介绍

人类结肠包含10个¹⁴细菌[1]。他们扮演了重要的角色在剩余的发酵食物,肠道免疫功能的调制,和防止病原体和疾病[2]- - - - - -[5]。肠道菌群在很大程度上是有益的,虽然细菌种群的改变或细菌新陈代谢的产品可能导致疾病。

1971年,一项研究旨在识别人类微生物群组成和结直肠致癌作用之间的联系,但它不得不被放弃,因为技术上的困难。之后,摩尔和同事报道,13细菌物种明显与结肠癌的风险高和西方饮食[1]。然而,他们的研究结果是有点牵强,因为他们少量的调查主题和没有进行肠道调查即放射学或结肠镜检查。尽管如此,这项研究以来,人类结肠微生物群已成为一个主要的环境因子,调节结肠癌的风险,并在肠道微生物群失调是现在被认为是一个潜在因素疾病遗传易感性个体的发展。然而,没有证据是否失调确实发生在结肠癌。

只有一组限制的细菌种群在自然界中已确定在人体和大约80%的人类细菌通过分子识别工具即宏基因组测序,被认为是uncultivable[6]。尽管一些普遍的细菌物种在正常个体现在被使用全基因组测序[7],超过60%的物种仍然未知,没有数据如何失调,如果有的话,可能会发生在结肠癌患者。因此,DNA测序,目标在小ribosomal-subunit RNA基因变异度高的地区,特别是16 s rRNA基因使得描述微生物群的生物多样性成为可能,这可能导致疾病(评论,看到裁判[8])。16 s rRNA基因是一个核糖体组件,在所有细菌是守恒的,和它包含变量序列具有物种特异性。根据这种技术主要类群在人类肠道微生物群被报道leptum梭状芽胞杆菌,Clostridium球菌样的,的拟杆菌/普氏菌组织和双歧杆菌属属[9]。实时定量PCR (qPCR)方法已经适应评估这些细菌的数量在大量的样本[10]- - - - - -[11]和微生物群的变化组件现在可以学习与健康和疾病状态。物种参与将影响实验和代谢研究新的病理生理学方法。例如,拟杆菌人口,更具体地说脆弱拟杆菌,最近被证明产生metalloprotease在结肠癌患者中,但不是在控制[12]。这种细菌物种已被证明导致肠道粘膜监管t细胞反应涉及TH17细胞招聘在动物身上[13]- - - - - -[14]强烈暗示他们可能会改变体内平衡肠道的效应辅助t细胞的数量[14]- - - - - -[15]。

通过焦磷酸测序技术,我们报告证实直肠癌疾病与失调主要是由于改变占主导地位和亚优势物种。通过使用qPCR,我们比较肠道细菌社区在正常个体和那些结肠癌迄今为止最大的系列报道和节目水平的失调占主导地位的微生物群的物种。我们把这些结果与粘膜免疫内稳态和角度凳子大规模筛选的标志。

结果

讨论

我们报告的差异在结肠癌患者的结肠微生物群与那些正常的结肠镜检查。我们表明,细菌属的微生物群的分布不同,取决于他们的疾病状态和qPCR显示重要的高度拟杆菌/普氏菌人口在癌症患者,似乎与高架IL17产生粘膜细胞的癌症患者。

本研究比较个人表现与正常或患病的结肠镜检查。尽管那些正常的结肠镜检查是不健康的志愿者,他们可以被认为构成有意义的对照组。这是因为他们被随机选择在连续的人被称为结肠镜检查发现是正常的。为了减少偏见我们选择2正常个体1癌症病例。特征匹配的患者在癌症组织,除了他们的年龄和息肉或癌症病例的亲戚。年龄差异反映了文学的流行病学数据。细菌失调中发现我们的研究显然是独立于年龄。在这项研究中没有观察到的微生物的差异随着年龄的增长有关。情况下和控制问题的另一个区别在于肿瘤的患病率更高结肠癌病人的家属。这可能反映了环境因素的作用而不是胚基因改变,因为没有一个病人皮肤红斑(merrill Lynch)或息肉病拥堵的腺瘤家族综合征的疾病。

高通量测序技术对人类微生物群已大大有助于揭示不同细菌的系统发育的核心在正常个体和那些患有各种各样的疾病[7]。但是这种方法不包括癌症的疾病。为了验证系统的核心是不同的在健康个体和癌症患者,16 s rRNA基因已经通过焦磷酸测序获得的目标代替所有细菌基因组测序。事实上,V3-V4变量地区16 s rRNA可以用来提供一个细菌的人类微生物群的分类[17]的基础上,焦磷酸测序。通过使用这种技术,我们清楚地识别出了40000多个信息序列V3-V4 16 s rRNA粪便样本基因区域,在目前的研究中,这导致了系统建设的微生物群的核心[16]。这个系统的核心是不同的癌症患者与正常个体。有关差异特别是主导和子占主导地位的细菌的数量。很可能,我们发现通过焦磷酸测序获得的差异可能是假象,因为所有的患者包括通过标准化程序(性别和年龄条件的凳子上采样和DNA提取)和序列相似性副本(person-variation)非常高。因此,主要组织,属和物种的主导和子占主导地位的细菌种类,量化了qPCR现在经常用来量化的细菌组成的微生物群健康或患病的人或动物[9],[18]。“所有细菌的密度在粪便样本中没有反映出结肠镜检查发现,尽管一个(即。拟杆菌)的七个物种调查被发现高在癌症组个体。所有这些方法验证,经常使用[6]。虽然焦磷酸测序技术,它应该被视为一种半定量工具显示其他细菌种类变化,只有主要主导和亚优势物种被qPCR目前的量化研究。此外,分子分析包括与探针渗透率的差异,和放大特性,因为相对较少的探针可用于分析许多无特征的物种[19],我们不能排除这种可能性,我们可能错过了其他重要微生物密度的差异。这不能排除患者组之间差异的可能性的细菌类群或物种现在呼吁进一步调查的基础上,高通量测序结果癌变和控制微生物群。核糖体rna基因测序可以探测到占主导地位的社区成员,但这些方法可能无法发现的罕见的一个社区的成员不同的目标序列。克服的局限性单通过焦磷酸测序获得的基于基因的扩增子测序、全基因组鸟枪测序已经成为一个有吸引力的战略评估复杂混合人群的微生物多样性[7]。然而,这是最大的微生物调查报告到目前为止,和大量的受试者中已知的结肠镜检查和组织病理学特点使其非常健壮,可以打开新的病理生理的字段和筛选标记的方法。

之间的关联的原因拟杆菌/普氏菌组织密度高度评估qPCR和结肠恶性肿瘤还不清楚。所有的引物用于qPCR本研究旨在量化主导和亚优势种通过焦磷酸测序获得的建议方法。这种微生物的差异是否在当前研究中发现在结肠镜检查问题的原因或结果肿瘤发现这里并没有设计成分析机械的方法,需要前瞻性研究。然而,我们可以推测拟杆菌/普氏菌群体密度可能不是肿瘤发生的后果,因为他们的水平和肿瘤大小或疾病分期和没有联系拟杆菌属物种从洗可探测到粘膜表明它属于粘膜附着细菌组。引物设计的目标拟杆菌和普氏菌属人口。的变化普氏菌只有在口腔和胃腔[20]没有任何与肿瘤的生长。相比之下,拟杆菌属人口,更具体地说脆弱拟杆菌,最近被证明产生metalloprotease在结肠癌患者中,但不是在控制[12]建议这个物种子人口可能致癌。值得注意的是在许多机制可能调解微生物群和人类健康之间的联系[21]- - - - - -[22]、促炎症和免疫细胞的激活在结肠粘膜的重视与恶性肿瘤的关系。肠道微生物群的一些成员可能会使宿主t细胞反应[13],[15]其他人可能维持体内平衡的效应辅助t细胞数量在肠道[14]。b . fragilis已被证明导致肠道粘膜监管t细胞反应涉及TH17细胞招聘实验模型[13]- - - - - -[14]。感兴趣的mucosa-adherent拟杆菌物种在我们的研究中出现在结肠癌患者高于正常结肠镜检查个人的比例与粘膜IL17免疫反应性的细胞密度。这是符合我们先前的研究在人类,TH17细胞过度报道在80%以上的零星的结肠癌微环境[23]。IL17免疫反应性的细胞渗透更多同源正常结肠粘膜的结肠癌患者比正常组织在正常结肠镜检查个人评估由粘膜免疫组织化学或mRNA qPCR量化(数据没有显示)。这些可能表明t细胞激活可以关联到粘膜IL17改变由于拟杆菌在动物模型中报道[13]- - - - - -[14],[21]- - - - - -[22]。简单地说,这些数据提出的干扰免疫反应在结肠癌组织IL-17生产过剩加剧[24]- - - - - -[25]这种疾病可能由于拟杆菌。

额外的微生物群的有趣的方面是它的潜在价值的标记结肠癌因为大多数病人可以被识别的海拔拟杆菌/普氏菌人口的可能性基于特异性定量测试截止率。而结肠镜检查到目前为止的海拔拟杆菌在凳子上和/或IL17正常粘膜免疫反应性的细胞似乎有前途的敏感标记。

方法

从2004年9月到2006年9月,648人平均或高于平均风险CRC(例如癌症史的亲戚或息肉的个人历史,或任何腹部或肠道相关症状或贫血需要结肠镜检查),包含在样本银行收集研究。才有资格加入,患者没有先前的结肠或直肠手术史,疾病比如癌症、炎症或感染肠道的损伤,而不是需要紧急结肠镜检查。两周结肠镜检查前,患者包括知情同意后,被要求给一个新鲜粪便样品2周内结肠镜检查前三天。伦理委员会批准的这项研究是瓦尔德马恩Paris-EST区域授权招收患者在所有相关的中心。所有患者接受的信息研究,其目标,他们应该给样品。所有信息是由输入字母写在法国和取得正式同意在形式一式三份副本;其中一个是守恒的病人,我们保留一个副本的临床研究(CIC)和最后一个副本是守恒的启动子(medicine-INSERM国家科学研究所)。所以,正式同意对每个病人可用。在所有情况下收集粪便样本对结肠镜检查前肠道清洗。任何特定的饮食(糖尿病患者,素食者)和药物(抗糖尿病药物、hypocholesterolemics和泻药)在此期间都被记录下来。 An anesthetist visited the participants at least three days prior to the scheduled colonoscopy. The study period continued until colonoscopy and pathology data had been checked, and the final status could be assigned as “normal colonoscopy”, “Tumour at colonoscopy” or “other abnormalities at colonoscopy”. They were held in a collection bio-bank for pathophysiology or test screening studies, including the one reported here. After gender matching between individuals with tumoral and normal colonoscopies, samples from 180 patients (one cancer patient for 2 individual with normal colonoscopy) who were checked not taking antibiotics with either “normal” or “cancer” findings were subjected to bacteria DNA analysis in the current series.

支持信息

确认

我们要感谢m·古森斯k . Leroy r . Inchitti h·曼苏尔,b . Coste b . Ghaleh-Marzban o . Montagne:毫升,Auriault太Chaumette, s . Vialette f . Bouabbas j . Francese r .剑t . Aparicio d . Abdelrahman h . Hagege Courillon锤,杰。Dupas, r . Benamouzig m . Cavicchi Cl。奥特曼,e . Zrhien g . Tordjman f .威尼斯f . Uzzan d . Gilot p . De Fleury m . Algard m .普列托m .小j . Samama d·露西安JC。Delchier m . Levy a Charachon本研究有用的贡献。我们还要感谢先生丹尼斯Mariat筹备qPCR分析细菌的DNA和他的贡献。合作小组的学术和社区肠胃科Ile法国;中心医院完成intercommunaux(时尚),维伦纽夫圣Georges-CVSG et universitaire-CHU中心亚眠,Groupe de gastroenterologues liberaux杜瓦·马恩- ValdeGast Appomad导致患者纳入本研究。