十二指肠和空肠)没有IEC超然的证据或炎症(图4)。的表型Kindlin-1−−/大部分拟表型小鼠的肠道疾病观察病人Kindlin-1完全丧失[10]。
P1)染色法(A)和(B) P3十二指肠和空肠的部分揭示了Kindlin-1的正常组织学−−/小肠。规模50µm酒吧代表。
需要Kindlin-1肠道上皮细胞粘附
定义单元类型受损失Kindlin-1我们本地化Kindlin-1正常肠免疫染色。类似的情况的人[4],Kindlin-1存在整个细胞质的iec的结肠癌和基底外侧地点iec的冒号(图5一个)和小肠(图5 b)。的anti-Kindlin-1多克隆抗体产生了一些微弱的不具体的背景信号在野生型和Kindlin-1肠道间质−−/老鼠(图5 b)。Kindlin-2只发现在信息接触,不改变其分布在缺乏Kindlin-1 (图5 c和D)。粘着斑(FA)组件,比如蛋白和Migfilin以及丝状肌动蛋白(f -肌动蛋白)在Kindlin-1表示正常−−/结肠上皮仍坚持大英博物馆(图5 c和数据未显示)。
(A)免疫荧光染色的Kindlin-1新生儿结肠。箭头表示BM。(B)免疫荧光染色的Kindlin-1 P1回肠。箭头表示大英博物馆。(C)免疫荧光染色Kindlin-2 P1结肠,Migfilin, f -肌动蛋白(红色),α6整合素(α6 int;绿色)和层粘连蛋白- 332 (LN332;绿色)。(D)免疫荧光染色的结肠Kindlin-2(绿色)和钙粘蛋白(E-cad;红色)。所有酒吧代表10µm规模。
接下来,我们确定时间点突变小鼠开始发展时肠道异常。在E18.5 Kindlin-1的回肠和结肠−−/老鼠组织学检查正常,电镜显示一个完整的上皮细胞和基底膜(BM) (图6)。出生后不久(P0)野生型和Kindlin-1−−/老鼠开始吮吸,积累了牛奶在他们的胃。在出生后的第一个小时照顾Kindlin-1−−/小鼠肠中包含初乳吸收并显示广泛的上皮细胞分离(图6 b;见结肠P0)不浸润免疫细胞(图6 b和C远端结肠)。没有上皮脱离Kindlin-1时发生−−/老鼠和通过剖腹产手术生在激烈的和湿润孵化室长达7小时(图6 b结肠CS)表明机械应力采用粪便IEC分离引起的。然而,炎性浸润分离的上皮细胞和底层之间的清晰可见间质在美联储小鼠出生后12小时(图6 b;见结肠P0.5),进一步增加在第二天(图6 d)。稳定的免疫细胞渗透是伴随着增加促炎细胞因子的表达TNF-α(Tnf)和il - 6(白细胞介素6)和杯状细胞的减少黏蛋白(图6 d和E)。的广泛Kindlin-1 TNF-α和il - 6表达的水平−−/老鼠可能反映了不同严重程度的炎症当时组织准备。
(一)正常形态iec和BM E18.5。回肠和结肠显示)染色法及电镜照片在12000×结肠的放大。盒装扩大显示大英博物馆,艾凡:上皮。箭头指向大英博物馆。(B)结肠IEC (e)超然P0(结肠P0,出生后5 - 6小时左右),成为渗透通过免疫细胞在出生后12小时(结肠P0.5)。在老鼠身上(CS)和通过剖腹产手术生一直得不到支持的7个小时没有上皮细胞分离可以观察到。箭头表示水泡。(C) IEC超然,但没有巨噬细胞(Mac-1)和粒细胞(GR-1)入渗P0 (Mac-1 GR-1绿色;Perlecan (Perl)在红色指示BM)。箭头表示IEC超然。 (D) Immune cell infiltrations in the lumen of the colon and floating epithelial sheets (e) in the colonic lumen at P1. PAS staining shows reduced goblet cell mucins in Kindlin-1−−/结肠上皮细胞。规模的酒吧在A、B和D代表50 10µmµm和C。(E)的中值实时PCR结果整个结肠mRNA在E18.5 (n = 2 /基因型)和P1 TNF-α每个基因型(n = 5)和il - 6的分泌。误差范围。使用Mann-Whitney试验P值确定。
尽管炎症扩展到回肠P2和P3 (图3 b和C)、回肠从未分离的上皮细胞表明Kindlin-1−−/老鼠开发所谓的回流回肠炎引起的大便“洗”回肠结肠[13]。这些分析显示上皮脱离始于P0的远端部分结肠癌和随后展开检查。
Kindlin-1控制整合蛋白的激活
一个重要的问题是如何Kindlin-1不足导致肠道上皮细胞的分离。一个可能的解释可能失去支持中断BM报道KS病人的皮肤[1],[2],[3]。此外,众所周知,BM消化和上皮分离在炎症性肠病(IBD)可以通过触发基质金属蛋白酶的分泌上皮和/或免疫细胞浸润[17]。这种可能性可以排除在外,因为Kindlin-1−−/老鼠在P1与所有主要组件显示连续BM,无论是在地区结肠iec仍附着以及地区iec分离(图7)。有趣的是,Kindlin-1的皮肤−−/老鼠正常BM疣状分布(图S3)。
(A)电子显微图在12000×放大显示,超然的结肠iec从大英博物馆P1。箭头指向大英博物馆。盒装扩大显示大英博物馆,艾凡:上皮。结肠的Cryo-sections P1 Kindlin-1+ / +和Kindlin-1−−/小鼠染色为第四胶原蛋白(胶原IV)、层粘连蛋白- 332 (LN332)和Perlecan。它们的染色显示Kindlin-1正态分布和本地化−−/结肠。比例尺表示10µm。(B)β1整合素染色的P1结肠。箭头表示大英博物馆。比例尺表示10µm。从iec (C)免疫印迹β1整合素。(D)β1和αv整合素流式细胞仪以初级iec概要文件。
另一种解释为IEC超然可以减少整合素的水平,或整合蛋白的功能障碍,类似报道Kindlin-3-deficient血小板[8]和Kindlin-2-deficient原始内胚层[18]。正态分布的β1整合素(图7 b)和可比β1和αv (Itgav)整合蛋白(图7 c和D在表达和数据未显示)排除缺陷和/或易位的质膜整合蛋白。流式细胞术基本与单克隆抗体9 eg7 iec,承认一个activation-associated抗原决定基的β1整合素亚基,显示显著降低绑定(图8)表明Kindlin-1损失减少β1整合素的活化(由内向外信号)。主要从Kindlin-1角质细胞−−/老鼠也显示正常定位(图S10A)和表面的表达β1整合蛋白(图S10B)。有趣的是,9 eg7染色显示减少,虽然不显著,激活β1整合蛋白在这些细胞(图S10C)。
(一)Kindlin-1 iec显示显著降低9 eg7绑定(活跃β1整合素)。9 eg7绑定被减去背景(BG)量化值平均荧光强度(MFI)值,归一化总β1整合素表达每个基因型小鼠(n = 8)。误差标准差。(B)免疫印迹HT-29细胞表达控制核和核针对hKindlin-1 Kindlin-1和Kindlin-2 (siKind1)。GAPDH是用来显示加载。(C)附着力试验控制,Kindlin-1-depleted HT-29细胞基质(n = 5)表示。显示是平均值,标准误差显示错误的意思。胶原IV,胶原IV;FN,纤连蛋白;LN332,层粘连蛋白- 332; PLL, Poly-L lysine. (D) Kindlin-1 pull-down from IEC lysates using GST-tagged cytoplasmic β integrin tails. (E) Direct interaction of Kindlin-1 with β1 integrin cytoplasmic tails. His-tagged Kindlin-1 C-terminus was co-precipitated with GST-tagged β1 integrin cytoplasmic tails, but not with GST alone or an Y800A mutant form of β1 integrin. (F) Quantification of αIIbβ3 integrin activation, as measured by activation specific antibody PAC1 in CHO cells using flow cytometry (n = 9). Shown are mean values, error bars show standard deviations. (G) Pull-down with GST-tagged cytoplasmic β3 integrin tail from CHO cells transiently transfected with the indicated EGFP-constructs. (H) Western blot of CHO cells 24 hours after transfection with the indicated siRNAs. (siSCR: scrambled; siKind2_1 and siKind2_2: Kindlin-2 specific siRNAs) (I) Quantification of αIIbβ3 integrin activation in CHO cells transfected with the indicated cDNA constructs and/or siRNAs (n = 8). Shown are mean values, error bars show standard deviations.
因为很难文化和维护主要小鼠iec,我们耗尽Kindlin-1人类结肠癌细胞系(HT-29)使用RNAi (HT-29siKind1;图8 b)表明integrin-mediated细胞粘附和剪切应力诱导分离也摄动的结肠癌细胞株。HT-29siKind1细胞无法坚持纤连蛋白(FN);Fn1)和显示强烈降低粘附层粘连蛋白- 332和胶原IV (图8 c),很容易脱离FN在暴露于低(0,5达因/厘米2)以及高剪切应力(4达因/厘米2;图S11)。剩下的粘附层粘连蛋白- 332和IV型胶原蛋白很可能由其他层粘连,Collagen-binding结肠上皮细胞受体如α6β4整合蛋白(Itga6 Itgb4)和discoidin域受体[19],[20],这都是已知函数独立层粘连蛋白和胶原蛋白绑定β1整合蛋白[21]。
这些发现表明,(i) Kindlin-1损害损失整合素激活,妥协结肠上皮细胞的粘附,(2)Kindlin-2不能拯救Kindlin-1损失在结肠上皮细胞,和(3)剩余IEC粘附层粘连蛋白和胶原蛋白由剪切力施加例如暂停,粪便。
据报道,Kindlin-1 associates的膜近端NPxY主题β1和β3整合蛋白[6]。然而,这种观察是观察Kindlin-2和3相比,这两种绑定β1膜远端NxxY图案和β3整合蛋白触发他们的激活[8],[18],[22]。探索机制Kindlin-1归纳整合素激活,我们进行下拉的重组实验GST-tagged细胞质β整合素的尾巴在IEC和角化细胞溶解产物。与胞质域相关联的结果证实,Kindlin-1β1和β3 (图8 d)。因为替换酪氨酸残基的近端NPxY图案与丙氨酸(β1Y788A;β3Y747A)允许Kindlin-1绑定,而酪氨酸在远端NxxY丙氨酸替换主题β1和β3整合素尾巴(β1Y800A;β3Y759A)废除Kindlin-1绑定,我们得出这样的结论:在所有Kindlins绑定和功能属性是守恒的。这是进一步证实了直接绑定化验,这表明,重组His-tagged c端丰贸领域Kindlin-1 (aa 471 - 677)包含phosphotyrosine绑定(PTB)的主题绑定GST-taggedβ1但不是Y800A突变β1整合蛋白胞质尾(图8 e)。
是蛋白能够引入整合蛋白的激活,并很长一段时间被认为是足够的执行这一任务。发现了这个重要的功能蛋白overexpressing蛋白或其丰贸领域在CHO细胞稳定表达人类血小板整合素αIIbβ3 (Itga2b Itgb3)[23],改变了活性构象αIIbβ3整合素高亲和力状态,证明了增加绑定的PAC1抗体识别激活相关抗原表位在αIIbβ3整合素(图8 f)。与蛋白相比,超表达Kindlin-1未能触发激活αIIbβ3整合素在这些细胞(图8 f)。有趣的是,作为Kindlin-2描述[18],[22],超表达的蛋白丰贸领域和Kindlin-1翻了一番PAC1绑定与细胞只表达蛋白相比丰贸域(图8 f)。蛋白之间的合作和Kindlin-1取决于Kindlin-1和β整合素尾交互,肺结核突变的Kindlin-1 (QW611/612AA)未能结合β整合素的尾巴(图8 g)和蛋白的协同效应是失去了(图8 f)。这些发现表明,Kindlin-1是不够的整合素激活,但需要诱导Talin-mediated整合素激活。这个概念被证实与CHO细胞,内生Kindlin-2水平被RNAi耗尽(图8 h)。此外,overexpressing蛋白未能诱导这些细胞整合素激活,但表达Kindlin-1恢复这个函数(图8我)。
这些发现显示(i), Kindlin-1和2需要对整合素激活蛋白,(ii)这对整合素激活蛋白需要Kindlins,和(3)体外Kindlin-1和Kindlin-2冗余功能作为Kindlin-1和2都是招募FAs对整合素胞质尾产生类似的功能。然而,体内情况不是这样Kindlin-2是招募信息联系人在iec和显然不补偿Kindlin-1损失。
讨论
在目前的研究中我们显示一个空Fermt1基因的突变引起皮肤萎缩和急性暴发性,新生儿肠上皮功能障碍。我们表明,肠上皮屏障的主要缺陷是一个损失,其次会导致炎症细胞浸润和严重的结肠炎的发展。此外,我们表明,肠上皮屏障的损失是严重的肠道上皮细胞粘附缺陷引起的底层BM,进而整合蛋白无法成为引起的激活和BM绑定组件。除了可能有缺陷的整合素激活和上皮超然,Kindlin-1施加其他未知的函数,可以有助于Kindlin-1的表型−−/老鼠。
Kindler综合征(KS)被认为是主要的皮肤病疾病,特点是表皮萎缩,其次是表皮起泡、色素缺陷和皮肤癌。复杂的疾病综合症很难诊断在疾病发作是由于相似之处与其他形式的皮肤起泡疾病(也称为表皮松解大疱;EB)是由角质和BM基因突变引起的[24]。最近的病例报告显示,KS可能只涉及器官比皮肤,几个KS患者还患有肠道症状。一个病人严重的KS严重产后加州大学开发的。有趣的是,这个病人被诊断为null FERMT1基因的突变后发展伤害皮肤起泡[10]。符合这严重的加州大学KS的例子,我们发现零Fermt1基因的突变老鼠也会导致一个戏剧性的和致命的肠上皮功能障碍出生后不久。杀伤力KS患者通常是没有看到,这最有可能是由于出生时小鼠小肠的不成熟,使其更容易受到伤害[25]。
Kindlin-1-deficient小鼠肠上皮功能障碍的特点是平面和肤浅的结肠溃疡,从一个完整的上皮细胞分离。缺陷开始沿着整个结肠直肠和扩展最终导致严重的pancolitis。溃疡和局限于结肠上皮细胞脱落,虽然回肠次要炎症的迹象在疾病的后期。体外研究主要从Kindlin-1 iec−−/老鼠和Kindlin-1-depleted HT-29细胞表明整合蛋白的细胞分离是由于激活受损导致弱iec底层BM的附着力。从力学上看Kindlin-1需要直接绑定β1和β3整合素胞质域促进两整合素亚科的激活。这些生化和功能性质是守恒的三国Kindlin家族的成员。Kindlin-2-mediated绑定和激活β1和β3整合蛋白严重支持附件的内胚层和外胚层细胞底层BM peri-implantation胚胎[18]起核心作用,而Kindlin-3血小板激活的整合蛋白[8]。这份报告的调查结果也表明,蛋白功能至关重要的是取决于Kindlin-1的活动。Kindlin-2枯竭(CHO细胞表达的只有Kindlin)完全阻止过表达蛋白激活整合蛋白。的表达,要么Kindlin Kindlin-2-depleted CHO细胞,然而,复苏的能力蛋白触发整合蛋白的激活。这将是重要的未来研究Kindlins成为激活为什么Kindlin-2无法接管的功能Kindlin-1 Kindler综合症和Kindlin-1-deficient老鼠。
结论,观察表型是由IEC超然而不是由一个主Kindlin-1缺陷小鼠炎症缺陷是基于这样的观察:上皮细胞分离总是发生在免疫细胞的渗透。我们会因此认为,iec的超然,就像一个肠道伤口,其次触发一个强有力的伤口愈合反应导致免疫细胞浸润和释放的细胞因子风暴。符合这一假说,上皮细胞分离和诱导炎症反应可以完全避免当Kindlin-1崽通过剖腹产手术,随后在湿、温度控制孵化室。应用机械应力的初乳可能诱导的超然弱粘在结肠上皮细胞。绝大多数的小鼠模型开发结肠炎迄今为止报道异常的免疫系统[12],[26]。这一事实以及几个易感性位点的识别在人类患者[14],[15]导致免疫系统缺陷的结论是加州大学发展的核心重要性。严重粘连iec的缺陷导致了一个巨大的伤口反应可能代表另一个加州大学发展的病因。
尽管粘连严重损害Kindlin-1-deficient结肠的老鼠,他们生来就没有皮肤水泡。这是符合KS的病人,他也没有皮肤水泡甚至当他们交付的阴道路线但水泡后天外伤易地点的发展。有趣的是,Kindlin-1缺陷小鼠并没有显示有缺陷的粘附基底角质细胞的大英博物馆即使机械应力的应用。不同粘附在皮肤缺陷的严重程度和结肠的功能性质可以反映不同的整合蛋白表达的两个器官,肠道上皮细胞的缺乏古典半桥粒[27]。
另一个明显的皮肤缺损Kindlin-1-deficient老鼠以及KS病人皮肤萎缩,这似乎是由于减少interfollicular扩散角化细胞。这一发现提出了几个问题;首先,关于机制由Kindlin-1细胞增殖的分子控制。减少的机制尚不清楚,可能造成的相声整合素和生长因子信号之间的关系。其次,它也不清楚分子播放器支持扩散是引起癌症在稍后的阶段。可能Kindlins在不同细胞箱内的本地化,即cell-matrix粘附网站,信息粘附在核网站和在某些情况下,装备他们不同的功能,你就可以在不同的时间点。
Kindlin-1和2中的表皮细胞以及结肠上皮细胞。有趣的是,我们发现Kindlin-2不能补偿Kindlin-1函数体内,无论是在结肠内还是在皮肤上。通常自Kindlin-2本地化信息粘连细胞类型和不把整合素突变体肠道和表皮上皮细胞粘附网站,这是无法弥补的损失Kindlin-1,尽管Kindlins能够执行相同的任务整合素的反面体外和体外[27]。因此,治疗策略路由的一些Kindlin-2从信息整合素粘附网站可能代表一个有前途的方法来防止溃疡KS UC患者严重。
材料和方法
鼠标菌株
的Kindlin-1−−/老鼠通过替换ATG-containing外显子2新霉素抗性磁带(详细信息定位克隆的构建可以获得Faessler@biochem.mpg.de)。构建electroporated为R1胚胎干细胞(ES)细胞(15)通过和同源重组与南部的屁股了。基因组DNA与EcoRV消化,涂抹,然后用5′杂化探针或与BglII消化,玷污和杂化3′探测器(图1一个)。有针对性的ES细胞被注入囊胚和转移到培育的老鼠。老鼠被安置在一个特殊的病原体免费鼠标设备。所有动物实验都得到地方当局的批准。
组织学、免疫组织化学和Immunfluorescence染色
)染色肠段要么是PFA固定和嵌入在石蜡,或冻结在cryo-matrix干冰(热)。Immunhistochemistry石蜡包埋部分如前所述[5]。部分8µm厚度和染色后常规协议做好准备。低温部分固定在4% PFA / PBS除了Kindlin-1染色部分被固定在−1∶1甲醇/丙酮20°C。随后组织部分与3% BSA / PBS被封锁,孵化与主要的抗体在湿度室在晚上4°C,与荧光标记二次抗体1 h RT Elvanol最后安装。照片是用徕卡DMIRE2共焦显微镜100×63×1.4 NA石油目标。
GST-Pull波动
重组GST-β1、β1Y788Aβ1Y800A、β3β3Y747A,β3Y759A细胞质尾巴表达和纯化大肠杆菌在非变性条件下。与500年5µg重组尾巴孵化µg IEC溶菌产物(50毫米三pH值7.4,150毫米氯化钠,1毫米EDTA, 1% triton - x - 100)。GST-constructs沉淀了谷胱甘肽珠子(Novagen)。随后探讨了西方的屁股Kindlin-1和销售税。
抗体
一个多克隆肽抗体Kindlin-1长大对肽YFKNKELEQGEPIEK如前所述[5]。
第二抗体是在给定的浓度表示用于免疫印迹(W),免疫沉淀反应(IP), immunfluorescence(如果),immunhistochemistry(包含IHC): Kindlin-1 (W: 1∶5000,如果细胞:1∶200,如果组织:1∶1000),Kindlin-2 (W: 1∶1000,如果细胞1∶200,如果组织:1∶200),钙粘蛋白(背景;病菌,W: 1∶5000), Migfilin (W: 1∶5000,如果细胞1∶100,如果组织:1∶100),GAPDH (Chemicon;W: 1∶10000), phalloidin Tritc(σ;如果细胞:1∶800,如果组织:1∶800),Mac-1 (EuroBioscience;如果组织:1∶100),GR-1 (Ly6g;eBioscience;如果组织:1∶100),Thy1.2 (PharMingen;如果组织:1∶100),销售税(Novagen;W: 1∶10000),他(CellSignaling;W: 1∶1000), PAC1(双相障碍; FACS: 1∶100), α6 integrin (Itga6; PharMingen; IF tissue: 1∶100), CollagenIV (a gift from Dr. Rupert Timpl; IF tissue: 1∶100), Laminin-332 (a gift from Dr. Monique Aumeilley; IF tissue: 1∶200), Perlecan (Hspq2; a gift from Dr. Rupert Timpl; IF tissue: 1∶100), β1 integrin (Chemicon; WB: 1∶3000, IF tissue: 1∶600), 9EG7 (PharMingen; FACS: 1∶100), EGFP (Abcam; WB: 1∶10000), β1 integrin (PharMingen; FACS: 1∶200), αv integrin (PharMingen; FACS: 1∶200). Keratin10 (Krt10; Covance; IHC: 1∶600 ), Keratin14 (Krt14; Covance; IHC: 1∶600 ), Loricrin (Lor; Covance; IHC: 1∶500 ) Ki67 (Dianova; IHC: 1∶50), cCaspase3 (CellSignaling, IHC: 1∶100).
实时聚合酶链反应
提取总RNA从全冒号与Midi PureLink微RNA提取工具包(英杰公司)按照生产厂家的说明书。互补脱氧核糖核酸制备使用iScript互补脱氧核糖核酸合成装备(Biorad)。实时PCR使用Sybr绿色准备混合(Biorad)中执行一个iCycler (Biorad)。每个样本以一式三份和价值观是GAPDH规范化。引物后使用;TNFα前轮驱动:AAAATTCGAGTGACAAGCCTGTAGCTNFα转速:GTGGGTGAGGAGCACGTAG。前轮驱动:il - 6CTATACCACTTCACAAGTCGGAGGil - 6转速:TGCACAACTCTTTTCTCATTTCC。rt - pcr Kindlin-1和GAPDH如前所述[5]。
iec的隔离
新生小鼠小肠切除和刷新1毫升PBS。小肠是纵向切开,冲洗PBS和孵化了40分钟在IEC隔离缓冲区(130毫米氯化钠,EDTA 10毫米,10毫米消息灵通的pH值7.4,10% FCS和1毫米德勤)转子在37°C。上皮摆脱,颗粒状,在2000转离心5分钟。世行分析细胞与PBS和随后的细胞溶解洗一次。流式细胞仪细胞被洗一次PBS和使胰蛋白酶化2×胰蛋白酶(GIBCO) 10分钟37°C。胰蛋白酶和含有10% fcs DMEM灭活。单个细胞悬液制备细胞通过细胞通过过滤器(BD)。
孤立的角化细胞
主要角质细胞分离得到P3老鼠如前所述[28]。细胞培养的混合物杆菌(凝聚力)和10µg /毫升FN(表达载体)涂塑料盘子角质细胞生长介质中含8%螯合FCS(表达载体)和45µM Ca2 +。
流式细胞术
IEC和角化细胞在三羟甲基氨基甲烷缓冲液沾9 eg7抗体盐水[29]。为PAC1绑定化验CHO细胞被染色了40分钟在RT如前所述[23]。细胞的生存能力的不含propidium iodide-positive细胞。CHO细胞转染EGFP-tagged构造被另外的高度EGFP-positive细胞。用流式细胞仪进行测量石中剑(BD)和数据评价是与FlowJo软件完成的。
构造
前所述EGFP-Kindlin-1表达质粒[5]。互补编码His-Kindin-1糖基(aa 471 - 677)放大了PCR和克隆到pqe - 70矢量(试剂盒)。Kindlin-1 PTB突变QW611/612AA工具引入了定点突变技术(Stratagene)后,制造商的建议。所有EGFP构造被克隆到pEGFP-C1向量(Clontech)和随后测序。EGFP-Talin头先前描述[8]。
细胞培养
曹和HT-29细胞在DMEM含有青霉素、链霉素、非必需氨基酸和分别为10%或20% FCS (GIBCO)。每个DNA的细胞转染2µg在六孔板使用Lipofectamine 2000按照制造商的指示(表达载体)。
RNAi
从HT-29细胞耗尽Kindlin-1既定的,对应的shDNA cDNA序列GTAAGTCCTGGTTTATACAhKindlin-1和控制cDNA序列AGCAGTGCATGTATGCTTC被克隆到pSuperRetro向量(OligoEngine)。病毒颗粒是准备如前所述[30]。HT-29细胞被感染,随后选择2 mg / l嘌呤霉素。瞬态击倒的Kindlin-2 siRNAs CHO细胞通过转染;Kind2_1:GCCUCAAGCUCUUCUUGAUdTdT和Kind2_2:CUCUGGACGGGAUAAGGAUdTdT小干扰rna(购自σ),控制使用Lipofectamine 2000(表达载体),按照生产厂家的说明书。转染后细胞收获和化验24小时。
剪切应力分析
幻灯片1µm直径(ibidi BioDiagnostics)涂在一夜之间有5µg /毫升1% BSA FN然后阻塞。100.000细胞被播种到幻灯片和细胞培养孵化器孵化为2.5小时。随后细胞接触到越来越多的剪切力在两分钟间隔(如示图S11每秒钟)和被拍了照片。
支持信息
图S1。
正常的甘油三酸酯和P3 Kindlin-1血液中的葡萄糖水平−−/老鼠。甘油三酸酯(n = 7 /基因型)和葡萄糖(n = 5 /基因型)在P3血液从总水平。的差异在统计上是无关紧要的。显示误差平均值,标准差。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1000289.s001
气管无名动脉瘘管的(0.5 MB)
图S2。
在Kindlin-1正常肾脏形态学−−/老鼠。10 (A) Coomassie彩色凝胶µl尿液从P2和P3控制和Kindlin-1−−/老鼠。(B)总蛋白在尿液从Kindlin-1的量化+ / +,Kindlin-1+ /−和Kindlin-1−−/老鼠在P1 (n = 14/7/6)和P3 (n = 20/20/9)。误差标准偏差。P3 Kindlin-1 (C))染色+ / +和Kindlin-1−−/肾脏。Kindlin-1−−/肾脏没有显示肾小球和收集管形态学改变。比例尺µm代表200人。放大显示肾小球(A1、A3)和收集管道(A2, A4)。规模50µm酒吧代表。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1000289.s002
气管无名动脉瘘管的(8.6 MB)
图S3。
正常的BM在P3 Kindlin-1组成和沉积−−/backskin。P3 backskin野生型和Kindlin-1−−/老鼠是彩色BM组件层粘连蛋白- 332 (LN332;第四红色),胶原蛋白(胶原IV;红色)和纤连蛋白(FN);红色)和co-stainedα6或β4整合素标记(绿色)基底角质细胞的基底的网站。染色显示没有BM沉积和组成的差异或α6或β4整合素定位控制和Kindlin-1之间−−/同窝出生的。比例尺显示30µm。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1000289.s003
气管无名动脉瘘管的(9.8 MB)
图S4。
正常皮肤分化。P3 backskin控制,Kindlin-1−−/老鼠是表皮分化染色标记Keratin14 Keratin10和Loricrin(红色)和co-stainedα6整合素(绿色)基底角质细胞。染色显示Kindlin-1的分化模式没有区别−−/角化细胞。10µm比例尺表示。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1000289.s004
气管无名动脉瘘管的(8.4 MB)
图S5。
皮肤的正常发展。(一)正常半乳糖苷染色E17 Kindlin-1−−/在开发过程中胚胎指示正常屏障的形成。比例尺表示5毫米。(B))从控制和Kindlin-1染色的背部皮肤−−/不同年龄的同胞。在Kindlin-1−−/小鼠表皮(e)厚度E18.5 P0是正常的但清晰的表皮萎缩在P1。50µm比例尺表示。(d):真皮。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1000289.s005
气管无名动脉瘘管的(8.5 MB)
图S6。
改变Kindlin-1粘附和传播−−/角化细胞。(一)附着力试验控制,Kindlin-1−−/角化细胞LN332,层粘连蛋白- 332;胶原IV,胶原IV;FN,纤连蛋白;锁相环,Poly-L赖氨酸(n = 3)。显示是平均值,误差显示平均数标准误差。5日(B)细胞面积测量在传播µg /毫升纤连蛋白在指定的跨度为使用MetaMorph软件(n = 30细胞基因型从3独立实验)。显示是平均值,误差显示标准差(* * * p < 0.0001)。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1000289.s006
气管无名动脉瘘管的(0.8 MB)
图S7。
在Kindlin-1口腔和食管粘膜−−/老鼠。口腔黏膜的组织学和P3 Kindlin-1的食管+ / +和Kindlin-1−−/老鼠没有揭示异常形态。规模50µm酒吧代表。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1000289.s007
气管无名动脉瘘管的(8.1 MB)
图S8。
进步的上皮Kindlin-1损失−−/冒号。(A)量化程度的完整的结肠上皮在P1和P3每个基因型和年龄(n = 3)。误差范围。(B)的概述)幅P3控制和Kindlin-1−−/结肠。的Kindlin-1−−/结肠显示完整的结肠上皮缺失(黑色箭头),而在盲肠上皮仍然存在(白色箭头)。规模500µm酒吧演出。(C)的放大的盒装地区B所示。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1000289.s008
气管无名动脉瘘管的(7.7 MB)
图S9。
正常的IEC扩散但超然诱导细胞凋亡。从野生型和Kindlin-1 P1冒号−−/老鼠DAB染色为裂解Caspase-3确定细胞凋亡和Ki67染色显示增殖iec。细胞凋亡发生在Kindlin-1分离的上皮细胞−−/老鼠。在领域仍然坚持上皮增殖的数量iec Kindlin-1与野生型相似−−/老鼠。50µm比例尺表示。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1000289.s009
气管无名动脉瘘管的(8.7 MB)
图S10。
在Kindlin-1β1整合素激活−−/角化细胞。(一)免疫荧光染色β1整合素(绿色)和层粘连蛋白- 332 (LN332;P3 backskin红色)显示正常的本地化β1 Kindlin-1整合素−−/backskin。(B)流式细胞仪量化的β1整合素的表达新鲜隔离控制和Kindlin-1−−/角化细胞在P2一成不变的节目β1基底角质细胞整合素的表达。误差线显示范围(n = 4) (C) 9 eg7流式细胞仪量化这些角化细胞没有显著减少β1整合素激活。误差线显示范围(n = 4)。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1000289.s010
气管无名动脉瘘管的(8.0 MB)
图S11。
剪切诱导Kindlin-1 HT-29耗尽细胞的分离。控制和Kindlin-1耗尽HT-29 (siKind1)细胞被镀Fibronectin-coated流室的幻灯片和暴露增加剪切力,显示在图。控制细胞不分离矩阵而Kindlin-1耗尽细胞无法抵抗低或高剪切力(比较巷1(0达因/厘米2)2巷(0、5达因/厘米2)。50µm比例尺表示。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1000289.s011
气管无名动脉瘘管的(9.0 MB)
确认
我们想谢谢威廉•布洛赫电子显微镜,莱因哈特血液参数测量,克鲁格Klaus-Peter詹森il - 6和TNFα底漆,茱莉亚Schlehe, Sara Wickstrom梅赛德斯Costell,拉尔夫Boettcher阿尼卡。兰格Ambra波齐,罗伊Zent批判阅读手稿和西蒙·巴赫和梅勒妮里德为优秀的技术援助。
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