数据
文摘
背景
当我们的肠道菌群在疾病的知识积累,微生物群在健康受试者的基本信息仍然是稀缺的。本研究的目的是描述健康成年人的肠道微生物群,专门解决其时间稳定,核心症状与肠道微生物群和关系。我们进行了纵向研究按照芬兰一组15名健康的受试者为7周,定期评估他们的肠道细菌和古细菌与人类肠道(打击)芯片,系统芯片,结合qPCR分析。肠道的健康观念和发生症状问卷被记录在每个采样点。
引用:Jalanka-Tuovinen J, Salonen Nikkila J, Immonen O, Kekkonen R,拉赫蒂L, et al。(2011)在健康成人肠道菌群:时间关系分析揭示了个人和共同核心和肠道症状。《公共科学图书馆•综合》6 (7):e23035。https://doi.org/10.1371/journal.pone.0023035
编辑器:Stefan Bereswill Charite-University医学柏林,德国
收到:2011年4月12日;接受:2011年7月4日;发表:2011年7月28日,
版权:©2011 Jalanka-Tuovinen et al。这是一个开放的文章下分布式知识共享归属许可条款,允许无限制的使用、分配、和繁殖在任何媒介,被认为提供了原作者和来源。
资助:这项工作是由芬兰技术和创新资助机构(tek;格兰特数量40274/06)。http://www.tekes.fi/en/community/Home/351/Home/473。报告的作者之一(爱)是受雇于一个商业公司(Valio有限公司),导致了研究设计和样本收集。投资者没有参与数据收集和分析,决定发表,或准备的手稿。
利益冲突:报告的作者之一(爱)是受雇于一个商业公司(Valio有限公司)。这并不改变作者的坚持所有的PLoS ONE政策共享数据和材料,和本文的内容既不影响也受到这一事实。
介绍
出生后,我们的胃肠(GI)束聚居着大量的微生物,集体称为(GI)微生物群,发展亲密的互动与我们的身体,有利于我们的健康和幸福[1]。改变胃肠道微生物群已经检测到不仅在肠道畸变,如炎症性肠道疾病[2]和温和的肠易激综合征(IBS)[3],[4]而且在系统性疾病,包括2型糖尿病和其他代谢疾病[5],[6]。由于胃肠道微生物群的健康相关性,其多样性和功能的描述是积极持续的最近发展分子高通量技术,下一代测序技术等16 s rRNA扩增子和系统发育微阵列[7],[8]。
几项研究试图描述正常胃肠道微生物群在健康个体,但由于强大的个体变异,低分辨率的测量方法和有限数量的样本任务具有挑战性。微型和相对时间胃肠道微生物群的稳定性已经建立了用分子的方法[9]- - - - - -[14]。整个微生物群的时间稳定性表明单个核心的存在,微生物保留在一个个人组成的[7]。时间稳定也反映了生态系统的弹性;甚至强烈扰动,如抗生素主要是短期效应占主导地位的微生物群[15]- - - - - -[17]。有证据表明之间的负相关时间跨度和单个微生物群相似规模已经几个月[13],[18]可能反映环境扰动的累积效应。
肠道症状及其可能的发生影响的健康个体的生活质量在很大程度上是未知的。在美国的调查显示,近一半的普通人群报道一个或多个肠道症状在一个月内,最常见的抱怨是腹泻,腹部疼痛或不适,腹胀或膨胀[19]。肠道问题在健康受试者的高患病率表明他们的一般健康产生重大影响。因此,肠易激综合症的病人,患有各种肠道症状,明显受损的生活质量相比[20],[21]。健康相关的生活质量(HRQoL)可以测量与验证问卷评估主体的将军,心理和社会福祉[22]。是特别相关的肠道健康研究的新兴交叉学科[23]发现健康个体的肠道症状严重程度的影响他们的生活质量以及是否发生肠道症状相关的胃肠道微生物群组成。
胃肠道微生物群特性的一个基本问题是共同核心微生物群的存在,我们都可以共享。到目前为止提出了研究的共同核心胃肠道微生物群是基于库存16 s rRNA基因序列的分析[12],[14],[24]- - - - - -[27]或系统发育微阵列分析[13]。大多数的研究表明只有一小系统发育个体之间的重叠。胃肠道微生物群的基因库,反过来,出现保存在个人建议功能冗余的生态系统[8],[12]。然而,变量丰富物种之间迄今为止忽视,尽管其关键影响是否检测到一个特定的物种在一个给定的分析深度和因此,共享程度的细菌。测序深度的增加可以显著增加核心的大小,因为它导致了报道的那些phylotypes低丰度的一些人[8]。很难比较现有的共同核心的研究,因为研究对象的数量不同,他们的健康状况还未确定和所需的患病率为核心的物种尚未定义[8],[12],[24]。此外,结果受到方法论方面的影响包括DNA提取方法[28],[29],选择16 s rRNA的高变区[12]的报道所选引物,分析深度[8],[25],系统分配和自动切断值[30],选择生物信息学管道[31]。结果变量的研究结构,目前还没有一致的共同核心胃肠道微生物群的大小和构成。
本研究扩展了目前整个微生物群的时间动态的概念,其个别成员,基于频繁采样和全面的微生物群与系统发育分析微阵列。此外,我们分析第一次,据我们所知,肠道菌群与肠道症状之间的关系在健康的成年人。我们观察到丰富的几个类群与肠道症状包括腹痛和腹胀。我们也添加一个新颖的视角特性的共同核心微生物群。我们使用sequencing-independent技术和一种新的计算方法,它并不局限于标准前缀phylotype丰富或流行,而是研究这些分析参数如何影响结果的核心大小。深度和我们的研究结果强调的影响分析表明,也包括小的微生物群的时候,相当比例的肠道phylotypes似乎在个人之间共享。
结果
定义的健康状况
监测受试者的健康,我们让参与者记录他们的将军,肠道,在每个粪便取样点和情感上的健康状况。关注健康,毋庸置疑,排除了潜在的混杂样本进一步分析,我们计算了HRQoL评分和利用他们在平行于背景信息对参与者进行分类(表1)。15的参与者,九个科目合格的健康根据他们的一般健康得分高与芬兰的参考价值[32]、高(> 90)胃肠道健康得分,并且没有任何不良事件在研究期间。剩下的受试者被视为破坏:9接受抗生素治疗,和主题2和4遭受相当大的肠道症状(腹胀、便秘、腹痛)相比,减少他们的胃肠道健康成绩显著的健康(t检验p值< 0.05)和负面影响他们的一般健康感知(表1)。其余三个受试者被列为妥协的基础上,结合探索性HITChip数据分析和背景信息(见下一节)。
受试者的肠道菌群的比较分析
获得相似的概述的所有研究对象之间总胃肠道微生物群,我们无人监督的分组预处理HITChip概要文件(见方法和图S1)使用层次聚类和相关距离方法(图1)。最大的差异微生物群资料inter-individual差异(意味着inter-individual皮尔逊相关性;r = 0.78,标准差;±0.04)。所有样本集中在subject-wise方式(图1),整体的稳定性和高个人的观察微生物群(意味着个体内部r = 0.96±0.02在所有时间点)。
subject-wise集群突出显示框显示时间变化和可变长度的分支。红色画垂直线皮尔逊相关性为0.925,低于自身内在的样本相似性检测只在五不稳定对象(5、6、8、9和11)讨论的文本。
尽管整体稳定性我们发现大量的变异在受试者的微生物群的时序动态可视化的可变长度的聚类树的分支。主题9在抗生素在第四个样本的收集,显然从其他样品分离(图1)。两周前还前面的示例了支深深地在系统树图暗示一个独特的微生物群的概要文件。当时的主题并不是药但生病了,几天后诊断为链球菌咽炎。除了抗生素治疗,我们观察到微生物群组成之间没有相关性或稳定性和记录药物(科目1、3、7和11收到定期甲状腺或雌激素荷尔蒙,或高血压治疗)。时间稳定下降也观察到在受试者5中,6、8和11 (图1)。对于所有这些主题,除了主题5,稳定的减少可以解释的背景资料。受试者6,8 - 11的记录在第一次旅行几个星期的审判过程中,通过不同时区的1 - 7小时。前后样本之间的相似性之间的旅行在统计学上显著低于样本2到4周后旅行(r = 0.90±0.02和0.96±0.02,分别;t检验p值< 0.05)(图S2)。因此,旅客显示显著降低自身内在的稳定性比九个健康受试者胃肠道微生物群(r = 0.93±0.01, 0.96±0.02,分别;t检验p值< 0.05),这表明胃肠道微生物群是旅游的影响。因此,尽管旅行者是健康的,我们分类他们在这种情况下,妥协与三个科目受抗生素治疗或持久的肠道症状(表1)。这样分类的基本原理是将微生物群组成分析集中在那些健康受试者的我们没有观察到任何可追踪destabilizers。
微生物群组成分析
胃肠道微生物群在九毋庸置疑,健康受试者详细分析了使用HITChip物种分类单元的信号强度,我们以下术语phylotypes(三级发展史方法和[13])。我们检测到平均470 phylotypes /主题,占总数的68.4%的phylotypes传递信号阈值(图S1)。最丰富的门在厚壁菌门的研究对象包括超过80%的贡献总微生物群,其次是平均10%的拟杆菌门和1.5%的放线菌(图2)。Verrucomicrobia和变形菌门被发现与比例份额低于1%(数据没有显示)。正如预期的那样,最丰富的厚壁菌门的成员XIVa集群和集群IV梭状芽胞杆菌,梭状芽胞杆菌组成的平均比例为40%和35%的总微生物群,分别。
相对丰富的phylotypes贡献了超过0.5%的总HITChip信号是总结门水平,除了厚壁菌门,总结类或集群级别梭状芽胞杆菌(左轴)。产甲烷菌的qPCR-based量化显示在右轴。
基于Methanobrevibacter您定量PCR (qPCR),肠道产甲烷菌是存在于个人的80% (12/15)。在一个主题(主题2;图2)产甲烷菌只发现在一个计算,而其他航空公司11日他们在所有时间点。产甲烷菌的丰度不同运营商之间的两个数量级,从log10项7.1到10.2 g - 1粪便级。的相对比例总胃肠道微生物群的产甲烷古菌是由16 s rRNA基因拷贝数的比值的产甲烷菌和总细菌。产甲烷菌的比例低于1%,大部分的样品在14个主题所代表的产甲烷菌总数的1 - 5%社区的时间点。
时间变化的健康的微生物群和个体的核心
我们分析的影响时间9名健康受试者中的微生物群变异通过确定的相似HITChip个体内样本之间的配置文件。相似之处是由所有可能的相关系数计算时间间隔从一到七周。平均个体内皮尔森相关范围从0.96 (±0.02;一周时间间隔)到0.95 (±0.02;七周时间间隔),只显示一个轻微的,非重要,减少微生物群相似。为了解决个人核心组成的微生物保留一段时间后,我们决定taxon-specific颞可变性通过计算变异系数(x)中为每个phylotype主题。浸的范围从0.83%(无教养的瘤胃球菌属callidus如细菌)到46.1% (phylotype内无教养的梭菌的)平均为6.3%(±1.1%),加强了整体稳定性高。在50个最稳定genus-level类群/主题,最常见的统计丰富genus-level组瘤胃球菌属obeum和亲戚(rel。),隶属于最近重新命名属Blautia[33]平均浸3.7%,梭状芽胞杆菌symbiosum rel。平均浸4.4% (表S1)。没有其他稳定genus-level分类单元共享> 50%的健康受试者,指示subject-specificity稳定的物种,即个人的核心微生物群。同样的,我们确定了50统计学意义,暂时最不稳定phylotypes每个健康的主题(表S2)。最常见的不稳定genus-like类群是无教养的梭菌的拟杆菌vulgatus rel。(浸9.9%),但即使是他们共同的只有少数人。不仅共性,但也不稳定组的实际浸大inter-individual比稳定的变化,表明没有genus-level集团一般不稳定。一些genus-like团体,包括f . prausnitzii rel。,在稳定和不稳定的分类单元列表(表S1和S2),突显出大时间行为的个体变异这些类群。相比之下,产甲烷古菌出现暂时的非常稳定的载体之一,随着个体内浸计算从qPCR数据仅限于一定范围的1%到6%。
肠道症状之间的相关性和胃肠道微生物群
尽管良好的一般健康的参与者,15中只有一个对象在研究期间没有经历任何肠道投诉(主题1;表1)。然而,偶尔和温和的肠道问题主导的答案只有两个受试者肠道健康得分低于90 100 (表1)。检测到特定的肠道症状相关的细菌,我们相关HRQoL-questionnaire分数和微生物群使用HITChip数据从所有15个主题。我们可以识别170 phylotypes,统计上显著相关(q < 0.005)与14 HRQoL-questions有关肠道症状(图3)。重要的相关性是最常发现一般肠道不适,迫切需要排便,餐后丰满,腹部疼痛。约有一半(53%)的170 phylotypes相关负面症状,表现出更高的丰度在缺乏症状。的负面关联genus-like类群包括双歧杆菌、r . obeum rel。,链球菌宝rel。,rel。梭状芽胞杆菌(主要是由于不致病的irregularis梭状芽胞杆菌)和Ruminococci。另一半显示正相关与观察到的症状,症状发生时探针强度更高。所代表的积极关联phylotypes主要成员的集群IV和XIVa梭状芽胞杆菌,其中的无教养的成员f . prausnitzii rel。和c . symbiosum rel。是最主要的群体。
热图可视化的所有重要(核反应能量< 0.005)枪兵肠道症状之间的相关性和HITChip-measured大量细菌phylotypes。每一行代表一个phylotype genus-level作业下面列出的行,或在中间几行引用同一个genus-level组。之间的负相关性症状所示红色和黄色的正相关性;非重要相关性以灰色显示。
我们下一个旨在识别相关的细菌最常见的症状有经验在我们的调查中,即膨胀(31 8的投诉对象)和腹部疼痛(28投诉8科目)。腹胀,记录投诉的严重程度不同的强烈不适(2记录)轻微的症状(23记录)。几无教养的phylotypes从集群IV和梭状芽胞杆菌XIVa与肿胀有显著正相关(表S3)。丰富的phylotypes内部Anaerotruncus colihominis rel。,瘤胃球菌属callidus和毛螺菌属pectinoschiza rel。是膨胀时记录高10倍以上。
受试者出现了腹痛在不同程度的严重性记录投诉范围从非常强烈的扰动(1记录)轻微的症状(20记录)。最惊人的发现与腹部疼痛是与大量的双歧杆菌的负相关(r =−0.45±0.03;表S4和图3)。大多数的双歧杆菌属phylotypes上面的检出限(14/21)有统计上显著的(问≤0.02)负相关和腹痛。受试者经历了痛苦已经超过五倍(平均5.4±1.3)更少的双歧杆菌相比,受试者没有记录疼痛(图4一)。此外,genus-specific qPCR,覆盖大部分培养这一组的成员,显示一个统计上的显著差异和褶皱的变化两个(Wilcoxon测试p < 0.05) Bifidobacterial计数状态(根据症状图4 b)。
样本分为两组:有或没有并发腹痛,双歧杆菌的数量每组决心使用一个。HITChip和B。qPCR。组之间的差异具有统计学意义(q≤0.02;在B p < 0.05)。这个盒子从第25百分位延伸到第75个百分位,在中间一条线;胡须程度最高和最低值。
除了双歧杆菌,phylotype内部r . lactaris rel。第四,梭状芽孢杆菌集群,显著减少痛苦的样品(表S4)。之间的正相关性,无教养的,潜在的致病性phylotypes内无教养的梭菌属的二世Anaerotruncus colihominis rel。和r . callidus增加了十倍当痛苦被记录(表S4)。c . symbiosum和未受教育的phylotypes附属f . prausnitzii rel。更丰富的主题体验餐后饱腹感(图3)。餐后饱腹感之间的正相关和丰富的f . prausnitzii证实了qPCR(数据没有显示)。腹胀和腹痛的症状评分相关强烈(ρ= 0.72)。四genus-level梭菌的组显著相关的症状,尽管在非均匀方向(表S3和S4)。
《共同核心微生物群
深入的系统发育微阵列分析提供了机会去探索之间的共同核心微生物群可能是健康的人。目前的大部分努力确定和定义核心集中在微生物的存在和缺乏phylotypes定义比例的研究对象。而不是使用任意标准phylotypes的丰富和流行,我们共同解决核心微生物群使用一种新颖的方法,利用可调这两个参数的值。考虑到相对丰富,我们使用的全部动态范围HITChip微阵列和合并的phylotypes最低估计总信号的占0.02%而最主要phylotypes超过5%的相对丰度。关于流行,我们适应所有可能性在0 - 100%之间(n = 0 - 9)。每人的平均HITChip六个时间点的数据。因此,共同核心的大小不是一个数字,而是一个连续体从0到数百,根据选定的丰富和流行值作为可视化角度图(图5一个)。的患病率为50%,只剩下10 phylotypes共同核心当最低数量是高达0.5%的估计信号。另一方面,当所有上述phylotypes接受检测极限,改变患病率从50%至100%的患者拥有了更核心phylotypes数量的影响。换句话说,共享phylotypes数量急剧减少当phylotype需要很高的丰度在所有样本,强调在核心low-abundance细菌的贡献。
一个。角度情节用于可视化的数量如何phylotypes共同的核心是一个函数选择的丰富和流行。浅灰色显示的地方没有phylotypes通过给定的标准。健康受试者的共同核心微生物群。y轴表示phylotype计数的范围共享,从而形成共同核心,9名健康受试者。行可视化如何phylotypes取决于选定的百分位的数量丰富,以及它如何与最低数量大幅减少当phylotypes被排除在外。列表显示了phylum-level总结贡献了超过0.03%的phylotypes相对丰度C。《共同核心phylotypes总结genus-level类群。箱线图的可视化、数量化的丰度核心分类单元。脆弱拟杆菌等rel。和双歧杆菌(两个左边的框)可视化用于参考目的。这些类群没有共同核心的一部分由于它们巨大的内部和inter-individual变异。箱线图的细节,请参阅的传奇图4。
包括所有上述phylotypes信号阈值在所有九个健康受试者,我们发现288 phylotypes共同核心(图5 b和表S5)。288年phylotypes代表41.9%的检测phylotypes,显示高度的系统发育个体之间的重叠。确切的分类单元数量应该谨慎,因为它们受到意想不到的噪音产生如交叉融合与非目标序列和探针结合亲和力的差异。估计这样的噪音,排除相关probe-level影响的可能性会显著影响共同核心成分和尺寸,我们使用的概率平均算法用于探测性能分析[34]。对于绝大多数的普通核心phylotypes (234;81%)之间的关联概率和标准方法> 0.9,表明低比例的潜在核心phylotypes检测中假阳性。预处理并不影响系统的核心为22 phylotypes检测结合最不可靠的探测(r < 0.8)都分配给不同,polyphylogenic集群XIVa梭状芽胞杆菌和IV大大主导核心phylotypes 145和111,分别是(表S5)。大多数的核心生物phylotypes落后,属于43从五个不同genus-like类群动物门(图5 b和5 c)。最代表群体r . obeum rel。(37 phylotypes),f . prausntizii rel。(25 phylotypes)o . guillermondii rel。(20 phylotypes)。拟杆菌、放线菌、变形菌门和Verrucomicrobia也代表核心(图5和表S5),与他们建立在人类肠道住所。最核心phylotypes有高度可变的丰富健康个体(图5 c)。
时间稳定的共同核心的细菌
除了学习的时间动态总微生物群,我们定义了时间变化的共同核心phylotypes以上决定。我们发现核心的个体内浸phylotypes范围从3.3%到23%表明高稳定的核心phylotypes相比,所有检测phylotypes上面所讨论的。绝大多数(70%)的核心研究(phylotypes波动小于10%图S3)。稳定核心phylotypes主要成员的集群XIVa梭状芽胞杆菌还几个类群属于集群IV。最主要的梭状芽胞杆菌稳定genus-level集团包括在内r . obeum rel。和c . symbiosum rel。的稳定性明显还在考试中基于x和分析整个微生物群(表S1)。
我们还研究了潜在的丰度之间的相关性和时间稳定性(x) genus-like类群。唯一一组展示强大的丰度和时间稳定性之间的关系f . prauznitzii rel。(ρ=−0.66;图S4)。之间的负相关表明,丰度与稳定f . prauznitzii是暂时稳定的只有当它是一个非常丰富的微生物群的成员,与其他常见肠道居民如双歧杆菌、波动的时间独立于丰富(ρ=−0.12;图S4)。我们的发现验证f . prauznitzii一种特异的qPCR化验,还表示其丰度和时间稳定之间强烈的负相关(ρ=−0.56)。
讨论
这项研究提供了肠道微生物群的系统发育分析的主题与验证肠和一般健康状况。受试者定期随访超过两个月。我们利用一个系统芯片,能够检测和千肠phylotypes相对量化的[13]。结合这个让我们健康状况分析:1。地址的组成和时间动态胃肠道微生物群,2。与特定的微生物组肠道健康状况,和3。提供新的见解和维度存在的共同核心微生物群,我们都分享。
已经证实人类胃肠道微生物群是由厚壁菌门和拟杆菌门放线菌和Verrucomicrobia紧随其后[8],[12],[35]。同一门占据了GI社区和我们的研究对象(结果图2)。我们发现几乎500细菌phylotypes /个人和产甲烷古菌在80%的受试者,表明我们的数据集应该充分描述采样粪便社区基于当前丰富的估计[16],[24]。产甲烷古菌的发现在高患病率和变量inter-individual但丰富自身内在一致。与前面的结果[36],我们的研究结果表明,产甲烷古菌是暂时稳定的胃肠道微生物群的成员,因此可能构成各个运营商的核心的一部分。提到的一个可能的解释的差异是使用有效的DNA提取方法在这项研究中,结果改善了古生菌的检测[29]。
我们的广泛的短期随访证实了低时间变化的总体健康受试者的胃肠道微生物群[10],[11]。高时间稳定显示强大的健康选择的主机为特定微生物的组合,另外,稳定支持的类群在不同个体,因此几乎没有系统单个核之间的共性。然而,稳定genus-level类群可能构成功能统一组织为他们中的大多数属于梭菌属的,其中许多是无处不在的水解和发酵碳水化合物应用者。
细菌谱的聚类分析表明subject-specificity尽管改变可以暂时性减少个体内微生物群相似的一些研究对象(图1)。抗生素治疗的证据确凿的修饰符GI生态系统[15],[16]。此外,微生物期间收集的资料也non-medicated链球菌咽炎显然从基线分离样本受影响的话题。这一发现表明,感染本身可能是暂时性的调节胃肠道微生物群,支持之前,类似的观察相关热吗[37]。作为一种新颖的观察,我们发现旅行与改变胃肠道微生物群相似的微生物群资料后显著降低海外旅行。各种因素可能会导致旅游相关的微生物群的不稳定,包括接触新的环境微生物,昼夜节律的压力或干扰。小队列研究的结果表明,正常生活的变化,如疾病、药物和旅游影响微生物群内稳态看似暂时地,不挑战微生物群的个性。
我们的研究结果暗示整个微生物群的稳定性和肠道症状可能彼此没有关联。受试者的微生物群资料报道最严重的肠道症状(表1在研究()保持高度稳定图1)。此外,微生物群的不稳定不表现为肠道症状根据卫生成绩记录(表1),与先前的研究表明健康受试者可能不稳定的微生物群在缺乏任何肠道投诉[16],[38]。作为本研究不涉及食物日记,我们无法估计的程度和性质的饮食影响时间稳定性和肠道症状的发生。因此,未来的研究需要与膳食记录及更大的群组研究中验证结果。
而肠道症状的发生并不反映在胃肠道微生物群的稳定性,我们发现细菌的丰度在统计学上显著相关的症状。最惊人的发现genus-level是双歧杆菌的数量减少耦合腹痛(图4)。认为大多数的疼痛分数表示只有轻微扰动,减少Bifidobacterial丰度明显。这项研究是第一个,据我们所知,研究微生物群组成及肠道症状之间的相关性在健康个体,而两项研究分析了IBS患者胃肠道症状之间的关系,使用qPCR肠道细菌[39],[40]。弱负bifidobacterial计数和描述的症状之间的联系[39],[40]而另一项研究没有发现这样的协会[40]。几项研究已经报道减少IBS患者(综述了双歧杆菌的水平[41])和益生菌b .对象是记录在IBS患者减少内脏疼痛[42]和动物模型[43]。机械背景对双歧杆菌的能力消除疼痛是未知的,但可以推测的双歧杆菌的多个代谢特征影响宿主有益的方式了[44])。最后,与我们的研究结果相似,肠易激综合症的研究提出了一个厚壁菌门的作用肠道症状的发生[39],[40]。然而,相关类群的IBS患者(乳酸杆菌,韦永氏球菌属种虫害和无特征瘤胃球菌属)[39],[40]大多是不同于我们,被未受教育的主导,但一个个的成员吗Clostridiaceae, Ruminococcaceae和Lachospiraceae。
本研究解决概念以及具体的共同核心微生物群,这可能包括的类群被选中在男人和他的共同进化胃肠道微生物群是有益的伙伴。一旦编目,功能特性可以关注这些重要的微生物群成员,具有潜在的治疗应用甚至如果他们验证造福人类健康和福祉。我们的新方法关注的概念而非具体定义共同核心微生物群显示核心的大小高度条件,不同的深度分析和选择所需的phylotypes患病率。的决定性影响的报道分析共同核心支持前发现一倍的测序深度共享物种的数量增加了25%[8]。
通过包括所有phylotypes上面指定的检测极限,我们发现超过40%的phylotypes所有九个健康受试者之间共享。前面sequencing-derived估计的分享共同的细菌从0 - 2%不等[12],[24]超过30%[8],[26]。我们hypothetize大型核心来自技术方面支持共享的检测细菌作为社区的有效提取DNA[29]耦合到其深入的成分分析,涵盖phylotypes特别是低相对丰度(低于0.05%)。这种稀有类群并不与传统测序深度访问[8],[25]因此往往仍未被发现。此外,我们的核心估计比以前少可以说是随机的,因为它仅限于之前确定phylotypes由于微阵列技术,和基于多个样本/个人。因此,相比之前假设的明确的优势科目的phylotypes胃肠道微生物群[12],[45],本研究支持一种观点认为,大部分的肠道细菌存在于大多数的个体,虽然在一个高度不均匀的比例。如果是这样,微生物群的个性会由于微分比率和特殊血统的纯粹的存在与否。
芬兰学科分析在这项研究中常见的微生物群的主要核心无教养的厚壁菌门从集群IV和XIVa梭状芽胞杆菌,也是高度代表在前面的核心研究[13],[24],[27]。作为一种新颖的观察我们发现杂交信号识别Oxalibacterium formigenes,在秩序Burkholderiales betaproteobacterium公认的核心细菌(图5 b和5 c,表S5)。非保密Burkholderiales最近被发现的一部分健康的核心[26]。o . formigenes是为数不多的结肠细菌与定义良好的健康益处,因为它控制着草酸体内平衡,防止肾结石的形成[46],[47]。但一个个厚壁菌门隶属于相同或相关属主导我们的共同核心(Faecalibacterium, Oscillospira,Subdoligranulum)最近被报告为“健康具体”作为其丰度和/或患病率之间区别的节段性回肠炎患者和健康对照组[48]。相比之下,拟杆菌种虫害没有丰富的微生物群共同核心的一部分。先前的研究也支持[12],[24],[27]或矛盾[8],[14],[26]我们发现的共同核心的低表示拟杆菌门。虽然有些差异可以归因于方法论的差异的研究,我们发现低比例的拟杆菌(4.5%),共同核心符合高国米和数量化[15],[24],[35]。
核心phylotypes比的总池暂时更稳定phylotypes,类似于另一个最近的研究[27]。稳定的phylotypes不同主题和只有少数genus-level类群中有稳定的在大多数健康受试者(表S1)支持胃肠道微生物群的功能冗余的范例,根据这一关键过程可以由几个类群。绝大多数的我们最稳定的genus-level第四类群属于梭菌的集群和XIVa包含大部分的丁酸盐生产商,作证的保证生产的基本代谢物之间的互惠体内平衡,导致主机和胃肠道微生物群(综述[49])。在我们群双歧杆菌并不包括在共同核心,相反,我们发现实质性的国际米兰,数量化,发生腹痛和其他有关肠道症状。双歧杆菌在一些学科中纯度不稳定genus-level类群(表S2),这是符合某些以前的结果[50]但与许多早期的研究,报告时间稳定性高的属[11],[51],[52]。总之,我们的研究结果强调了双歧杆菌在胃肠道生态系统中的作用和保证他们的进一步分析至于肠道健康。这些研究将阐明也出现差异对于他们自身内在稳定性。
不像其他genus-level分类单元,颞f . prausnitzii集团依靠其丰富的稳定在给定的主机。虽然f . prausnitzii rel。在所有个人(丰富图5度),在这些人暂时不稳定,信号强度最低。我们的发现可能只是反映了情况f . prausnitzii rel。人民都是暂时性的不平衡即下降或重建是有原因的。f . prausnitzii出现health-associated和colitis-reducing细菌吗[2],[48],[53]。健康个体中我们并没有发现预期的负关联的证据f . prausnitzii rel。和肠道症状。如属Faecalibacterium出现功能比此前认为的更加多样化[54],它需要进一步表征识别phylotypes和代谢功能,肠道和一般健康至关重要。
总之,这项工作扩展,定义了我们目前的了解正常胃肠道微生物群在健康受试者通过寻址时间动态,与肠道症状和共同的核心。这些知识将使我们更接近的定义肠道健康和胃肠道内微生物群的贡献。
方法
主题和研究设计
研究对象(表1芬兰)的一个子集健康成年人(n = 15)从一个更大的随机、双盲、安慰剂对照9周的干预试验(Kekkonen et al .,未发表的结果)。在进入研究之前,受试者给他们书面知情同意。研究协议是医院的伦理委员会批准的赫尔辛基和有所(道德协议溶血性尿毒综合征357 / E0/05)。排除标准是慢性疾病,胃肠疾病及相关药物,使用抗生素或急性胃肠道功能紊乱在前两个月的研究中,怀孕、哺乳。审判由试车、干预和随访期,每三个星期。收集粪便样本在六个时间点7周(周2、3、4、6、7、9),导致两个辍学后共有88个样本。干预期间受试者接受研究饮料包含菌株经常用于乳制品发酵,即乳酸链球菌解说(n = 4),Lactococcus lactis ATH74(n = 2),明串珠菌属mesenteroidesPIA2 (n = 7)或安慰剂(n = 2)。因为招聘这一亚组发生随机化后在母亲的研究中,我们可以不影响受试者的数量每干预组。受试者不允许使用任何益生菌或发酵乳制品在审判期间,因此有一个限制暴露于饮食的微生物。
在数据分析前,我们测试可能的微生物群的干预效果。观察干预组之间无显著差异的方差分析(方差分析)应用于phylotype-level数据上面指定的阈值(log10值为1.8;见下文)。然而,当还包括phylotypes检测阈值以下,一个统计学意义(q < 0.005)差异观察:Leuconostoc-like phylotypes瞬变期间增加干预组消耗l . mesenteroides PIA2。虽然结果证实的高分辨率HITChip分析,我们只解决上面的信号背景在目前的分析,从而研究对象被认为构成一个统一的集团的微生物群组成。
每个粪便取样时受试者填健康相关的生活质量问卷(HRQoL),这是基于RAND-36问卷[55]并补充了问题评估胃肠道症状是改编自肠易激综合症的问卷[56]。覆盖通用和情绪健康的问题集中在肠道症状的发生和对日常生活的影响评估与14(中列出的问题图3)使用5步李克特量表(例如1 =没有症状,5 =非常严重的干扰)。回忆期是根据抽样间隔一个或两个星期。健康得分每个问题获得的分数从0到100,然后平均相关问题形成的一般,肠道和情绪健康得分。此外,参与者提供数据,覆盖可能的疾病,在研究药物和出国旅行。
粪便样本和DNA提取
在家我们收集的粪便样本,立即冻结在−20°C, 12小时内和运输研究中心,他们储存在−70°C到分析。社区从粪便样本中提取DNA重复珠打方法最近被验证[29]。提取的DNA是量化Nanodrop分光光度计(美国Nanodrop技术,威明顿、德)和0.8%琼脂糖凝胶电泳分析的完整性。
微阵列分析
HITChip微阵列分析进行如前所述[13]。总之,HITChip由超过800个寡核苷酸探针针对V1和V6 16 s rRNA基因变异度高的地区,发现在得宝定制安捷伦数组(美国安捷伦科技,帕洛阿尔托,CA)。准备的粪便dna微阵列分析,全长16 s rRNA基因放大使用底漆T7prom-Bact-27-for和uni - 1492转速[13]。PCR产品转录成RNA和贴上Cy3 Cy5分裂之前和杂交数组。数组与安捷伦DNA微阵列扫描和扫描数据提取使用安捷伦提取软件9.1生成的图像。
计算微阵列的预处理
数组的规范化进行了如前所述[13],[29]包括每个扫描通道的空间与多项式回归正常化之后,异常值检测和分位数Cy3和正常化Cy5染料为每个样本。重复显示在0.98之间的皮尔逊相关性进一步分析和染料的染料被认为是平均,否则杂交繁殖。between-array归一化的样本是由使用的假设normal-exponential(背景信号)的分布和分位数正常化[57]。阵列探测器是基于16 s rRNA序列的三个层次所描述的发展史[13]。总之,HITChip信号强度进行了分析使用以下系统任务级别:1)phylum-level,厚壁菌门的规范集群梭状芽胞杆菌,创建完全23组;2)genus-like级别,其中包括131组序列≥90%序列的身份,和3)phylotype(物种)水平与1033年不同的phylotypes≥98%序列相似的物种或克隆对应无教养的微生物。“属程度的类群≥90%分布在多个属称为序列的身份”et rel。”。减少噪音实验和潜在的交叉融合,并可靠地评估某些phylotypes是否出现在一个示例基于杂交强度分布的所有主题,我们估计的信号强度阈值数据使用方法最初开发基因表达微阵列[58]。从而获得信号强度阈值是log10强度1.8 (图S1),相应的估计总额的0.02%为每个phylotype信号作为检测极限。增加分析的可靠性,我们另外确定探针特异性为每个phylotype通过计算目标phylotypes /探针的数量以指定分类群,可能受到交叉融合(即与探测器检测到有多个目标phylotype基于高变的V1和V6 16 s rDNA的序列)。多个目标phylotypes基本上是只发现在同一个genus-level类群。此外,强劲的概率平均算法被用来估计的可靠性个人HITChip探针在噪音方面如归因于意想不到的交叉融合与非目标序列[34],可能导致假阳性的共同核心的分析。之前,一个好的相关性HITChip和pyrosequencing-derived微生物资料已记录[30],[59]。
定量PCR分析
一式三份定量PCR (qPCR)放大16 s rRNA基因进行的所有可用的样本使用MX3005P实时PCR系统(美国Stratagene拉霍亚,CA)和CYBR绿色化学。总细菌的粪便DNA被放大0.5 ng量化通用引物[60]。古菌属量化使用特定的引物Methanobrevibacter[61]和25 ng模板DNA。的化验Faecalibacterium prausnitzii和双歧杆菌属种虫害进行如前所述[62]。标准曲线的反应条件和建设曾被描述[29],[62]。数据表示为16 s rRNAµg-1模板DNA基因副本。
数据分析
2.10.1 R版本的数据分析[63]和Microsoft Excel。在这项研究中使用的统计分析方法包括线性模型方差分析(干预的影响)和t[64],[65]对于正态分布数据,Wilcoxon[66]测试为非正态数据,确定错误发现率的假定值q值[67]和统计代表(浓缩)genus-level组织phylotypes-level列表使用确切概率法[68]。我们可视化数据通过使用层次聚类和热图分析。层次聚类用于组样品根据相关距离和平均聚类标准。
分析所有数据进行对数转换数据,异常的评估percentual丰度从总信号和计算信号的褶皱变化与腹胀和腹痛。我们通过计算确定微生物稳定内部,inter-individual皮尔逊相关性(r)和个人的时间变异phylotypes通过计算变异系数(x)一个主题内所有时间点。平均标准偏差计算文本中表达的相关性和±。
分析微生物之间的显著相关性的概要文件和肠道症状HRQoL-questionnaire我们计算他们的斯皮尔曼等级相关系数(ρ)。所有HRQoL项目得分,这样一个高分表明良好的健康状况(22),导致不直观的方向相关性即在负相关症状同时增加细菌的丰度和严重程度由于HRQoL评分的下降。因此,如实表达之间的联系的症状和微生物群数据合成的方向相关性(ρ)使颠倒从消极到积极,反之亦然。使用HRQoL胃肠道症状评分,我们将样本分为两组:有或没有并发腹痛,腹胀,然后用这些群体分析微生物群组成之间的关系和记录的两个最常见的肠道症状。我们分析了共同核心微生物群与phylotype-level数据使用大量的可调参数(相对贡献总信号)和患病率(影响受试者的数量)。由此产生的表面是可视化的角度[69]。对所有分析,假定值低于0.05和q值低于0.005被认为是重要的。
支持信息
图S1。
HITChip信号强度分布的phylotypes整个数据集(15个主题,88个样本)。红线显示日志的阈值10强度> 1.8,高于任何phylotype被认为是礼物。687 phylotypes通过阈值,代表66.5%的phylotypes HITChip检测。
https://doi.org/10.1371/journal.pone.0023035.s001
(TIF)
图S2。
旅行对微生物群稳定性的影响。HITChip指纹连续两个时间点之间的相似性每个旅行者都是使用皮尔逊相关性表示。
https://doi.org/10.1371/journal.pone.0023035.s002
(TIF)
图S3。
时间变化的核心phylotypes。线表明变异系数(x)的共同核心phylotypes。不到10%的phylotypes变异的七个星期内研究期间总结到门的水平。
https://doi.org/10.1371/journal.pone.0023035.s003
(TIF)
图S4。
联系时间稳定和丰富。竖线表示没有时间稳定(x)之间的相关性和丰富(%)genus-level类群中指定的盒子。在的情况下f . Prausnitzii组,两个轴上的线连接高值和可视化两个参数之间的负相关。
https://doi.org/10.1371/journal.pone.0023035.s004
(TIF)
表S5。
Phylotypes共同核心微生物群;9名健康受试者之间共享和贡献超过0.03%的总信号强度。
https://doi.org/10.1371/journal.pone.0023035.s009
(多克斯)
确认
我们感谢所有的志愿者参与了这项研究,Valio ltd .)粪便样本的收集和健康问卷调查。我们感激地承认博士的帮助下米里亚Rajilić-Stojanović,汉斯Heilig和HITChip团队(瓦赫宁根大学,问)HITChip分析,医学博士和彼得Sweins HRQoL的解释数据。执行的工作是在卓越中心微生物食品安全研究,芬兰科学院。
引用
- 1。Backhed F,雷再保险,松嫩堡莱托,彼得森哒,戈登吉(2005)Host-bacterial共生在人类肠道。科学(纽约)307:1915 - 1920。
- 2。索科尔H, Seksik P Furet JP Firmesse O, Nion-Larmurier我,et al .(2009)低项Faecalibacterium prausnitzii结肠炎微生物群。炎症性肠病15:1183 - 1189。
- 3所示。Kassinen, Krogius-Kurikka L, Makivuokko H, Rinttila T波林L, et al .(2007)肠易激综合征患者的粪便微生物群与健康受试者明显不同。胃肠病学133:33。
- 4所示。Malinen E, Rinttila T, Kajander K, Matto J Kassinen, et al。(2005)粪便微生物群的分析肠易激综合症患者和健康对照组与实时PCR。美国胃肠病学杂志的100:373 - 382。
- 5。拉森N, Vogensen颗,Van Den Berg弗兰克-威廉姆斯,尼尔森DS,安德瑞森,et al .(2010)肠道微生物群在成人2型糖尿病患者与非糖尿病成年人。《公共科学图书馆•综合》5:e9085。
- 6。马苏之后G,甘比诺R, Cassader M(2010)肥胖、糖尿病和肠道微生物群。糖尿病护理33:2277。
- 7所示。Zoetendal如Rajilić-StojanovićM, de Vos WM(2008)高通量胃肠道微生物群的多样性和功能分析。肠道57:1605 - 1615。
- 8。秦J,李R, Raes J, Arumugam M b . KS, et al。(2010)人类肠道微生物基因目录建立了宏基因组测序。自然464:59 - 65。
- 9。Matsuki T,渡边K,藤本J, Kado Y,高田T, et al。(2004)定量PCR与16 s rRNA-gene-targeted人类肠道双歧杆菌的物种特异性引物进行分析。应用与环境微生物学70:167 - 173。
- 10。Zoetendal如Akkermans广告,De Vos WM(1998)温度梯度凝胶电泳分析16 s rRNA从人类粪便样本显示稳定的活性细菌和宿主专一性的社区。应用与环境微生物学64:3854 - 3859。
- 11。C、F Scanlan PD,沙纳罕,O’mahony Marchesi小(2006)文化无关的时空变化分析占主导地位的粪便微生物群和有针对性的细菌在克罗恩病子组。临床微生物学杂志》44:3980 - 3988。
- 12。恩伯PJ, Hamady M, Yatsunenko T, Cantarel提单,邓肯,et al。(2009)的核心肠道微生物组肥胖和苗条双胞胎。自然457:480 - 484。
- 13。Rajilic-Stojanovic M, Heilig HG, Molenaar D, Kajander K, Surakka, et al。(2009)人类肠道的芯片,开发和应用的系统芯片:分析普遍保守phylotypes丰富的微生物群的年轻人和老年人。环境Microbiol 11: 1736 - 1751。
- 14。MJ前景并不乐观,库萨克,奥沙利文O, Greene-Diniz R, de Weerd H, et al。(2010)微生物与健康萨克讨论会:组成、肠道菌群的变化,和时间稳定性。《美国国家科学院刊15:14586 - 4591。
- 15。Jernberg C, Lofmark年代,简颂JK Edlund C(2007)抗生素的长期生态影响政府对人类肠道微生物群。ISME J 1: 56 - 66。
- 16。ML, Dethlefsen L,针对S·索金说Relman DA(2008)的普遍影响抗生素在人类肠道微生物群,揭示了深16 S rRNA测序。公共科学图书馆生物学6:e280。
- 17所示。理佩治Cochetiere DL,杜兰T, P, Bourreille, Galmiche JP, et al。(2005)的弹性的主导人类粪便微生物群在短期抗生素的挑战。临床微生物学杂志》43:5588 - 5592。
- 18岁。Maukonen J, Matto J Satokari R, H,索德伦德Mattila-Sandholm T, et al。(2006) PCR DGGE和rt - PCR DGGE梭菌的多样性和短期时间稳定coccoides-Eubacterium rectale集团在人类肠道微生物群。《微生物生态58:517 - 528。
- 19所示。桑德勒RS、斯图尔特WF Liberman约,里奇是的,Zorich NL(2000)腹痛,腹胀,腹泻在美国:患病率和影响。消化道疾病与科学45:1166 - 1171。
- 20.Gralnek IM, Hays RD,基尔孟,加洲B,梅耶尔EA(2000)肠易激综合症的影响在健康相关的生活质量。胃肠病学119:654 - 660。
- 21。Amouretti M,勒庞C,发言房颤,Bommelaer G, Frexinos J, et al。(2006)影响肠易激综合征(IBS)的健康相关的生活质量(HRQOL)。杂志生物30:241 - 246。
- 22。弗莱彻,戈尔年代,琼斯D, Fitzpatrick R,斯皮格尔霍尔特D, et al。(1992)的生活质量在卫生保健措施。二:设计、分析和解释。BMJ 305: 1145 - 1148。
- 23。比肖夫SC(2011)的“肠道健康”:一个新的医学目的?BMC医学9:24。
- 24。利用J, Mondot年代,Levenez F, Pelletier E,卡隆C, et al。(2009)对人类肠道菌群系统的核心。环境微生物学11:2574 - 2584。
- 25。Hamady M,骑士R(2009)微生物群落分析人类微生物组项目:工具,技术,和挑战。基因组研究19:1141 - 1152。
- 26岁。愿意B, Dicksved J, Halfvarson J,安德森,卢西奥M, et al。(2010)焦磷酸测序双胞胎的研究表明,胃肠道微生物资料随炎症性肠病表型。胃肠病学139:1844 - 1854。
- 27。Sekelja M,大山大山,na T,鲁迪K(2010)公布一个丰富的核心在成人结肠微生物群phylogroup-independent搜索方法。ISME J 5: 519 - 531。
- 28。亲爱的,摩根JL AE,艾森JA(2010)在vitro-simulated微生物群落的宏基因组测序。《公共科学图书馆•综合》5:e10209。
- 29。Salonen, Nikkila J, Jalanka-Tuovinen J, Immonen O, Rajilic-Stojanovic M, et al .(2010)粪便DNA提取方法的比较分析与系统发育微阵列:有效恢复使用机械细胞裂解细菌和古细菌的DNA。81年J Microbiol方法:127 - 134。
- 30.乔丹前景并不乐观,奥沙利文O,王Q, Nikkila J, Marchesi JR, et al。(2009)比较分析焦磷酸测序和系统发育的微阵列为探索人类远端肠道微生物群落结构。《公共科学图书馆•综合》4:e6669。
- 31日。伍力JC,你们Y(2009)宏基因组:事实和工件,和计算的挑战。25 J第一版Sci抛光工艺:71 - 81。
- 32。阿尔托a Aro AR Teperi J (1999) RAND-36来衡量健康相关的生活质量。可靠性、结构效度和芬兰的参考价值。赫尔辛基:股权,101年研究报告,1999年。(芬兰)。
- 33。刘C, Finegold SM,歌Y,劳森PA(2008)国际系统与进化微生物学杂志》上的58:1896 - 1902。球菌样的梭状芽胞杆菌的重新分类,瘤胃球菌属hansenii,瘤胃球菌属hydrogenotrophicus,瘤胃球菌属luti,瘤胃球菌属长生蜿和瘤胃球菌属schinkii作为Blautia球菌样的将军11月,梳子。11月,Blautia hansenii梳子。11月,Blautia hydrogenotrophica梳子。11月,Blautia luti梳子。11月,Blautia有的时候梳子。11月,Blautia schinkii梳子。11月11月和描述的Blautia wexlerae sp.,分离出人类的粪便。
- 34。拉赫蒂L,值得信赖,Aittokallio T, Kaski年代(2011)研究基因差异表达探针可靠性的概率分析与短的寡核苷酸阵列。IEEE / ACM反式第一版杂志Bioinform 8: 217 - 225。
- 35。Eckburg PB, Bik EM,伯恩斯坦CN Purdom E Dethlefsen L, et al。(2005)人类肠道微生物菌群的多样性。科学(纽约)308:1635 - 1638。
- 36。马康伦,Abell GCJ McOrist AL(2006)产甲烷古菌在成年人类粪便样品丁酸浓度成反比。微生物生态学在健康和疾病18:154 - 160。
- 37岁。Koenig我,斯波尔,Scalfone N,弗里克广告,Stombaugh J, et al。(2010)微生物与健康萨克讨论会:一系列微生物协会发展中婴儿肠道微生物组。《美国国家科学院刊年代2011年15:14578 - 4585。
- 38。Engelbrektson, Korzenik JR,桑德斯我,克莱门特BG,雷G, et AL。(2006)的分析治疗对人类肠道微生物生态的影响。《生态57:239 - 250。
- 39岁。Malinen E, Krogius-Kurikka L,莱拉,Nikkila J科,et al .(2010)协会与胃肠道微生物群在肠易激综合征症状。世界胃肠病学杂志》上的16:4532 - 4540。
- 40。塔纳C, Umesaki Y, Imaoka翰达岛T,金泽M, et al .(2010)改变肠道菌群与有机酸的配置文件可能的起源在肠易激综合征的症状。Neurogastroenterology和能动性:欧洲胃肠蠕动的官方杂志社会22:512 - 519,e114 - 515。
- 41岁。Salonen, de Vos WM, Palva(2010)胃肠道微生物群在肠易激综合症:现状和观点。微生物学156:3205 - 3215。
- 42。L O’mahony麦卡锡J,凯利P赫尔利G,罗F, et al。(2005)乳酸菌和双歧杆菌在肠道易激综合症:症状反应和细胞因子的关系配置文件。胃肠病学128:541 - 551。
- 43。麦凯南DP,菲茨杰拉德P, Dinan TG,克莱恩摩根富林明(2010)益生菌双歧杆菌35624对象的显示大鼠内脏antinociceptive影响。Neurogastroenterology &运动性22:1029。
- 44岁。Roberfroid M,吉布森GR,待遇L,麦卡特尼,Rastall R, et AL。(2010)生命起源以前的影响:代谢和医疗福利。英国营养学杂志》上的104:1 - 63。
- 45岁。Rajilić-StojanovićM, Smidt H, de Vos WM(2007)多样性的人类胃肠道微生物群再现。环境微生物学9:2125 - 2136。
- 46岁。斯图尔特CS,邓肯SH,洞穴博士(2004年)Oxalobacter formigenes及其在人类肠道中草酸代谢中的作用。《微生物学字母230:1 - 7。
- 47岁。Sidhu H,霍普B,黑森州,Tenbrock K, Bromme年代,et al。(1998)缺乏Oxalobacter formigenes囊性纤维化患者:hyperoxaluria的危险因素。《柳叶刀》352:1026 - 1029。
- 48。Mondot、康、Furet JP Aguirre de Carcer D,筹划C, et al。(2011)强调克罗恩病微生物群的新系统发育特异性。Inflamm肠说17:185 - 192。
- 49。范Hylckama Vlieg我Veiga P C,赵Derrien M, L(2011)微生物转化的食物对健康的影响发酵食物在胃肠道发酵。生物科技当今》。
- 50。高田Matsuki T,渡边K,藤本J, T,田中R(2004)使用16 s rRNA靶向类属特异性的引物进行实时PCR分析人类粪便的主要细菌。应用与环境微生物学70:7220 - 7228。
- 51。Vanhoutte T,驾车G,布兰德E,波动J(2004)颞微生物群的稳定性分析人类粪便通过变性梯度凝胶电泳使用环球和类属特异性的16 s rRNA基因引物。《生态48:437 - 446。
- 52岁。Engelbrektson Korzenik JR, Pittler,桑德斯,Klaenhammer TR, et al。(2009)益生菌的破坏降到最低粪便微生物群在健康受试者接受抗生素治疗。医学微生物学杂志》上的58:663 - 670。
- 53岁。康年代,Denman SE,莫里森M, Yu Z,多尔J, et al .(2010)失调的粪便微生物群在克罗恩病病人所显示的一个定制的系统芯片。Inflamm肠说16:2034 - 2042。
- 54。年轻路易P, P, Holtrop G,弗林特HJ(2010)揭示的人类结肠butyrate-producing细菌多样性分析butyryl-CoA:醋酸CoA-transferase基因。环境微生物学12:304 - 314。
- 55。海斯,而CD,好运气RM 1.0兰德36-Item健康调查(1993)。卫生经济学2:217 - 227。
- 56。黄E, Guyatt GH,库克DJ,格里菲斯勒,欧文EJ(1998)发展问卷测量肠易激综合症患者的生活质量。欧元J Surg. 50-56页。
- 57。Bolstad BM,伊RA,搁浅地米,速度TP(2003)比较规范化方法高密度寡核苷酸阵列数据基于方差和偏差。生物信息学(英国牛津)19:185 - 193。
- 58岁。Zilliox MJ,伊瑞拉(2007)基因表达微阵列数据的条形码。Nat方法4:911 - 913。
- 59。van den Bogert B,德·沃斯·WM Zoetendal如Kleerebezem M(2011)微阵列分析和编码焦磷酸测序提供了一致的微生物资料根据人体肠道样本的来源。:环境Microbiol 77: 2071 - 2080。
- 60。Nadkarni马,马丁铁、雅克•NA猎人N(2002)测定细菌负荷的实时PCR使用范围广泛(通用)探针和引物组。微生物学(阅读,英格兰)148:257 - 266。
- 61年。Ufnar JA,王SY,克里斯琴森JM Yampara-Iquise H,卡森,et al . (2006) nifH基因的检测Methanobrevibacter smithii:一个潜在的娱乐工具,确定污水污染水域。应用微生物学杂志101:44-52。
- 62年。Rinttila T, Kassinen Malinen E, Krogius L, Palva(2004)发展一套更广泛的16 s rDNA-targeted引物对粪便样品中细菌致病性和土著的量化实时PCR。应用微生物学杂志97:1166 - 1177。
- 63年。开发CT (2010) R:统计计算的语言和环境。奥地利维也纳:R统计计算的基础。
- 64年。遥远的JJ(2002)实际使用r .发表在URL回归和方差分析:http://wwwcranr-projectorg/doc/contrib/Faraway-PRApdf。2010年6月3日通过。
- 65年。ibsen Pinheiro JC,贝茨DM (2000) S和S + Mixed-Effects模型。纽约:施普林格,598 p。
- 66年。沃尔夫·迈尔斯H, D(1973)非参数统计方法。纽约:约翰·威利和儿子。68 - 75页。
- 67年。层JD(2002)直接方法错误发现率。皇家统计学会杂志》:系列B 64: 479 - 498。
- 68年。竞争对手我Personnaz L, ta L,保梯M(2007)浓缩或损耗的范畴内基因的一个类:哪些测试?生物信息学23:401 - 407。
- 69年。贝克尔RACJMWAR(1988)新年代的语言。查普曼&大厅。702 p。