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研究文章

通过脂肪酸合成酶p63促进细胞存活

  • Venkata Sabbisetti,

    从属关系布莱根妇女医院病理学系,丹娜-法伯癌症研究所,哈佛医学院波士顿,马萨诸塞州,美利坚合众国,医学肿瘤学部门,丹娜-法伯癌症研究所,哈佛医学院波士顿,美国马萨诸塞州

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  • 阿里安娜Di那不勒斯,

    联系布莱根妇女医院病理学系,丹娜-法伯癌症研究所,哈佛医学院波士顿,美国马萨诸塞州

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  • Apryle斯利,

    从属关系布莱根妇女医院病理学系,丹娜-法伯癌症研究所,哈佛医学院波士顿,马萨诸塞州,美利坚合众国,医学肿瘤学部门,丹娜-法伯癌症研究所,哈佛医学院波士顿,美国马萨诸塞州

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  • 安吉拉·m·阿马托

    联系布莱根妇女医院病理学系,丹娜-法伯癌症研究所,哈佛医学院波士顿,美国马萨诸塞州

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  • 以斯帖奥雷根,

    联系圣詹姆斯医院,都柏林,爱尔兰

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  • Musie Ghebremichael,

    联系生物统计学和计算生物学,丹娜-法伯癌症研究所,哈佛医学院波士顿,美国马萨诸塞州

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  • 马西莫Loda,

    从属关系布莱根妇女医院病理学系,丹娜-法伯癌症研究所,哈佛医学院波士顿,马萨诸塞州,美利坚合众国,医学肿瘤学部门,丹娜-法伯癌症研究所,哈佛医学院波士顿,美国马萨诸塞州

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  • 萨拜娜Signoretti

    ssignoretti@partners.org

    从属关系布莱根妇女医院病理学系,丹娜-法伯癌症研究所,哈佛医学院波士顿,马萨诸塞州,美利坚合众国,医学肿瘤学部门,丹娜-法伯癌症研究所,哈佛医学院波士顿,美国马萨诸塞州

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表达关心

出版后,也提出了一些免疫印迹结果报道在这篇文章(1]。

  • 图4中的β-actin面板iPrEC-Tp63细胞出现类似于图5 dβ-actin面板SCC9-Tp63,不同的长宽比。最初的墨迹不再支持这些数据是可用的,所以作者无法解决问题这些控制的屁股。
  • 就好像同样β-actin板提出了在图2 d和S1无花果SCC9细胞,尽管p63数据和实验条件是不同的。作者提供了可用的墨迹支持FASN, p-Akt,β-actin结果印地无花果所示(S1文件),该澄清错误β-actin污点是包括发表这个实验的图。最初的印迹基础图2 d和p63污点在印地无花果是不再可用。
  • p63和β-actin数据多次被报道的文章:
    1. ○。p63在图1,图3 b,图4为SCC9细胞
    2. ○。β-actin面板在图1,图3 b SCC9细胞
    3. ○。p63β-actin SCC9-Tp63面板和iPREC-Tp63细胞系在图3 b和图4所示
    作者评论说他们相信西方墨迹无花果1中的一种,3 b和4得到相同的实验,通过分析蛋白质,p63数据在本文提出了多次证明FASN变化,p-Akt和魔法石第六章水平观察细胞中也记录了击倒p63表达式。原SCC9墨迹p63在无花果1、3 b和4和β-actin无花果1和3 b提供了S2文件。底层的屁股不再用于SCC9β-actin污点图4所示,对于其他SCC9实验中显示这些数据,或者为iPREC-Tp63 SCC9-Tp63实验。
  • 同一p63数据介绍了无花果SCC9细胞株3 b和4,尽管β-actin数据是不同的。作者评论的β-actin污点显示SCC9无花果1和3 b细胞也适用于图4中的p63实验。原始的屁股没有澄清β-actin污点图4所示是否匹配的加载控制一种蛋白激酶,p-Akt, p-S6墨迹这个图所示。
  • 作者是无法确认是否β-actin印迹本文所示的数据匹配获得使用相同的蛋白质样品加载控制在相应的实验板。

的《公共科学图书馆•综合》编辑发布通知读者关注的这个表达式的未解决的问题与本文中的控制数据报告和主要数据支持的不可用的大多数免疫印迹结果。

支持信息

S1文件。原始图像污点的β-actin、FASN p-Akt面板在S1无花果。

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0219869.s001

(PDF)

S2文件。原始图像污点的p63和相应β-actin实验显示在无花果SCC9细胞1,3 b和4。

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0219869.s002

(PDF)

2019年7月11日:《公共科学图书馆•综合》编辑(2019)表达了担忧:p63通过脂肪酸合成酶促进细胞的生存。《公共科学图书馆•综合》14 (7):e0219869。https://doi.org/10.1371/journal.pone.0219869视图的表达关心

文摘

有越来越多的证据表明,p63特别是ΔNp63,发展和肿瘤发生中扮演着中心角色通过促进上皮细胞的生存。然而,很少有研究涉及的分子机制等重要的功能发挥。脂肪酸合成酶(FASN),一个关键酶,这种酶合成的长链脂肪酸和参与胚胎发生和癌症,最近提出的直接目标p53家庭成员,包括p63和p73。在这里,我们表明,击倒总或ΔN-specific p63在鳞状细胞癌亚型(SCC9)或不灭的前列腺上皮细胞(iPrEC)引起的细胞生存能力下降通过诱导细胞凋亡而不影响细胞周期。p63沉默显著降低表达式和FASN的活动。重要的是,稳定的FASN或超表达myristoylated AKT (myr-AKT)能够部分救援p63沉默引起的细胞死亡的细胞。FASN诱导一种蛋白激酶磷酸化和显著减少细胞生存能力是观察当FASN-overexpressing SCC9细胞治疗AKT抑制剂p63击倒后,表明AKT在FASN-mediated生存中起着重要作用。AKT激活没有造成任何改变FASN蛋白质含量但诱导活动,表明救援p63-silenced细胞表达myr-AKT细胞的凋亡记录可能被FASN介导。最后,我们表明,p63和FASN表达呈正相关临床鳞状细胞癌样本以及在发展中前列腺癌。综上所述,我们的研究结果表明,FASN功能相关的目标p63和需要协调其pro-survival效果。

引用:Sabbisetti V, Di那不勒斯,斯利,阿马托,奥雷根E, Ghebremichael M, et al .(2009)通过脂肪酸合成酶p63促进细胞的生存。《公共科学图书馆•综合》4 (6):e5877。https://doi.org/10.1371/journal.pone.0005877

编辑器:米哈伊尔•诉Blagosklonny罗斯威尔帕克癌症研究所,美利坚合众国

收到:2009年2月3日;接受:2009年5月5日;发表:2009年6月11日

版权:©2009 Sabbisetti et al。这是一个开放的文章下分布式知识共享归属许可条款,允许无限制的使用、分配、和繁殖在任何媒介,被认为提供了原作者和来源。

资助:这项工作是支持由国家卫生研究院/趋势(一下R21 DK72152)、国防部(PC050266),哈佛干细胞研究所和一个奖项从史Dermopatico戴尔'Immacolata,意大利,党卫军国立卫生研究院的资助(RO1CA131945)马丁A.D.N.是收件人的奖学金奖阿喀琉斯Lattuca基金会,意大利。支持者没有参与研究设计、数据收集、分析、发布决定,或准备手稿。

利益冲突:作者宣称没有利益冲突存在。

介绍

p63 (TP73L / TP63)的同系物p53肿瘤抑制基因p53家族的,代表了最古老的成员[1]- - - - - -[3]。因为有两个启动子,p63编码两个主要类别的蛋白质:那些包含transactivating (TA)域同源的出现在p53(例如TAp63),和那些没有助教域(例如ΔNp63)[1],[2]。此外,交替剪接在carboxy-terminal (c端)产生至少三个p63变体(α、β和γ)在每个类。

尽管p53和p63份额高序列和结构相似之处,他们之间有显著的不同功能和表达谱。在生理条件下,p63主要是受限制的表达基底细胞间的分层和腺上皮细胞,ΔNp63α是主要的同种型[1],[4]- - - - - -[8]。分析p63-deficient老鼠毫不含糊地表明,p63起着非常重要的作用在上皮器官/组织的发展,包括表皮和其他鳞状上皮细胞,唾液,泪腺,乳腺和前列腺腺体和膀胱尿道上皮[4],[5],[9],[10]。此外,有证据表明,p63是必不可少的干细胞的增殖潜力胸腺上皮细胞和表皮[11]。与p53、p63是很少突变在人类肿瘤,其作用在癌症似乎是复杂的,需要进一步的澄清[12]- - - - - -[16]。目前的数据表明,助教和ΔN亚型可能有相反的影响和支持ΔNp63在促进肿瘤发生的作用。

ΔNp63多达80%的中高度表达的主要头颈部鳞状细胞癌(HNSCCs),以及其他恶性肿瘤鳞状上皮细胞来源,包括肺癌和食管癌[15],[17]- - - - - -[20]。其过度频繁与基因组的扩增位点3问港口p63基因[15],[17]。此外,它提出了异常p63表达可能是一个早期事件的发病机理HNSCC, p63表达式的扩展从正常的基底细胞变成suprabasal水平观察黏膜标本显示发育不良[20]。

的异位表达ΔNp63亚型抑制p53 transactivation的最初报道,导致早期猜测过度ΔNp63可能只是灭活p53的机制[1],[21]。然而,p63可以诱导细胞凋亡抑制通过上调pro-apoptotic bcl - 2基因家族彪马和病因通过一个机制,独立于p53状态的细胞,但需要p73[22]。最重要的是,随后的研究也提供了证据表明ΔNp63函数通过直接激活特定的靶基因的转录[23]- - - - - -[29]。例如,它已被证明,p63对抗细胞凋亡调节细胞粘附基底细胞的乳腺和其他复层上皮组织[30]。然而,分子机制调解p63函数仍在发展和肿瘤发生充分的特点。

脂肪酸合成酶(FASN),多功能酶至关重要的内源性合成前体乙酰辅酶a和malonyl-CoA长链脂肪酸[31],最近ΔNp63α的直接目标[32]。鉴于越来越多的证据表明,FASN细胞生存是至关重要的,可能作为代谢致癌基因,我们的功能相关性研究FASN p63监管。我们发现p63活动明显的pro-survival活动由FASN转换和永生的上皮细胞。

材料和方法

道德声明

所有涉及人体受试者的研究一直在进行anonimized,丢弃组织收集病人的过程中他们的治疗。这项研究已经认可了DF /肝癌机构审查委员会。所有动物工作已经按照相关国家和国际准则进行。

细胞系和化学品

人类的鳞状细胞癌细胞系SCC9保持在DMEM培养基(英杰公司公司,卡尔斯巴德,CA)补充丙酮酸钠0.5毫米,1.2 g / L碳酸氢钠,400 ng / ml氢化可的松,和10%的边后卫。SCC9-Tp63和SCC9-Dp63诱导克隆,建立如下所述,维持与0.5毫米DMEM培养基补充丙酮酸钠,1.2 g / L碳酸氢钠,400 ng / ml氢化可的松,10%四环素免费的边后卫(BD生物科学,圣何塞,CA), 10µg /毫升杀稻瘟菌素(Sigma-Aldrich,圣路易斯,密苏里州),和300年µg /毫升zeocin(英杰公司公司,卡尔斯巴德,CA)。不灭的嗜碱性前列腺癌上皮细胞(iPrEC)(后来博士的礼物哈恩,丹娜-法伯癌症研究所,波士顿,MA)在定义媒介传播(PrEGM) (Lonza Allendale,新泽西),推荐[33]。FAS抑制剂C75和PI3K抑制剂LY 294002人从开曼群岛购买化学品,安阿伯市MI。具体AKT抑制剂InSolution AKT抑制剂八世,Isozyme-selective从EMD购买化学品,Inc . Gibbstown,新泽西。

核转染

Tp63核(CGTATTCCACTGAACTGAA),针对所有p63亚型,Dp63核(GGACAGCAGCATTGATCAA),针对ΔNp63亚型和争夺(CAGTCGCGTTTGCGACTGG)非特异性核,从Dharmacon购买(Dharmacon研究公司,拉斐特有限公司)。在转染前的一天,SCC9细胞被播种和孵化与0.5毫米DMEM补充丙酮酸钠,1.2 g / L碳酸氢钠,400 ng / ml氢化可的松和10%的边后卫没有抗生素。第二天,在40% confluency转染细胞p63核或争夺siRNA使用oligofectamine根据制造商的指示。100毫米组织培养皿,2毫升Opti-MEM1降低血清中含有40 nmol siRNA和40µl Oligofectamine(英杰公司公司,卡尔斯巴德,CA)被添加到每个盘子里。研究涉及小板按比例缩小根据制造商的建议。细胞收获和加工进一步根据实验的类型。

代p63 shRNA诱导细胞系

的pBLOCK-iT诱导RNAi慢病毒表达系统(英杰公司公司,卡尔斯巴德,CA)是用于建立四环素诱导细胞表达shRNA p63。首先,SCC9和iPrEC细胞感染pLenti6 / TR慢病毒表达构建根据制造商的协议。稳定转染子选择通过培养杀稻瘟菌素(10µg /毫升SCC9和3µg iPrEC /毫升)(Sigma-Aldrich、圣路易斯、钼)。春节最高的克隆抑制因子表达式(SCC9 TR iPrEC TR)被选为进一步转染表达与结构成分针对全部或ΔN-specific p63亚型。为此,Tp63和Dp63序列(见上图)插入在囚禁/ H1 /输入向量。囚禁/ H1 / TO-Tp63和郁积的/ H1 / TO-Dp63构造被重组pLenti4 /阻止DEST网关向量生成pLenti4 / BLOCK-IT-Dp63和pLenti4 / BLOCK-IT-Tp63 shRNA表达式构造根据制造商的协议。SCC9 TR和iPrEC TR克隆孵化pLenti4 / BLOCK-IT-Dp63或pLenti4 / BLOCK-IT-Tp63 shRNA病毒上清液和稳定转染子筛选与Zeocin(300µg /毫升iPrEC SCC9和50µg /毫升)(英杰公司公司,卡尔斯巴德,CA)。所选blasiticidin zeocin耐药细胞筛选的击倒p63在四环素(2µg /毫升)。克隆与高效p63选择和任命SCC9-Tp63是可拆卸的,SCC9-DP63, iPrEC-Tp63, iPrEC-Dp63根据细胞类型和成分表达式。

细胞生存能力分析

细胞生存能力评估使用3 - (4 5-dimethylthiazol-2-yl) 2、5 diphenyltetrazodium溴化(MTT)测定。MTT(5毫克/毫升)被添加到每个好最终浓度为0.5毫克/毫升和盘子孵化3 h在37°C。1毫升的甲瓒产品是随着二甲亚砜(DMSO)和吸光度测量使用珀金埃尔默维克多在590海里3multilabel计数器(珀金埃尔默生活和科学分析,谢尔顿,CT)。

流式细胞术检测

细胞孵育10µg /毫升BrdU 2 h。附着细胞收集使用trypsin-EDTA和漂浮细胞被离心收集。与PBS的细胞结合,洗两次,在70%乙醇固定,储存在−20°C。固定细胞permeabilized 2 m盐酸,阻止了0.5%热灭活血清1 h和孵化BrdU-FITC抗体(BD生物科学,圣何塞,CA) 20分钟在4°C。孵化后,细胞被洗PBS和300年re-suspendedµl Propidium碘缓冲区(PBS, 0.1% Triton, 0.05毫克/毫升核糖核酸酶A,和10µg /毫升Propidium碘)在室温下和孵化为30分钟。的细胞进行分析fluorescence-activated细胞分选仪(FACScan BD生物科学,圣何塞,CA)使用CellQuest软件。

膜联蛋白V染色根据生产执行协议(BD生物科学,圣何塞,CA)。简单,细胞被洗两次冷PBS和resuspended 1×绑定缓冲1×10的浓度6细胞/毫升。100µl这个细胞悬液,5µl膜联蛋白V抗体添加和孵化在黑暗中在室温下15分钟。孵化后,400µl绑定缓冲被添加到管和分析fluorescence-activated细胞分选仪(FACScan BD生物科学,圣何塞,CA)使用CellQuest软件。

脂肪酸合成分析

脂肪酸合成被公司[2 -测量14C)醋酸脂质所描述的其他地方[34],[35]。简单地说,在6孔板细胞被镀3 x105细胞每道菜和孵化过夜。第二天,细胞转染siRNAs,如上所述。在转染后几个时期,细胞和3µCi[2 -孵化4醋酸C] / 4 hr。孵化后,细胞收获和相同数量的细胞悬浮在200µl PBS。脂质提取3∶1甲醇:氯仿混合与偶尔摇30分钟。30分钟后,一个额外的250µl甲醇和300µl水被添加。样本然后离心机和下阶段是统计14C使用帕卡德1600 ca Tri-Carb液体闪烁计数器(帕卡德仪器公司,IL)。每个实验重复一式三份的数据表示为百分数控制。

免疫印迹分析

等量的蛋白质(30µg)是解决electrophoretically和转移到硝化纤维素膜(绘画纸GmbH, Dassel,德国)。之后,封锁Tris-buffered脱脂奶粉5%生理盐水和0.1%渐变20,探讨了膜具有以下主要抗体:anti-p63鼠单克隆抗体(圣克鲁斯生物技术、圣克鲁斯,CA) anti-FAS鼠单克隆抗体(BD生物科学,圣何塞,CA) anti-phospho AKT兔多克隆抗体(细胞信号技术,Inc .,丹弗斯,MA), anti-AKT兔多克隆抗体(细胞信号技术,Inc .,丹弗斯,MA), anti-phosphoS6兔多克隆抗体(细胞信号技术,Inc .,丹弗斯,MA),和anti-cleaved半胱天冬酶3,兔单克隆抗体(细胞信号技术,Inc .,丹弗斯,MA)。结合抗体检测与HRP-conjugated山羊anti-rabbit或山羊anti-mouse(热费希尔科学,罗克福德,IL)和止动剂™西方化学发光合衬底(密理博公司,泰梅库拉,CA)。

实时PCR研究

总RNA提取使用试剂盒试剂(英杰公司公司,卡尔斯巴德,CA)和互补脱氧核糖核酸是由逆转录合成1总mRNA的µg使用逆转录酶(英杰公司公司,卡尔斯巴德,CA),随机五个一(英杰公司公司,卡尔斯巴德,CA)和核苷酸混合物根据制造商的协议。实时PCR研究使用SYBR执行绿色(应用生物系统公司,培育城市,CA)在Bio-Rad MyiQ™单色实时PCR检测系统(Bio-Rad实验室、大力神、CA)。每个实验重复在一式三份和数据分析了使用基因表达宏™软件(Bio-Rad实验室、大力神、CA)。

鳞状细胞癌组织微阵列

消除识别信息formalin-fixed,头颈部鳞状细胞癌(HNSCC)石蜡包埋组织收集从83年患者诊断和治疗在波士顿布莱根妇女医院和圣詹姆斯医院,都柏林,爱尔兰。对于每个案例,三个核心组织切片(0.6毫米直径)被选中代表肿瘤区域和排列在三个新的收件人石蜡块。50%的情况下采取了三个额外的组织核心从形态正常区域。肿瘤的特点进行了总结表1。

缩略图
下载:
表1。HNSCC病例的肿瘤特征。

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0005877.t001

免疫组织化学和统计分析

使用以下抗体标本应用:鼠标anti-p63(克隆4 a4,稀释1∶200,圣克鲁斯生物技术、圣克鲁斯,CA)和兔anti-FASN(稀释1∶200,试验设计,安阿伯市MI)。短暂,石蜡包埋组织切片deparaffinized和水化治疗抗原检索(0.01 M柠檬酸缓冲液pH值6.0)。这一步之后,孵化3%过氧化氢阻断内源性过氧化物酶活性。幻灯片被孵化的主要抗体的最佳稀释在室温下60分钟。反应产品然后使用DAKO设想™开发+系统辣根过氧化物酶检测设备(Carpinteria DAKO北美公司,CA)和苏木精复染色。如前所述执行双重免疫染色[36]。double-immunostained幻灯片进行扫描使用ScanScope®滑动扫描系统(Aperio Technologies Inc。Vista, CA)和图像分析了颜色反褶积算法(Aperio Technologies Inc。)。

每一个标记的表达水平评估由两个病理学家(、和SS)盲法临床和实验室数据。p63打进了估计肿瘤细胞的百分比显示核染色。脂肪酸合酶的胞质表达得分为负(没有表达),弱表达(1 +),适度表达(2 +),和强大的(3 +)。的意思是三个核心/肿瘤作为一个值。65%的截止p63阳性细胞应用于分离高(> 65%)和低(小于或等于65%)p63明示。FASN染色强度≥2应用于独立的高、低FASN明示。频率分析的应急表、统计分析变量之间的关联是由确切概率法。统计学意义是P≤0.05。

结果

击倒总或ΔN特定p63亚型引起的细胞生存能力下降

鳞状细胞癌细胞系(SCC9)和前列腺嗜碱性上皮细胞永生化(iPrEC)是利用调查的分子途径调解p63在上皮细胞功能。

沉默的p63表达式进行小干扰rna寡核苷酸SCC9细胞利用,针对所有p63亚型(Tp63 siRNA),或ΔNp63亚型(Dp63 siRNA)。此外,严格监管实现p63沉默SCC9和iPrEC细胞通过开发tetracycline-inducible克隆表达短发卡RNA(成分)序列对所有p63亚型(SCC9-Tp63和iPrEC-Tp63)或ΔNp63亚型(SCC9-Dp63和iPrEC-Dp63)。RNAi方法导致p63蛋白表达减少60 - 80%的目标细胞(图1 a - b和数据未显示)。正如所料,未发现p63蛋白水平变化与控制细胞转染核(Scr)或没有接受四环素的克隆。

缩略图
下载:
图1所示。沉默总或ΔN特定p63亚型引起的细胞生存能力下降。

答:免疫印迹分析p63和Tp63 SCC9细胞转染,Dp63或可控硅siRNAs。b免疫印迹分析p63在SCC9 tetracycline-inducible克隆(SCC9-Tp63 SCC9-Dp63)和iPrEC (iPrEC-Tp63和iPrEC-Dp63)有或没有与四环素治疗。c - d。细胞生存曲线。量化的细胞生存能力衡量MTT测定与Tp63 SCC9细胞转染,Dp63或可控硅siRNAs (C),在SCC9-Tp63 SCC9-Dp63细胞有或没有治疗四环素(D,上半部分)和iPrEC-Tp63 iPrEC-Dp63细胞有或没有治疗四环素(D,较低的面板)。数据显示为手段+ /−标准误差和代表三个独立的实验。

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0005877.g001

Downregulation p63表达式SCC9和iPrEC细胞导致显著降低细胞生存能力。具体来说,击倒p63在SCC9细胞引起的可行的细胞的数量减少最早p63 siRNA转染后48小时而争夺控制(P = 0.02,双尾t以及)(图1 c)。对细胞活力的影响变得更加明显在稍后的时间点。白天6 h(144),有一个戏剧性的减少细胞转染的可行性与Tp63, (P = 0.006,双尾t以及)或Dp63 (P = 0.0009,双尾t以及)siRNAs相比细胞转染核与争夺。类似的结果观察p63在诱导SCC9沉默和iPrEC克隆(图1 d)。

击倒总或ΔN特定p63亚型在不影响细胞周期凋亡

我们下一个评估是否观察到的细胞生存能力下降是细胞凋亡的结果差别的p63对这些基因,细胞周期阻滞,或两者兼而有之。我们解决这个问题通过执行流仪结果SCC9和p63沉默后iPrEC细胞系。我们发现p63击倒所有p63亚型或ΔNp63亚型引起的人口显著增加子G1细胞相比,对照组(P < 0.05 48、72和96 h,双尾t以及)(图2 a-2c左面板)。符合这些数据,击倒p63 SCC9和iPrEC细胞导致增加裂解半胱天冬酶3水平和相应减少表达总半胱天冬酶3。因此,裂解聚(ADP-ribose)聚合酶(PARP)蛋白质含量增加p63击倒后(图2 d)。这些数据提供的证据表明,p63扮演了一个角色转换和永生的上皮细胞的生存。观察Tp63和Dp63 siRNAs产生相似的结果表明,p63抗凋亡作用主要是由ΔNp63亚型。

缩略图
下载:
图2。沉默总或ΔN特定p63亚型的细胞增殖与凋亡无显著变化。

得了。流cyometric SCC9分析细胞转染与Tp63 Dp63或可控硅siRNAs (A), SCC9-Tp63 SCC9-Dp63细胞有或没有治疗四环素(B)和iPrEC-Tp63 iPrEC-Dp63细胞有或没有治疗四环素(C)。左面板显示量化子G1(百分比)的人口以π染色。右面板显示分数的细胞在细胞周期的不同阶段,由BrdU合并。数据显示为手段+ /−标准误差和代表三个独立的实验。d . apoptosis-related蛋白质免疫印迹分析与Tp63 SCC9细胞转染,Dp63或可控硅siRNAs(左面板),在SCC9-Tp63细胞有或没有治疗四环素(中间面板)和iPrEC-Tp63细胞有或没有治疗四环素(右面板)。

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0005877.g002

对细胞凋亡的影响相比,我们没有观察到任何明显的p63-silenced细胞的细胞周期分布的变化相比,他们控制(图2 a - c,对面板)。这些结果表明,p63促进细胞存活率没有显著影响细胞增殖。

p63调节脂肪酸合成酶(FASN)和活动水平

最近建议FASN是守恒的目标p53家庭成员,包括p63和p73[32]。FASN以来已被证明具有抗凋亡的活动,我们调查是否pro-survival p63是由FASN的函数。

作为第一步,我们评估是否p63调节FASN表达式通过评估效果上差别的p63对这些FASN mRNA和蛋白水平。击倒的p63 Tp63或Dp63 siRNAs下降的mRNA表达FASN SCC9细胞系(大约50%的图3一(左)和中间板)。另外,我们观察到类似的减少FASN转录水平在iPrEC p63击倒后细胞(图3一右面板)。符合这些结果,我们发现明显降低FASN蛋白表达在击倒p63 SCC9和iPrEC细胞(图3 b)。这些数据证实,p63调节FASN mRNA和蛋白表达水平改变和不灭的上皮细胞。

缩略图
下载:
图3。p63沉默诱发FASN表达和酶活性下降。

a . FASN mRNA的定量实时rt - pcr SCC9细胞转染Tp63或Dp63 siRNA相对于细胞转染与可控硅核(左面板)。定量SCC9-Tp63 FASN mRNA的iPrEC-Tp63细胞用四环素治疗相对于记者未经处理的细胞(中间和右侧的面板,分别)。数据显示为手段+ /−标准误差和代表三个独立的实验。b免疫印迹分析FASN SCC9细胞转染与Tp63 Dp63或可控硅siRNAs(左面板),在SCC9-Tp63细胞有或没有治疗四环素(中间面板)和iPrEC-Tp63细胞有或没有治疗四环素(右面板)。c .定量SCC9渗入细胞内脂质吸收的细胞转染Tp63或Dp63 siRNA相对于细胞转染与小干扰rna(左面板)和可控硅SCC9-Tp63 iPrEC-Tp63细胞治疗四环素相对于记者未经处理的细胞(中间和右侧的面板,分别)。数据显示为手段+ /−标准误差和代表三个独立的实验。

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0005877.g003

为了探索功能引起的差别FASN对这些p63沉默的后果,我们研究了脂肪酸合成醋酸在p63-silenced细胞通过评估C14并入细胞脂质。SCC9细胞系,p63击倒导致显著降低脂肪酸合成相比控制(p = 0.004,双尾t以及)。这样减少观察转染后48小时siRNAs和持续的测量时间点96 h (图3 c)。在SCC9-Tp63重叠结果(p = 0.009,双尾t检验,120 h)和iPrEC-Tp63 (p = 0.015,双尾t以及120 h)细胞。综上所述,我们的数据表明,p63沉默导致FASN水平和FASN显著降低酶活性。

p63调节AKT激活

Phosphatidylinositol-3′激酶(PI-3 K′) /蛋白激酶B(一种蛋白激酶)信号已经广泛涉及细胞生存和有证据表明,一种蛋白激酶可能函数FASN的上游和下游[37]。因此,我们分析了p63在调制AKT激活的角色转换和永生的上皮细胞。沉默的p63 SCC9和iPrEC细胞诱导一种蛋白激酶的磷酸化作用明显降低,而不会导致任何总AKT水平变化(图4)。另外,我们观察到,p63沉默导致减少的磷酸化核糖体蛋白S6, PI-3K-AKT通路的下游效应。

缩略图
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图4。p63沉默诱发一种蛋白激酶磷酸化下降。

免疫印迹分析总AKT, phospho-AKT (Ser 473),和phospho-S6 (Ser 235/236)与Tp63 SCC9细胞转染,Dp63或可控硅siRNAs(左面板),在SCC9-Tp63细胞有或没有治疗四环素(中间面板)和iPrEC-Tp63细胞有或没有治疗四环素(右面板)。

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0005877.g004

p63 pro-survival函数FASN和AKT介导的

p63都调节AKT的观察和FASN活动,表明信号所需的这些分子可能是下游p63抗凋亡作用。我们测试这个假说的调查组成型表达是否FASN或activated-AKT能够保护细胞免受细胞生存能力下降引起p63沉默。为此,SCC9和FASN iPrEC细胞稳定转染,myristoylated AKT (Myr-AKT)或空向量(EV)。p63沉默是取得FASN overexpressing细胞(FASN-SCC9和FASN-iPrEC), Myr-AKT表达细胞(mAKT-SCC9和mAKT-iPrEC)和控制(EV-SCC9和EV-iPrEC)通过转染核或代tetracycline-inducible克隆表达成分。

FASN和Myr-AKT overexpressing细胞监测p63击倒——诱导细胞死亡和细胞表达空向量。迫使FASN或激活一种蛋白激酶的表达降低细胞凋亡率评估差别p63后观察对这些膜联蛋白V和PI染色(图5一个)。此外,FASN的影响和AKT激活p63沉默细胞的生存能力评估通过比较可行的细胞数量的减少造成FASN和差别的p63对这些Myr-AKT overexpressing细胞与各自的控制。按照细胞凋亡数据,组成型表达FASN或Myr-AKT值得注意的是,但不完全,救出p63下调造成的细胞生存能力下降(图5 b, C)。这些结果表明,FASN和AKT通路发挥重要作用在p63-mediated细胞生存。

缩略图
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图5。增加FASN或AKT活动保护细胞免受p63沉默诱导细胞凋亡。

答:细胞凋亡的定量流式细胞术使用膜联蛋白V化验(左面板)或者πEV-SCC9染色(右面板),mAKT-SCC9, FASN-SCC9细胞转染Tp63或可控硅siRNAs。b . p63沉默效果的可行性SCC9和iPrEC细胞overexpressing FASN或空向量。上面板:量化EV-SCC9和FASN-SCC9细胞转染的细胞生存能力与Tp63(左面板)或Dp63(右面板)相对与可控硅核细胞转染。左下方面板:细胞生存能力的量化EV-SCC9 FASN-SCC9细胞携带诱导Tp63成分(EV-SCC9-Tp63和FASN-SCC9-Tp63)用四环素治疗相对于未经处理的细胞。右下方面板:细胞生存能力的量化EV-iPrEC和FASN iPrEC细胞携带诱导Tp63成分(EV-iPrEC-Tp63和FASN - iPrEC-Tp63)用四环素治疗相对于未经处理的细胞。c的影响p63沉默SCC9的可行性和iPrEC细胞overexpressing Myr-AKT或空向量。上面板:量化EV-SCC9和mAKT-SCC9细胞转染的细胞生存能力与Tp63(左面板)或Dp63(右面板)相对与可控硅核细胞转染。左下方面板:细胞生存能力的量化EV-SCC9 mAKT-SCC9细胞携带诱导Tp63成分(EV-SCC9-Tp63和FASN-SCC9-Tp63)用四环素治疗相对于未经处理的细胞。右下面板:细胞生存能力的量化EV-iPrEC mAKT-iPrEC细胞携带诱导Tp63 shRNA (EV-iPrEC-Tp63和mAKT-iPrEC-Tp63)用四环素治疗相对于未经处理的细胞。数据显示为手段+ /−标准误差和代表三个独立的实验。 D. Immunoblot analysis of p63, FASN, phospho-AKT and c-PARP in EV-SCC9-Tp63 and FASN-SCC9-Tp63 cells with or without treatment with tetracycline. E. Inhibition of AKT signaling significantly affects FASN-mediated rescue of cell death induced by p63 silencing. The graph shows the viability of EV-SCC9-Tp63 with or without treatment with tetracycline and of FASN-SCC9-Tp63 and FASN-SCC9-Tp63 cells with or without treatment with an AKT inhibitor and/or tetracycline. Data are shown as means +/− standard error and are representative of three independent experiments.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0005877.g005

十字架说FASN和AKT之间提出了各种研究。有证据表明,一种蛋白激酶信号诱发FASN的表达,抑制FASN phospho-AKT的差别在对这些活动的结果[37]- - - - - -[40]。根据这些以前的观测,我们调查了相声FASN和AKT在SCC9细胞之间。

过度的FASN SCC9细胞导致增加一种蛋白激酶的磷酸化。在击倒p63 FASN-SCC9细胞表现出phospho-AKT表达水平下降,但仍明显高于那些发现在EV-SCC9-Tp63细胞(图5 d和图印地)。这些结果表明,FASN赋予的抗细胞凋亡过度p63-silenced细胞可能至少部分由于AKT激活信号。为了更好地理解AKT是否扮演了一个角色在这个过程中,我们研究了一种蛋白激酶抑制的影响在FASN overexpressing细胞沉默p63表达式。我们观察到显著减少细胞生存能力当FASN-SCC9细胞治疗与特定AKT抑制剂(AKTi 3µM) p63击倒后(图5 e)。因此,一种蛋白激酶信号似乎在FASN-mediated生存中发挥作用。

过度myr-AKT或封锁PI3K / AKT通路(LY和AKT抑制剂)位于相同的单元中水平显著调制phospho-AKT但没有造成任何改变FASN蛋白质水平,表明AKT不发挥核心作用的规定FASN表达式在这些细胞(图S1)。令人惊讶的是,然而,FASN活动显著增加了超表达myr-AKT和减少了一种蛋白激酶抑制图S2)。这个结果提出了翻译后调控的可能性的FASN AKT,表明救援p63-silenced记录中凋亡细胞表达myr-AKT可能部分由FASN信号。此外,这一发现表明,减少造成的可行性AKTi FASN-SCC9细胞治疗可能涉及FASN活动的抑制作用。值得注意的是,AKTi治疗FASN-SCC9细胞的影响似乎很大程度上独立于p63水平(即减少类似的可行性是p63-silenced和控制FASN-SCC9细胞)(图5 e)。ATKi抑制一种蛋白激酶和FASN活动以来,观察到p63水平有限影响FASN-SCC9细胞治疗的可行性ATKi AKT的假设是一致的和FASN p63 pro-survival函数的重要介质。

p63和FASN人体鳞状细胞癌组织中的表达呈正相关

我们的细胞化验表明FASN功能相关的目标p63在鳞状细胞癌的细胞。如果FASN p63功能也在人类肿瘤的主要中介,两种蛋白质的水平会在鳞状细胞癌组织中呈正相关。为了验证这个假设,我们研究FASN和p63蛋白免疫组织化学表达的组织微阵列(TMA)包含核心从83例头颈部鳞状细胞癌(HNSCC)。描述的肿瘤的特点表1。形态正常上皮,FASN表达式是软弱,局限于较低的层次。符合之前的报道,p63表达观察基底和parabasal上皮细胞层(数据未显示)。在83个肿瘤,FASN被发现在95.2%的情况下和p63在98.8%的情况下。p63蛋白表达被评估得分积极细胞核肿瘤细胞的百分比。胞质表达FASN得分为负(没有表达),弱表达(1 +),适度表达(2 +),和强大的(3 +)。统计分析显示显著正相关(p < 0.007,确切概率法)之间FASN和p63表达水平(表2)。具有代表性的例子所示图6和图S3。值得注意的是,FASN non-keratinizing更强烈的表达与嗜碱性低分化肿瘤形态、p63被发现积极的在近100%的肿瘤细胞(图6较低的面板)。没有发现重大协会肿瘤分级和FASN之间或p63表达水平(数据没有显示)。这些发现符合我们在体外数据,进一步支持的作用在调节pro-oncogenic FASN p63功能在活的有机体内。

缩略图
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图6。p63和FASN Co-localization在活的有机体内。

答:免疫组织化学染色在蓝玉FASN和p63包含从HNSCC组织核心。两个具有代表性的例子所示:一个案例显示低p63和低FASN表达式(上半部分)和1例显示高p63和高FASN表达式(下图)。b . Co-localization p63和FASN UGS的上皮细胞和前列腺味蕾。(a)从野生型E18.5 UGS的日冕部分胚胎双重应用p63(快速红色)和FASN (DAB)与苏木精复染色。Deconvolved民建联的图像(b)和红色(c)快通道以及pseudo-colorized图像(c)也显示。pseudo-colorized形象,轻拍频道(FASN)显示在绿色、快速红色通道(p63)显示在红色和苏木精频道显示在蓝色。FASN和p63蛋白的表达是绝大多数的细胞中观察到。UGS的细胞腔FASN和p63一直是负面的。

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0005877.g006

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表2。积极的协会p63和FASN表达HNSCC病例。

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0005877.t002

p63和FASN硝唑在泌尿生殖窦(UGS)和前列腺癌的发展

我们曾表明,p63需要前列腺基底细胞的发展。的观察pro-survival p63在前列腺嗜碱性iPrEC细胞的作用取决于FASN,促使我们研究可能发展中前列腺p63和FASN表达之间的联系。为此,UGS的横向部分从一个老鼠胚胎在天E18.5 double-immunostained p63和FASN。Co-localization观察两种蛋白质的低和UGS的中间层上皮以及前列腺味蕾(图6 b)。这些结果表明,FASN可能p63函数的一个重要中介在前列腺癌的发展。

讨论

有越来越多的证据表明,p63特别是ΔNp63,在肿瘤发生和发展中起着至关重要的作用,促进上皮细胞的生存[4],[10],[11],[15],[27],[41]。然而,很少有研究解决这些重要功能的分子机制可能产生。在这方面,有人建议ΔNp63抵消细胞凋亡抑制pro-apoptotic基因的表达和激活细胞粘附的程序[23],[24],[29],[30]。

这里我们发现p63是必不可少的生存iPrEC和SCC9细胞和提供大量的证据表明,这个过程是由脂类代谢的调节,特别是FASN的功能。我们的研究结果表明,p63不仅诱发的表达FASN mRNA和蛋白水平也提高其酶活性。最重要的是,稳定的FASN能够拯救细胞过度引起的细胞死亡。差别的p63对这些

FASN是一个合成的关键酶乙酰辅酶a的长链脂肪酸和malonyl-CoA对胚胎发育至关重要。事实上,FASN基因敲除小鼠和大多数FASN杂合的老鼠死在子宫内[42]。FASN表达的上调在许多类型的癌症及其与较差的预后结果一直认为它在人类恶性肿瘤中的作用[43]- - - - - -[50]。符合这一假说,抑制FASN通路通过FASN抑制剂包括C75或浅蓝,或沉默FASN表达式RNAi导致G1逮捕和/或在各种癌症细胞诱导细胞凋亡[51]- - - - - -[56]。此外,最近我们组的发现表明FASN功能代谢致癌基因在前列腺癌通过抑制细胞凋亡的内在途径[57]。因此,新发现的监管FASN活动p63建立p53家庭成员之间关系的一种新颖的功能和细胞的新陈代谢。此外,它表明维护脂肪酸合成的机制之一p63充当pro-survival分子发展和癌症。

D 'Erchia等人最近报道,FASN港口两个p53响应元素(REs)在其启动子站点,TAp73α,和ΔNp63α,但不是p53, TAp73β或TAp63α直接绑定到这些元素和调节FASN在转录水平的表达[32]。这些数据表明FASNΔNp63的直接目标,同意我们的观察,p63都调节FASN转录和蛋白质水平。此外,在我们的实验中沉默总或ΔNp63亚型产生重叠的细胞表型,这意味着ΔNp63是主要的球员在控制细胞在上皮细胞生存和FASN活动。

发现p63沉默减少一种蛋白激酶的磷酸化及其下游目标S6建议通过PI3K / AKT信号通路参与p63函数。证实了这个假设异位表达的示范myr-AKT授予保护p63损失引起的细胞凋亡。我们的研究结果与最近报道的小川等人证明活化ΔNp63αAKT通路是必要的防护紫外线诱导细胞凋亡[58]。

一个积极的反馈回路FASN和AKT激活提出了之间的关系[37]。与以前公布的数据一致[39],我们发现FASN维持AKT激活,提高FASN AKT可能下游功能在促进细胞存活。符合这一假设,我们发现阻塞的一种蛋白激酶通路改变FASN-mediated救援的细胞死亡p63沉默的背景下,因此,AKT似乎FASN信号的关键中介,至少在我们的模型系统。

AKT激活已经被证明可以有效的表达FASN在几种类型的肿瘤包括卵巢[37]和前列腺癌[59]。因此,抑制PI3K / AKT通路LY 294002已经被证明可以减少FASN的表达[39]。此外,有证据表明,转录激活SREBP-1c (sterol-regulatory-element-binding protein-1c),这是一个已知的监管机构FASN表达式,用以调制一种蛋白激酶和MAPK通路[23],[37],[39],[40],[60],[61]。令人惊讶的是,我们没有观察到任何重大变化FASN蛋白质含量通过激活或阻断AKT通路。因此,AKT通路在调节FASN水平的影响可能是特定的细胞类型。尽管这个结果,但值得注意的是,迫使myr-AKT的表达显著增加FASN活动,建议更多的和更一般的影响AKT通路FASN可能涉及的转录后修饰。

总的来说,发现FASN诱发一种蛋白激酶磷酸化,激活下游AKT突出FASN之间存在一个正反馈循环,ATK公司信号。额外的实验需要解开一种蛋白激酶信号调节的分子机制FASN酶活性而不影响其蛋白质含量。也将重要决定p63可以诱导AKT激活通过FASN以外的信号机制。

过度的FASN p63之前一直在鳞状细胞癌各器官[15],[18]- - - - - -[20],[62]。支持的假设p63函数是由FASN,我们观察到的表达FASN和p63在人类HNSCC组织积极相关。有趣的是,FASN表达水平似乎是最高non-keratinizing低分化肿瘤与嗜碱性形态也表示p63水平很高。此外,在一些——腺HNSCCs, p63和FASN硝唑在最外围的分化细胞病变的细胞分化程度而更多的中心部分肿瘤结节大多是负面的表达的蛋白质。虽然这些研究结果均符合当前数据表明FASN多个致癌途径的控制下[17],[60],[62]- - - - - -[65],他们似乎支持一个模型中p63维持FASN表达人类HNSCC的未分化的干细胞的人口。因为它最近建议p63功能在维持表皮干细胞的增殖潜力[11],这将是至关重要的建立是否相同的遗传程序发挥作用在癌症干细胞和FASN是否参与。

FASN是至关重要的胚胎发育和FASN基因广泛表达在老鼠胚胎[42]。由E9.5 FASN表达式是明显的在表皮和最强的标签是观察到的远端表皮肢芽,包括顶端外胚层的脊(AER),肢体发展至关重要的结构时,也显示p63水平很高[4]。了FASN和p63表达式在各种胚胎结构,包括UGS前列腺上皮和发展中,支持角色FASN p63功能在开发的关键中介。

支持信息

图S1。

抑制或激活AKT通路不改变FAS蛋白质含量。a SCC9细胞治疗几个时间段包括24小时、48小时和72 h AKT抑制剂(AKTi)和FASN使用西方墨点法蛋白表达进行了分析。b超表达FASN和mAKT SCC9-Tp63克隆。EV-SCC9-Tp63、mAKT-SCC9-Tp63 FASN-SCC9-TP63细胞处理四环素72 h和免疫印迹。超表达mAKT没有改变FAS蛋白质含量。然而,过度的FASN phospho-AKT的水平增加。

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0005877.s001

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图S2。

超表达myr-AKT或FASN FASN活动增加。FASN活动评估SCC9、mAKT-SCC9 FASN-SCC9细胞治疗AKT抑制剂,AKTi(3µM)或FASN抑制剂,C75(10µg /毫升)或DMSO(控制)为4 h使用。myr-AKT和FASN表达式FASN活动增加相比,他们的控制。阻止这两种途径与特定抑制剂减少FASN的活动。

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0005877.s002

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图S3。

Co-localization p63和FASN HNSCC整个组织切片。整个组织切片的中度分化HNSCC双染色FASN(棕色)和p63(红色)。有梯度表达式的p63和FASN,减少从外围到病变的中心。

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0005877.s003

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作者的贡献

构思和设计实验:VS与漏磁场党卫军。进行了实验:VS与AMA。分析了数据:VS与MG党卫军。造成试剂/材料/分析工具:EO漏磁场。该报写道:VS党卫军。

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