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研究文章

主机对肠道微生物抗原对小鼠的反应

  • 简·m·Natividad

    联系Farncombe家庭消化健康研究所、麦克马斯特大学,加拿大汉密尔顿市

    ⨯
  • Xianxi黄

    联系Farncombe家庭消化健康研究所、麦克马斯特大学,加拿大汉密尔顿市

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  • 艾玛松弛,

    联系Farncombe家庭消化健康研究所、麦克马斯特大学,加拿大汉密尔顿市

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  • Jennifer陪审团

    联系Farncombe家庭消化健康研究所、麦克马斯特大学,加拿大汉密尔顿市

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  • 尤兰达Sanz,

    联系农业化学和食品技术研究所(IATA),西班牙国家研究委员会(CSIC),瓦伦西亚,西班牙

    ⨯
  • 切拉大卫,

    联系免疫学、明尼苏达州罗彻斯特梅奥诊所的美利坚合众国

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  • Emmanuel Denou

    联系Farncombe家庭消化健康研究所、麦克马斯特大学,加拿大汉密尔顿市

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  • Pinchang杨

    联系加拿大汉密尔顿市麦克马斯特大学病理学系,

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  • 约瑟夫•默里

    联系胃肠病学,明尼苏达州罗切斯特梅奥诊所的美利坚合众国

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  • 凯西·d·麦科伊,

    的贡献同样这项工作:凯西·d·麦科伊埃琳娜一直

    联系Farncombe家庭消化健康研究所、麦克马斯特大学,加拿大汉密尔顿市

    ⨯
  • 埃琳娜·f .一直对

    的贡献同样这项工作:凯西·d·麦科伊埃琳娜一直

    verdue@mcmaster.ca

    联系Farncombe家庭消化健康研究所、麦克马斯特大学,加拿大汉密尔顿市

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文摘

背景和目的

过度摄取共生的细菌抗原通过透水肠道屏障可能影响宿主反应特异性抗原基因感染宿主。本研究的目的是探讨吲哚美辛治疗引起的肠道屏障功能障碍是否会影响肠道微生物群的宿主反应gluten-sensitized hla dq8 / HCD4老鼠。

方法/主要结果

hla dq8 / HCD4小鼠致敏蛋白,填喂法与吲哚美辛+谷蛋白。肠道通透性是由我们评估室;上皮细胞(EC)大鼠通过电子显微镜;RNA表达的基因编码交界蛋白质Q-real-time PCR;免疫反应的体外抗原的t细胞增殖和细胞因子分析仪珠阵列;荧光原位杂交分析肠道菌群的系统性肠道菌群通过表面抗体染色的活细菌血清紧随其后的是流式细胞仪分析。吲哚美辛肠道通透性增加导致更明显gluten-sensitized老鼠。这些变化是伴随着严重的EC损伤,减少钙粘蛋白的RNA水平,升高IFN-γ脾细胞文化上层清液,和生产重要的IgM抗体肠道微生物群。

结论

吲哚美辛强化屏障功能障碍和EC损伤引起的谷蛋白,影响系统性IFN-γ生产和宿主反应肠道微生物群抗原hla dq8 / HCD4老鼠。结果表明,环境因素改变肠道屏障可能使个体易感性增加面筋通过一个旁观者免疫激活肠道微生物群。

引用:娜提雅维达JM黄),X,松弛E,陪审团J, Sanz Y,大卫·C et al .(2009)宿主肠道微生物抗原对小鼠的反应。《公共科学图书馆•综合》4 (7):e6472。https://doi.org/10.1371/journal.pone.0006472

编辑器:Wen-Liang周,中山大学,中国

收到:2009年5月6日;接受:2009年6月30日;发表:2009年7月31日

版权:©2009 Natividad et al。这是一个开放的文章下分布式知识共享归属许可条款,允许无限制的使用、分配、和繁殖在任何媒介,被认为提供了原作者和来源。

资助:这项工作是由加拿大协会资助的胃肠病学(CAG) /加拿大健康研究所(CIHR)和加拿大腹腔协会新研究员奖(e .一直对)。e·麦克马斯特大学一直持有Dep.内部职业医学研究奖。k博士本人持有加拿大研究主席胃肠免疫学;Drs。穆雷和大卫被R01 DK71003支持部分。

利益冲突:作者宣称没有利益冲突存在。

介绍

乳糜泻(CD)是一种免疫介导性肠病引发的谷蛋白含有谷物的摄入,特别是醇溶蛋白,存储在小麦蛋白质。它最近已经认识到CD的病理和临床表现严重之间微妙,而临床表现并不局限于粘膜萎缩的存在[1],[2]。谷蛋白敏感性的概念(GS)包含多种病理,免疫,和临床场景可能会,也可能不会形成“乳糜泻”的一部分光谱等对腹泻、免疫粘膜反应蛋白在家庭成员的腹腔疾病,持续积极的具体血清学乳糜泻在缺乏定义肠病,免疫病理变化和微妙的肠谷蛋白。通常,这些疾病发生在个体携带相同的HLA基因型与腹腔disease-DQ2 DQ8有关[3]- - - - - -[7]。这导致了动物模型的发展谷蛋白敏感,模仿gluten-induced发病机制的某些方面[8]。hla dq8 / HCD4或单一hla dq8转基因小鼠与谷蛋白产生免疫反应敏感的醇溶蛋白,包括适应性和先天免疫系统[8]- - - - - -[11]。尽管这些对小鼠不自发发展肠道萎缩,他们展示gluten-dependent肠道神经肌肉和上皮细胞分泌功能的变化[11]。这个模型已经被证明有助于小说实验治疗的临床试验旨在阻止gluten-induced粘膜病理[12]。

hla dq2 / DQ8基因的存在是必要但不充分发展的CD[13],25 - 40%的美国一般人群携带这些基因和蛋白吃,但不要开发腹腔病变[2],[13],从而提高的可能性造成环境和遗传危险因素尚未确定[14]。网络可用性的醇溶蛋白固有层似乎乳糜泻患者炎症反应的一个重要因素。面筋组件的固定和haptenation组织转谷氨酰胺酶的细胞外基质蛋白艾滋病和允许水库抗原上强的面筋组件达到浓度增加在活的有机体内,甚至可能引起普遍对大体上粘膜反应[15]。事实上,乳糜泻患者的出现提升了系统性的IgA胶原蛋白的抗体滴定度[15]。

在正常情况下,肠道上皮细胞作为一个保护屏障限制运输腔的抗原,并只允许数量小、选择性渗透粘膜[16]- - - - - -[18]。相比之下,已经证明了肠道通透性增加患者积极的CD[19],[20]健康和他们的亲属,这表明在比例的情况下,肠道屏障异常可能之前明显的炎症[21]。屏障功能改变可能是一个关键的步骤,促进宿主反应导致谷蛋白敏感性的临床表现。因此,本研究旨在调查是否改变肠道屏障功能的使用非甾体抗炎药(非甾体抗炎药),吲哚美辛,提高gluten-induced上皮损伤和后续影响宿主肠道反应腔的抗原。我们的结果表明,吲哚美辛增强gluten-induced粘膜的变化导致IFN-γ版本增加了gliadin-stimulated脾细胞和对肠道菌群抗原系统启动。与长期障碍遗传主机异常,这种机制可以降低炎症反应到特定抗原的阈值。

结果

谷蛋白致敏和吲哚美辛治疗导致体重增加的缺陷

谷蛋白致敏小鼠和non-sensitized老鼠用消炎痛治疗表现出轻微缺陷的7周后体重增加而non-sensitized控制。Gluten-sensitized用消炎痛治疗表现出更严重的缺陷的小鼠的体重增加7周后,所有组(相比图S1)。这些结果表明,延迟繁荣的谷蛋白和消炎痛治疗的老鼠。

吲哚美辛的组织电导和渗透增加大分子在上皮gluten-sensitized老鼠

为了确定蛋白致敏的影响和吲哚美辛治疗肠道通透性,组织电导和合通量测定小肠段。Gluten-sensitized老鼠用消炎痛治疗表现出显著增加小肠组织电导相比non-sensitized控制和吲哚美辛alone-treated老鼠(图1一个)。合变化,测量transcellular大分子运输、高架在所有组相比non-sensitized控制。谷蛋白致敏和消炎痛治疗,然而,导致合最高增加通量与non-sensitized控件(相比大约增加2.5折图1 b)。肠道通透性变化的增强作用,消炎痛不是C57BL / 6小鼠观察与谷蛋白致敏,强调的重要性DQ8转基因模型(图S2)。

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图1所示。肠道屏障测量。

Ussing-chamber实验进行空肠从所有四组24小时后面筋的挑战。(一)Gluten-sensitized老鼠用消炎痛治疗有显著提高组织电导。(B)合通量(transcellular渗透率)显著增加在所有治疗组相比,non-sensitized控制,然而最高的值观察蛋白+吲哚美辛治疗老鼠。数据代表10老鼠的意味着±SEM /组。

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0006472.g001

吲哚美辛导致gluten-sensitized上皮ultra-structural伤害老鼠

使用电子显微镜肠道形态进行了分析。未发现线粒体异常non-sensitized控制或gluten-sensitized老鼠没有消炎痛(图2 a, B)。线粒体异常观察小鼠仅用消炎痛治疗(图2 c在gluten-sensitized老鼠用消炎痛治疗)和(图2 d)。我们量化的比例与中断嵴线粒体定义区域大约相同数量的线粒体(图2 e)。Gluten-sensitized老鼠用消炎痛治疗,有较高比例的受损的线粒体比Gluten-sensitized吲哚美辛的老鼠。上皮细胞水肿和扰乱微绒毛组织中观察到来自gluten-sensitized +吲哚美辛治疗老鼠但不是从其他组(图3)。这些标志着gluten-sensitized ultra-structural变化没有观察到(图3 c)和吲哚美辛alone-treated老鼠(图3 d)。改变交叉的大鼠组织中更明显gluten-sensitized加上indomethacin-treated老鼠(图3比)相比,non-sensitized (a - b), gluten-sensitized (C)和吲哚美辛alone-treated老鼠(D)。

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图2。评估线粒体中断。

线粒体大鼠被电子显微镜评估。吲哚美辛增加干扰线粒体的分数。谷蛋白致敏+吲哚美辛治疗进一步改变线粒体的比例增加。数据代表6小鼠的意味着±SEM /组。Reperesentative照片从(A)控制鼠标,箭:正常的线粒体;(B) Gluten-sensitized鼠标;(C) Indomethacin-treated鼠标箭头:被打乱的线粒体嵴;(D) Indomethacin-treated + gluten-sensitized鼠标箭头:线粒体嵴被打乱的。

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0006472.g002

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图3。顶端上皮细胞结构异常。

上皮细胞大鼠被电子显微镜评估。很大一部分的改变TJ在gluten-sensitized + indomethacin-treated老鼠。消炎痛也增加了单独改变TJ的比例,但在较小程度上比吲哚美辛+谷蛋白。谷蛋白致敏独自倾向于增加的比例改变TJ但这没有达到统计学意义(p = 0.09 vs non-sensitized控制)。数据代表5老鼠的意味着±SEM /组。代表的照片(a - b)控制鼠标箭头:紧密连接(TJ)保存结构;(C) Gluten-sensitized鼠标箭头:TJ保存结构;(D) Indomethacin-treated鼠标显示改变TJ(箭头)和2连接与正常结构(箭头);(eg)蛋白+ indometacin治疗老鼠;(E)箭头:微绒毛(mv)高度降低,箭:顶端上皮细胞破坏; (F) Altered TJ, arrow: mitochondria (m) with disrupted cristae; (G) Several altered TJs.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0006472.g003

伴随治疗与吲哚美辛和面筋导致减少钙粘蛋白mRNA的表达

紧密连接的大鼠的变化促使我们调查是否有改变RNA的表达上皮adherens紧联接的蛋白质。Gluten-sensitized和吲哚美辛alone-treated老鼠显示钙粘蛋白的RNA表达减少了平均系数分别为0.762和0.533,但是这没有达到统计学差异相对于non-sensitized控件(图4)。相比之下,钙粘蛋白的RNA的表达显著降低由2.75折non-sensitized老鼠相比,在gluten-sensitized + indomethacin-treated老鼠。谷蛋白致敏和消炎痛没有显著影响的相对RNA表达紧密连接ZO-1 (图S3)。

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图4。RNA水平的钙粘蛋白相对于控制(non-sensitized)。

实时QPCR实验进行空肠过去24小时后收集到的所有组蛋白的挑战。Gluten-sensitized和吲哚美辛alone-treated老鼠显示趋势减少钙粘蛋白的表达相对于non-sensitized控制。Gluten-sensitized + indomethacin-treated老鼠明显下调的钙粘蛋白的RNA水平相对于non-sensitized控制。数据代表6小鼠的意味着±SEM /组。

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0006472.g004

吲哚美辛治疗影响的释放IFN-γgluten-sensitized小鼠的脾细胞在体外挑战PT-gliadin

为了评估是否增加渗透率和gluten-senstized小鼠肠道损伤结构与吲哚美辛治疗后导致增加系统性免疫反应的醇溶蛋白,分析抗原脾细胞的增殖和细胞因子的生产。增加T细胞增殖与PT-gliadin孵化后在gluten-sensitized老鼠,但不是在non-sensitized控件(图5)。增殖的差异并未反映细胞死亡或者不能增殖与ConA多克隆刺激导致所有群体平等的反应(数据没有显示)。令人惊讶的是,indomethacin-treatment gluten-sensitized小鼠没有表现出更高水平的抗原扩散而gluten-sensitized老鼠没有给予消炎痛(图5)。体外孵化gluten-sensitized小鼠的脾细胞与吲哚美辛不增加细胞增殖(图S4)。

缩略图
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图5。脾细胞增殖与PT孵化后醇溶蛋白。

扩散是衡量3H-thymidine整合和表达为刺激指数。从gluten-sensitized小鼠脾细胞治疗或没有吲哚美辛non-sensitized相比表现出增加扩散控制。数据代表6小鼠的意味着±SEM /组。

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0006472.g005

进一步评估系统性免疫反应白介素,IFN-γ和il - 10水平的上层清液PT-gliadin刺激脾细胞培养测定(图6)。同时白介素上面没有引起媒体,il - 10水平略增加文化上层清液的脾细胞从gluten-sensitized indomethacin-treated gluten-sensitized脾细胞在体外刺激与PT-gliadin,尽管增加未达到统计上的显著水平。

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图6。脾细胞文化的上层清液中细胞因子与PT-gliadin孵化后(黑色)或介质(白色)。

表达式(A) IL-12p70, (B) IFN-γ,(C) il - 10测定CBA分析。文化上层清液从gluten-sensitized +吲哚美辛(印度)治疗小鼠显示增加干扰素-γ(* p < 0.01 vs所有组)。培养从gluten-sensitized小鼠脾细胞,有或没有吲哚美辛显示趋势增加il - 10后释放PT-gliadin刺激(p = 0.09)。数据代表6小鼠的意味着±SEM /组。

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0006472.g006

相比之下,吲哚美辛治疗gluten-sensitized导致显著增加小鼠IFN-γ生产PT-gliadin刺激的反应。体外孵化gluten-sensitized小鼠的脾细胞与吲哚美辛没有增加IFN-γ生产(图S5)。

谷蛋白和消炎痛导致肠道菌群组成的变化

我们下一个分析蛋白致敏或消炎痛治疗是否能导致肠道微生物区系的组成发生变化。Gluten-sensitized老鼠肠道细菌的比例明显降低大肠杆菌和大肠rectale-Clostridium组,控制老鼠相比。Indomethacin-treated老鼠也减少大肠杆菌的程度,但增加的Bacteroides-Prevotella组。Gluten-sensitized用消炎痛治疗的小鼠肠道菌群的最引人注目的变化,以减少所有细菌群体的相对丰度分析与控制老鼠(图7)。

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图7。微生物群组成。

使用9不同的寡核苷酸探针,荧光原位杂交(鱼),微生物的远端空肠概要研究致敏小鼠和吲哚美辛。结果表明微生物群的比例显著微扰调查在所有三个治疗组相比,non-sensitized控制,和非常gluten-sensitized +吲哚美辛组。这些差异达到统计学意义在双歧杆菌(* p = 0.04 vs控制,+ p = 0.03 vs谷蛋白)和梭状芽胞杆菌Leptum集群(* p = 0.02 vs控制和蛋白致敏,* * p = 0.04 vs吲哚美辛)相比gluten-sensitized孤单。数据代表6小鼠的意味着±SEM /组。

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0006472.g007

吲哚美辛对肠道菌群导致系统启动gluten-sensitized老鼠

之前的数据显示,细菌易位在粘膜免疫系统所必需的系统启动肠道共生的[26]。确定增加电导和合通量gluten-sensitization和消炎痛伴随着失去主人的正常系统性无知肠道微生物群,我们测量特定IgM抗体反应可耕种的有氧或无氧共生体。Non-sensitized老鼠显示没有证据表明特定IgM抗体有氧和厌氧共生的植物作为评估流仪分析抗菌IgM响应(图8&图S6)。麸质或消炎痛治疗导致的产量非常低的滴定度IgM抗体针对可培养细菌的一个子集。谷蛋白致敏+吲哚美辛治疗,然而,导致诱导强烈的特定IgM反应针对40 - 80%的可耕种的细菌。抗菌IgM诱导是特定于共生的微生物区系的主机和没有绑定到沙门氏菌,这些老鼠从未接触(图S7)。这些数据表明,gluten-sensitization和吲哚美辛治疗引起的肠道通透性增加增加系统性启动共生的微生物区系。

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图8。系统性共生的抗体。

吲哚美辛和蛋白治疗小鼠的血清显示明显的阳性血清抗体有氧和厌氧肠道微生物群。(一)代表流式细胞仪从每个治疗封闭IgM直方图+细胞;IgM (B)比例+有氧细菌细胞为每个治疗组;IgM (C)比例+每个治疗组厌氧细菌细胞。数据代表6小鼠的意味着±SEM /组。

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0006472.g008

讨论

本研究的目的是调查是否调制的肠道屏障环境触发可以影响宿主反应腔的抗原基因感染宿主。我们的研究结果表明,谷蛋白致敏和长期在hla dq8面筋挑战/ HCD4老鼠改变肠道通透性增加评估的transcellular大分子运输和倾向于较高的电导值(paracellular途径)。这与先前的报道是一致的显示,谷蛋白肽有能力迅速破坏顶端交叉的结构[22]- - - - - -[25],也可以经由异常transcellular路线[26]。政府领导的吲哚美辛gluten-sensitized老鼠更明显屏障功能障碍,这是伴随着温和与标志着电子商务改变大鼠炎性改变,减少钙粘蛋白mRNA水平在近端小肠和代系统性抗体反应肠道微生物群。

吲哚美辛已经使用更高剂量作为炎症性肠病(IBD)的模型[27],[28],已被证明妥协上皮屏障的完整性和功能,诱导活性变化,促进小肠细菌过度生长和易位[27],[29]。在目前的手稿,低剂量的消炎痛引起的渗透率变化不产生宏观或微观溃疡。然而,ultra-structural观测显示上皮细胞异常的特征是线粒体嵴在老鼠身上被打乱的接收吲哚美辛。粘膜毒性蛋白诱导的HCD4 / DQ8小鼠会使吲哚美辛,如图所示的标记海拔合通量和显著增加组织电导。吲哚美辛管理后,C57BL / 6小鼠表现出合通量增加,但没有组织电导的变化。然而,谷蛋白致敏没有诱导C57Bl6小鼠屏障功能障碍,强调相关性的DQ8转基因模型(图S2)。电子显微镜考试gluten-sensitized HCD4 / DQ8老鼠用消炎痛治疗显示更多的结构异常顶端区域的上皮细胞相比,谷蛋白alone-treated老鼠。此外,rt - pcr分析表明减少钙粘蛋白的RNA水平gluten-sensitized +吲哚美辛治疗老鼠。钙粘蛋白TJ形成和需要有越来越多的证据表明其作为调制器的TJ和肠道屏障功能[30],[31]。儿童钙粘蛋白表达降低与CD和醇溶蛋白已被证明改变它的表达式[32]。我们的研究结果支持假设谷蛋白和吲哚美辛在钙粘蛋白的表达,发挥作用,这种作用是强在遗传易感主机代理都一起管理。显著减少钙粘蛋白可能构成机制增强屏障功能障碍在gluten-sensitized和indomethacin-treated HCD4 / DQ8老鼠。

屏障功能的显著变化gluten-sensitized + indomethacin-treated老鼠在脾细胞文化伴随着IFN-γ增产与PT-gliadin孵化。这些结果表明转向温和系统性炎性状态。以前的研究已经表明cyclooxygenase-2 (cox - 2)端依赖花生四烯酸代谢产物是重要的在维护肠道免疫内稳态,尤其是饮食抗原的免疫调节[33]。因此,cox - 2抑制剂如消炎痛可能会加剧饮食抗原的免疫反应[33]。我们的结果使用在体外孵化的脾细胞与PT醇溶蛋白和消炎痛,然而,不支持直接影响吲哚美辛对脾细胞增殖和IFN-γ释放。因此,我们假设的转移的免疫反应可能是由于一个增强吸收腔的内容,包括共生的细菌,通过更多的结构性破坏和透水上皮。

腔的抗原和过度的肠上皮细胞调节渗透在粘膜免疫激活[16],[34]。标志着gluten-sensitized屏障缺陷小鼠用消炎痛治疗不仅可以让流入的增加麦胶蛋白肽在其他腔的抗原的上皮细胞也如肠道菌群与潜在的旁观者,促炎效应。无菌老鼠已报告有更高的阈值后肠道损伤吲哚美辛政府相对于特定的无菌老鼠(SPF)[35]。自抑制前列腺素没有那么严重的肠道微生物群,结果提高假说,肠道细菌加强indomethacin-induced粘膜病变的发展。因此,蠕动障碍引起的谷蛋白致敏[11]或吲哚美辛[36]和/或消炎痛引起小肠失调的能力[36],[37]可能会促进细菌易位。由于严重受损的肠道屏障gluten-sensitized和indomethacin-treated老鼠,渗透增加腔的细菌可能会扰乱自然共生的体内平衡肠道内促进炎性反应。SPF小鼠已被证明是系统无知的他们的肠道菌群由于地理和功能分离的粘膜免疫系统和系统性肠系膜淋巴结(MLN)[17],[38]。然而,我们的研究结果显示,低水平的系统性启动对肠道菌群发生在SPF小鼠与面筋或吲哚美辛。Gluten-sensitized老鼠,屏障功能是进一步扰乱了消炎痛治疗,戏剧性的展示系统启动他们的肠道菌群。因此这些数据暗示gluten-sensitization,结合消炎痛治疗,导致减少粘膜共生的菌群的控制。非甾体抗炎药可以减少巨噬细胞吞噬的特性[39]。因此,我们承认,可能除了肠道屏障功能的变化,吲哚美辛可能通过抑制巨噬细胞功能有双重影响,允许持久性活细菌,促进全身免疫反应对肠道微生物群。F4/80+细胞计数的固有层中谷蛋白+ indomethacin-treated老鼠显著增加(图S8,协议S1),然而巨噬细胞功能并不是评估。的确切身份共生的谷蛋白和indomethacin-treated老鼠系统准备在这个模型还不知道但没有IgM绑定沙门氏菌,缺席的共生的菌群老鼠,强烈建议IgM抗体的特异性共生的植物在我们的老鼠(图S7)。的临床相关性系统性无知对肠道菌群的损失还有待建立,然而,系统启动共生的植物代表着一个重大转变在正常主机和共生的细菌之间的关系[40]。因此,这可能表明一个新颖的机制,可能导致疾病的进展对主机。另一方面,特定IgM对植物可能是免疫系统的保护机制的一部分安装限制后续易位和广泛的炎症。额外的宿主因素,如一个潜在的免疫dysbalance,可能扮演一个角色在决定这种机制是否会变得不适应,导致广泛的炎症。最近的流行病学研究已确定,消费的非甾体抗炎药(非甾体抗炎药)是一个风险因素对肠易激综合症的发展[41]。迄今没有流行病学研究调查是否非甾体抗炎药的历史消费也是一个危险因素谷蛋白敏感性的千变万化的临床表现。

虽然肠道菌群的作用在肠道的其他慢性疾病显然成立(评论看到42)对异常的免疫反应的作用,同桌的谷蛋白和其他食物不耐症。最近的发现,然而,报告的杆状细菌粘膜的积极和稳定的乳糜泻患者而不是健康的控制[43]。在CD患者进行的一项研究显示血清学反应微生物抗原的存在,如反酿酒酵母anti-I2 (荧光假单胞菌)和anti-ompW,与健康对照组相比。有趣的是,微生物血清阳性也出现在对病人没有证据表明积极的CD。然而,年龄增加与sero-reactivity厌氧细菌,可能反映接触不同的环境抗原持续时间较长[44]。反的消失Saccaromyces cervisiae抗体(ASCA)后无谷蛋白饮食表明微生物sero-markers治疗粘膜病变有关[45]。然而,肠道功能障碍之间的因果关系,症状和微生物sero-responses CD还有待确定。有可能积累细菌产品有一个旁观者效应,降低免疫细胞激活的门槛[46],[47]。这方面,DQ8老鼠的一项研究表明,口服挑战干酪乳杆菌时粘膜致敏与醇溶蛋白和霍乱毒素加剧了Th1反应诱导模型中[48]。因此,它是可能的失调或变化时肠道菌群的组成蛋白致敏,不一定是一种病原体的存在,有助于增强gluten-induced免疫反应。微生物群组成的改变已经在CD患者与健康对照组相比[49],[50]。在这项研究中,我们观察到显著改变小gluten-sensitized小鼠肠道菌群的组成与吲哚美辛治疗。目前尚不清楚,然而,如果这些变化主要或次要的肠道功能异常在模型中观察到[11]。

总之,我们的研究表明,肠道屏障的环境改造中起关键作用决定面筋和肠道微生物群宿主免疫应答的抗原。旁观者腔的抗原,如组件的肠道菌群可能有助于增强炎症反应等饮食抗原蛋白。这种机制可能成为重要的遗传异常主机与长期障碍。结果值得进一步调查宿主基因型之间的相互作用,饮食和肠道微生物群。

材料和方法

动物

所有实验与麦克马斯特大学动物保健委员会的批准。男性表达hla dq8基因转基因小鼠(HLA-DQA1 * 0301;HLA-DQb1 * 0302)在缺乏内生鼠标二类基因或hla dq8 / HCD4双转基因小鼠[8],[51]。老鼠繁殖在传统的特定病原体自由殖民地麦克马斯特大学(SPF)和维护前至少2代育种在无谷蛋白饮食(Bio-Serv,新泽西州)。老鼠用8 - 14岁的周。雄性C57BL / 6小鼠购自泰康利(美国纽约哈德逊)(补充数据)。

敏化协议和消炎痛治疗

所有老鼠都不断用无谷蛋白饮食和水可用随意。

老鼠被注入腹腔致敏(ip) 500µg谷蛋白(安大略省Sigma-Aldrich)溶解在0.02毫米醋酸在50µl完全弗氏佐剂(CFA, Sigma-Aldrich安大略省)。敏化后一周,面筋挑战每周进行3次,胃内的强饲法,7周,使用2毫克的谷蛋白溶解在0.02毫米醋酸。消炎痛是由填喂法(鼓掌制药、安大略省)(3.5毫克/公斤)前24小时面筋的挑战。对照组由一个)non-sensitized老鼠(CFA)随后填喂法与大米麦片粥(2毫克/ 0.02毫米醋酸),b) gluten-sensitized老鼠随后填喂法与谷蛋白(2毫克/ 0.02毫米醋酸)c) non-sensitized老鼠(CFA)随后填喂法与吲哚美辛(3.5毫克/公斤)。

体外肠道通透性

两部分的空肠从每个鼠标被用于我们室的研究。简单地说,5厘米的空肠样本收集和分为两段。每段肠系膜边境开放,夷为平地,安装在一个我们室的0.6厘米2。组织是沐浴在含氧克雷布斯缓冲区包含10毫米葡萄糖(浆膜侧)或10毫米甘露醇(腔的一侧)37°C。20分钟后平衡时期,电导(G:女士/ cm2)记录。粘膜浆膜大分子运输是评估通过添加辣根过氧化物酶(合;II型、Sigma-Aldrich安大略省),常用的大分子标记,在腔的一面。浆膜样品每隔30分钟(500µl)获得了2小时。完整的合评估使用修改后的卫氏方法o -dianosidine盐酸盐(安大略省Sigma-Aldrich)作为底物,和浆膜粘膜通量计算根据标准公式和表达为pmol /厘米2/人力资源。

考试的上皮细胞损伤

空肠的部分,并立即获得固定在2.5%戊二醛在0.1 mol / L钠甲次砷酸盐缓冲(pH值7.4)2小时,转移到钠甲次砷酸盐缓冲和存储在一夜之间在4°C。组织随后被处理为电子显微镜和显微照片被准备。Ultra-structural上皮损伤评估在肠上皮细胞刷状缘的存在改变,线粒体水肿和紧密连接(TJ)形态。上皮损害是由透射电子显微镜(JEOL、东京)的肠上皮细胞从4 - 6部分动物的每个4学习小组。被打乱的线粒体嵴的数量在肠上皮细胞顶端区域的指望编码5000 x放大测量300µm显微照片2线粒体(125 - 250 /显微照片,5显微照片/鼠标、6小鼠/组)使用Adobe CS3扩展(加州奥多比公司)。改变线粒体的一部分,定义为被打乱的线粒体嵴数除以总数量的线粒体在一个视图中,计算了。线粒体为评价显微图的边缘被排除在外,因为他们的边界和区域可以准确地确定。打乱了TJ结构计算的分数总改变TJ除以总数TJ蒙蔽的方式评价20字段/鼠标(3 -紧密连接/字段,60 - 400紧密连接/鼠标,4老鼠/组)。一个字段定义为一平方EM网格,测量8100µm2。

顶端交界的分析定量实时PCR

总RNA从30 - 60毫克近端小肠部分孤立使用RNeasy迷你包(安大略省试剂盒)。互补脱氧核糖核酸合成使用M-MLV从2µg纯化总RNA逆转录酶(安大略省表达载体)。定量实时PCR进行1∶20稀释的互补。反应包括智商™SYBR绿色Supermix(安大略省Bio-rad)定量PCR引物在0.5µM, 1µl互补。放大使用iQ5执行实时检测系统在95°C 3分钟紧随其后的是37个周期在15秒94°C, 55°C (ZO-1)或58°C(上皮)或59°C (GAPDH) 20岁和72°C 25 s。问使用以下执行实时PCR引物:ZO-15′-AGGACACCAAAGCATGTGTGAG-3′/和3′-GGCATTCCTGCTGGTTACA-5′;

钙粘蛋白5′-GCACATATGTAGCTCTCATC-3′和5′CCTTCACAGTCACACACATG-3′。GAPDH5′-CCATGGAGAAGGCTGGGG-3′和5′-CAAAGTTGTCATGGATGACC-3′被用来看家基因。CT值报告iQ5软件被用于这项研究。为每个扩增子PCR效率测定通过串行稀释10倍cDNA然后放大cDNA使用引物感兴趣的基因和看家基因。使用Pfaffl相对表达水平计算方法[52]每个引物组校正效率,使用其他软件[52]。熔解曲线分析是由加热反应从50°- 99°C 0.2°C的间隔而监测荧光。

脾细胞增殖,细胞培养和细胞因子分析

Peptic-tryptic消化的醇溶蛋白(PT-gliadin)准备如前所述[54]。脾细胞收获和培养(4×105细胞/)在96年组织文化板块在37°C, 5%的公司272 h的存在与否500µg /毫升PT-gliadin和/或5µg /毫升吲哚美辛。文化是脉冲与1µCi / (3H]胸苷18 H。培养细胞收获到玻璃纤维过滤器使用Filtermate收割机(马萨诸塞州剑桥技术)。与β放射性合并决心闪烁计数器(加州贝克曼)。结果表示为刺激指数(SI)和计算:如果=(平均cpm一式三份的文化包含抗原)/(平均cpm单独的细胞培养介质)。

脾细胞上清液收集后48 h孵化有或没有PT-gliadin和/或吲哚美辛。促炎细胞因子的存在在上层清液用促炎CBA工具包(BD生物科学,加州)和分析使用BD FACSarray生物分析仪系统(BD生物科学,加州)。

荧光原位杂交(FISH)

寡核苷酸探针进行了总结表S1。类属特异性的探针标记的5′端与异硫氰酸荧光素(FITC),显示绿色荧光。EUB 338调查,针对细菌域内的保守序列,作为积极的控制[55]。非EUB 338探针作为负控制来消除背景荧光[56]。控制探针都贴上标签在5′末端吲哚菁染料Cy3,显示红色荧光,或用FITC。整除36µl固定样本4µl孵化的荧光探针(50 ng /µl)杂交方案(10毫米Tris-HCl, 0.9 M氯化钠,pH值8.0和10% (w / v)钠十二烷基硫酸盐)在合适的温度(45 - 50°C)。与400年之后,细菌细胞被孵化µl清洗解决方案(10毫米Tris-HCl, 0.9 M氯化钠,pH值8.0)在50°C 30分钟来消除非特异性结合的探针。杂化细胞终于颗粒状的离心5分钟(12 000克)和400毫升的PBS resuspended流式细胞仪检测。细菌群体被结合每个枚举FITC-labelled类属特异性的探针与EUB 338 - cy3探针,并表示与FITC-labelled特定细胞的比例组合探针与EUB细胞组合338 - cy3探针。这一比例被减去背景荧光得到纠正负控制探针非EUB 338[57],[58]。流式细胞术检测进行使用anEPICS®XL-MCL流式细胞分析仪(美国佛罗里达州贝克曼库尔特)如前所述[58]。这个仪器配备了两个光散射检测器测量前进(FSC)和侧散射(SSC)和荧光检测器检测适当过滤光绿色(FL1 525海里)和红橙色波长(FL3 620海里)。事件率保持在最低设置每秒(200 - 300年的事件),以避免细胞巧合。总共000事件记录在列表模式文件和分析与系统II V.3软件(贝克曼库尔特)。

统计分析

统计分析是使用方差分析与事后测试执行简单和多个比较,分别。非参数统计学意义相对RNA表达的计算与其他软件[53]由一个成对固定的重新分配与50000重复随机化试验。数据意味着±标准错误(SEM)。

支持信息

图S1。

在七周期间的体重增加。gluten-sensitized和消炎痛治疗的小鼠表现出减少的体重相比non-sensitized控制。Gluten-sensitized老鼠用消炎痛治疗相比表现出更明显体重增加缺陷控制和Gluten-sensitized和吲哚美辛治疗老鼠。数据代表10老鼠的意味着±SEM /组。

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0006472.s001

气管无名动脉瘘管的(0.08 MB)

图S2。

电导和C57Bl / 6小鼠合通量。谷蛋白和/或消炎痛治疗并没有导致组织电导的变化。吲哚美辛治疗小鼠合通量增加,但不是在谷蛋白致敏的小鼠没有吲哚美辛。数据代表10老鼠的意味着±SEM /组。

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0006472.s002

气管无名动脉瘘管的(0.09 MB)

图S3。

相对于non-sensitized ZO-1 RNA表达的控制。无显著差异时看到每个治疗组RNA表达分析相对于non-sensitized控制。数据代表6小鼠的意味着±SEM /组。

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0006472.s003

气管无名动脉瘘管的(3.00 MB)

图S4。

脾细胞增殖与PT-gliadin孵化后和/或吲哚美辛。刺激单独使用消炎痛不会增加gluten-sensitized小鼠脾细胞增殖。体外刺激PT-gliadin和消炎痛,没有进一步加强细胞增殖而PT-gliadin孤单。数据代表6小鼠的意味着±SEM /组。

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0006472.s004

气管无名动脉瘘管的(0.07 MB)

图S5。

IFN-γ水平上层清液培养的脾细胞与PT-gliadin孵化后和/或吲哚美辛。刺激单独使用消炎痛没有增加IFN-γ生产gluten-sensitized老鼠。体外刺激PT-gliadin和消炎痛没有增加IFN-γ水平相比,PT麦胶蛋白。数据代表6小鼠的意味着±SEM /组。ND =没有检测到。

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0006472.s005

气管无名动脉瘘管的(0.07 MB)

图S6。

系统性共生的抗体。Gluten-sensitized + indomethacin-treated老鼠表现出增加血清抗体有氧和厌氧细菌所评估的平均荧光强度的信号APC-labelled anti-IgM(1∶20血清稀释)。消极的控制包括血清(−):没有血清和细菌(−):没有细菌。数据代表6小鼠的意味着±SEM /组。

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0006472.s006

气管无名动脉瘘管的(0.11 MB)

图S7。

积极的和消极的系统性共生的抗体。(A) M557沙门氏菌,这是一种病原体没有出现在我们的hla dq8 / HCD4老鼠殖民地,是彩色吲哚美辛+蛋白治疗小鼠的血清抗体。结果表明缺乏积极的沙门氏菌抗体,因此这项技术的特异性。(B)沙门氏菌M557是彩色M557沙门氏菌感染小鼠的血清抗体。结果表明缺乏积极的沙门氏菌抗体。

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0006472.s007

气管无名动脉瘘管的(0.09 MB)

图S8。

免疫组织化学F4/80 +细胞。染色F4/80 +蛋白致敏的小鼠中却在增加。最显著F4/80 +细胞浸润在gluten-sensitized老鼠用消炎痛治疗。数据代表6小鼠的意味着±SEM /组。代表的巨噬细胞浸润在固有层(A) (B)控制老鼠gluten-sensitized老鼠(C) indomethacin-treated老鼠(D) gluten-sensitized +吲哚美辛治疗老鼠。

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0006472.s008

气管无名动脉瘘管的(0.47 MB)

表S1。

寡核苷酸探针杂交条件用于FCM-FISH肠道细菌的分析。

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0006472.s009

(0.06 MB的医生)

协议S1。

对巨噬细胞免疫组织化学。

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0006472.s010

(0.03 MB的医生)

确认

我们承认马库斯Geuking、茱莉亚Cahenzli和德帕尔马的优秀的援助。

作者的贡献

构思和设计实验:EFV。进行了实验:JMN XH ES JJ YS EFV。分析了数据:JMN XH ES JJ y PY KDM EFV。造成试剂/材料/分析工具:y CD JM KDM EFV。该报写道:JMN JM KDM EFV。

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