数据
文摘
方法和结果
我们分析了突变的编码区和启动子甲基化MLL3使用126例结直肠癌。我们发现两种亚型的MLL3和DNA测序显示转移和其他突变影响大肠癌细胞两种亚型的MLL3和134年19(14%)原发性结直肠样本分析。此外,移码突变更常见的情况下与微卫星不稳定性(31%)主要在CRC细胞系和肿瘤。最大的同种型MLL3从CpG island-associated转录启动子具有高度同源性与pseudo-gene 22号染色体(psiTPTE22)。使用试验,测量两个位点同时我们发现突出的年龄相关的甲基化在正常结肠(从个人不到25岁的21%到56%在70岁以上的人,R = 0.88, p < 0.001)和频繁的甲基化(83%)CRC细胞系和原发性肿瘤。我们下分别研究了两个位点,发现年龄和癌症相关的假基因的甲基化是单独属性CpG岛,unmethylated MLL3位点。
引用:渡边Y, Castoro RJ,金正日HS,北B, Oikawa R, Hiraishi T, et al。(2011)频繁变更MLL3移码突变微卫星缺乏结直肠癌。《公共科学图书馆•综合》6 (8):e23320。https://doi.org/10.1371/journal.pone.0023320
编辑器:埃斯特万Ballestar, bellvige生物研究所(IDIBELL),西班牙
收到:2011年2月10日;接受:2011年7月15日;发表:2011年8月11日,
版权:©2011年渡边等。这是一个开放的文章下分布式知识共享归属许可条款,允许无限制的使用、分配、和繁殖在任何媒介,被认为提供了原作者和来源。
资助:这项工作是由美国国立卫生研究院的资助支持部分# CA098006和CA105346。J-PJI教授是美国癌症协会临床研究支持f·m·柯比基金会的慷慨的礼物。DNA测序的安德森癌症中心核心测序设施支持核心格兰特# CA16672来自美国国立卫生研究院。没有额外的外部融资获得了这项研究。投资者没有参与研究设计、数据收集和分析,决定发表,或准备的手稿。
利益冲突:作者宣称没有利益冲突存在。
介绍
在结直肠癌(CRC),系统分析13023年的人类蛋白质编码基因好的注释显示在69年候选基因突变[1]。其中,组蛋白甲基转移酶基因mixed-lineage白血病3 6例(MLL3)变异。MLL3属于硫氧还蛋白/ MLL基因家族和地图染色体7 q36.1。它编码一个4911个氨基酸的蛋白质预测包含两个植物homeodomains(博士),一个atp酶α/β签名,一个高机动组,一组(zeste斑抑制,增强剂,Trithorax)和两个财政年度(苯丙氨酸酪氨酸)丰富的领域。博士和设置域蛋白质是染色质监管者和几个人改变癌症[2]。失活的老鼠MLL3导致上皮肿瘤形成,这表明它的功能作为一个肿瘤抑制基因[3]。同时,MLL3经常被报道在骨髓性白血病中删除[4],[5]。此外,其他报告显示体细胞MLL3基因的突变在胶质母细胞瘤和胰腺导管腺癌[6]。然而,随后的报告还没有证实MLL3突变结肠癌[7]。因此,MLL3在结直肠肿瘤的发病机制仍不完全定义。
在本文中,我们研究了在结肠癌MLL3变化,发现两个同种型的MLL3同种型时间越长有一个以前从未发现过的CpG岛重叠的启动子。此外,我们发现新基因改变CRC细胞系和原发性肿瘤。
材料和方法
细胞系和标本
八结直肠癌细胞系(DLD1、SW48, RKO HCT116、CaCo2, SW620, lovos和SW480)从美国获得类型文化集合(弗吉尼亚州马纳萨斯)。细胞系都保持在适当的媒体含10%胎牛血清在塑料文化板块。使用标准的酚氯仿法提取DNA,并从提取细胞总rna提取使用试剂盒(表达载体,卡尔斯巴德,CA)[8]。我们研究了72个样本原发性结直肠肿瘤从延世大学获得Wonju基督教医院(Wonju、韩国)和54个样本原发性结直肠肿瘤患者和8相邻正常组织出现安德森癌症中心(得克萨斯州休斯敦的)。我们也研究结肠活检标本21个人没有结直肠癌家族史和结肠病变筛查全结肠镜检查。
突变和DNA甲基化分析
DNA分离严重microdissected癌症的体细胞突变分析来确定MLL3使用直接测序,甲基化MLL3地位和伪基因psiTPTE22 (pseudo-gene跨膜磷酸酶与tensin同源染色体上22)使用亚硫酸氢焦磷酸测序[9]。直接测序分析是识别所有59 MLL3外显子突变进行使用基因组DNA和cDNA八结直肠癌细胞系,并确认这些序列突变区域使用两套不同的基因组DNA主要crc (表1)。引物序列中描述表S1。所有的引物合成了表达载体(CA)圣地亚哥。PCR是在22.5µl铂PCR SuperMix高保真(表达载体,圣地亚哥,CA), 5µM向前5µM反向引物和10 ng基因组DNA。96年进行的反应是MJ thermocyclers (MJ研究,沃尔瑟姆,MA)使用30周期的PCR扩增协议(变性为30秒94 c;退火55 c 30秒;延长60秒68 c)。PCR产物直接测序的安德森核心排序功能。
MLL3之间的单独的DNA甲基化分析和psiTPTE22基因CpG岛经硫酸氢TOPO-TA后直接序列克隆结直肠癌细胞系和初级crc。缺乏信息错配修复(MMR)细胞系来自发表论文[10],[11]和数据库的桑格研究所癌症基因组项目(http://www.sanger.ac.uk/genetics/CGP/MSI/msi_page.shtml)。在主要结肠癌样本,我们决定通过微卫星不稳定性(MSI)分析错配修复缺陷,如前所报道[12]。所有的引物序列和PCR条件中描述表S1。
逆转录-聚合酶链反应
第一链cDNA准备1µg样本的总RNA逆转录的使用上标三世逆转录酶(表达载体,卡尔斯巴德,CA)。进行实时定量一使用Taqman基因表达分析[MLL3外显子边界1 2,Hs01005501_m1(调查);MLL3外显子-39年边界38,Hs01005520_m1(探测器B);MLL3外显子边界58 -59,Hs01005539_m1 (C)调查和glyceraldehyde-3-phosphate脱氢酶,Hs_00266705_gl(应用生物系统公司)在结直肠癌细胞系。(图1)。人类结肠cDNA (BioChain,海沃德,CA)是作为正常对照组;他们准备从正常结肠粘膜健康受试者的汇集。
MLL3从两个独立的转录启动子(箭头),和更大的记录包含一个启动子CpG岛而没有截断的形式。突变的位置发现和先前的报道是由箭头表示。每个箭头对应于一个突变的情况下,除了一个地区有多个箭头,对应于聚束。MLL3基因编码4911个氨基酸的蛋白质预测包含两个植物homeodomains(博士),一个atp酶α/β签名,一个高机动组,一组(zeste斑抑制,增强剂,Trithorax)和两个财政年度(苯丙氨酸酪氨酸)丰富的领域。每个突变主要样本显示在基因组结构模式图1。
西方墨点法
兔多克隆抗体anti-MLL3 (SAB1300328 Sigma-Aldrich,圣路易斯,密苏里州))是用于免疫印迹。完整的细胞溶解产物是由单层细胞刮到分析缓冲区没有SDS(包含150更易与l氯化钠,50更易与l Tris-HCl (pH值7.2),1%去氧胆酸,1% Triton x - 100, 0.25 l更易与EDTA (pH值8.0),蛋白酶和磷酸酶抑制剂,亮抑酶肽5µg /毫升、5µg / ml抑肽酶,1µg /毫升抑肽素A, 1更易与l phenylmethylsulfonyl氟化物,5 l更易与氟化钠,和100年µmol / l原钒酸钠),和蛋白质浓度测定(Lowry试剂、Bio-Rad大力神,CA)。等量的蛋白质被sds - page分离和转移到PVDF膜(表达载体,卡尔斯巴德,CA)。
结果
在这项研究中,我们发现频繁的移码突变失活的MLL3微卫星crc不足和没有任何MLL3位点的DNA甲基化结肠癌样本。
突变分析,我们筛选8 CRC细胞系使用PCR和测序的59编码外显子。我们发现突变的5个8细胞系(63.0%)。MLL3有多聚腺苷酸(a)9束外显子编码序列内的38个,包括在处理记录;纯合子的移码突变被发现在HCT116, RKO的杂合突变被发现在微卫星不稳定细胞系SW48 lovos。这些都是微卫星不稳定的细胞系。此外,我们发现SW48和DLD1有单独的体细胞突变MLL3其他编码区域(图1,2)。这些突变分析的结果可以证实使用互补脱氧核糖核酸(数据未显示)。接下来,我们分析了3 (c体细胞突变区域。8382年菲律宾人质(转移),c。10313 g > A (p.G3438D), c。13630 c > T (p.R4544W)) 72年一组初始主crc (A)中,发现移码突变9束在10个样本(MSI-H, 22.9% (8/35);海量存储系统(MSS)中,5.4% (2/37))(表1)。然后分析了9体细胞突变区域包括3网站我们发现和6网站发现Sjoblom et al。[1]在一个单独的组54主要crc和健康的患者样本(21日表1)。我们发现频繁突变(A)中9束在微卫星不稳定crc(28.6%, 4/14,见示例图2 b在这些样本),但没有其他突变。因此,总的来说,我们发现突变19/134例(14%)进行了分析。这些突变检测在一个广泛的编码序列,使用集群poly (a),证实了我们的分析微卫星不稳定的肿瘤。
(一)MLL3多聚腺苷酸()9外显子编码序列内的38。纯合子的移码突变被发现在HCT116, RKO的杂合突变被发现在微卫星不稳定细胞系SW48 lovos。单独的体细胞突变被发现在SW48和DLD1 c。10313 g > A (p.G3438D), c。13630 c > T (p.R4544W)。(B)的杂合突变被发现在相同的多聚腺苷酸(A)9外显子编码序列内的38。
研究DNA甲基化,我们首先指出,MLL3转录从两个不同的启动子,其中一个结果在截断版本的蛋白质(图1)。较大的子记录包含一个以前从未发现过的CpG岛,但一个不存在的截短形式。我们分析了CpG岛使用的甲基化定量亚硫酸氢-焦磷酸(例子图3一)。然而,我们发现MLL3面积高度同源的CpG岛(∼92%)的CpG岛重叠伪- 22号染色体基因的启动子(psiTPTE22, pseudo-gene的跨膜磷酸酶tensin同源染色体22:NR_001591)。亚硫酸氢的焦磷酸测序分析也能够扩大该地区表示假阳性的可能性。我们发现密集的甲基化在所有8细胞系通过焦磷酸测序获得的检查(HCT116、74%: 66%, RKO: lovos, 77%: SW48, 50%: CaCo2, 79%: SW480, 65%: DLD1, 72%: SW620, 74%),和高度甲基化在初级crc(45的54检查或83.3%,图3一)。甲基化的CpG岛在癌症并不是与常见的临床病理的相关功能,包括年龄、性别、位置和临床阶段。可衡量的程度的甲基化出现在相邻的正常粘膜的大多数病人进行了分析,表明这与年龄相关的甲基化的位点可能是一个目标[13]。事实上,在健康出现正常结肠粘膜样本,我们发现一个强大的与年龄相关的甲基化的CpG岛(r= 0.88,p= 0.0001)。
(一)热解色谱图的例子使用CpG岛(底漆地区焦磷酸测序结果所示图1),多态位置C / T高亮显示。顺序读取TC / TGTC / TGGAGGAGGATAAGAG在左侧显示热解色谱图。正常结肠和初级CRC(右侧)。(B)的相对表达在正常结肠和直肠癌细胞系分析qPCR完整的成绩单(探针:Hs01005501_m1)和全身的混合物和截断成绩单(探头B和C: Hs01005520_m1 Hs01005539_m1)。相对表达调查6细胞株的抑制在5。和另外两个探针(探测器B和C)展示最少下调这些细胞系(甚至上调)。
我们下一个试图更好地理解两个同源的DNA甲基化位点进行亚硫酸氢直接测序检测可以歧视两个位点。因为psiTPTE22基因的碱基对小于10 MLL3基因在这一地区(图4一)。有趣的是,MLL3基因的甲基化范围从0 - 5%在正常粘膜和CRC细胞株除了RKO (14.7%)。然而,psiTPTE22基因高度甲基化在结肠癌样本,在CRC细胞系和原发性肿瘤。此外,psiTPTE22位点的甲基化与年龄相关的甲基化在正常结肠粘膜(图4 j)。
(ⅰ)亚硫酸氢直接序列进行使用引物覆盖的启动子区域MLL3较大(形式)和psiTPTE22使用不同年龄的正常结肠上皮细胞(38 41年龄:24日,31日,48岁,52岁,68年和82年)。(J)点绘图显示DNA甲基化在psiTPTE22之间的联系,每个样本的年龄。结果表明,psiTPTE22甲基化是与衰老相关但不MLL3 (r= 0.830,p= 0.015)。
检查MLL3的表达谱,我们使用qPCR(定量聚合酶链式反应)和三种不同Taqman探测覆盖完整成绩单(170606 NM)和截断成绩单(021230 NM) (图1)。所示图3 b,完整的记录长度(探针)大幅下调5 6细胞株检查,表明遗传病因这沉默(图3 b)。相比之下,另外两个探针(探头B和C),检测截断和完整的成绩单,证明最小下调这些细胞系(甚至上调)。集体,数据表明,体细胞突变尤其是移码突变在癌症沉默完整成绩单而离开截断记录完整。
接下来我们分析两种不同大小的细胞内蛋白质MLL3(野生型/帧移突变)。蛋白质是由免疫印迹分析,以确定这些细胞能产生适当的MLL3蛋白(图3 c)。MLL3 3′端截短形式。因此,我们分析了MLL3使用抗体蛋白质水平(这个抗体设计中心的边界MLL3 (Sigma-Aldrich,猫。# SAB1300328(密苏里州圣路易斯)。它只能检测长MLL3蛋白质的同种型产品。
我们发现适当的乐队CaCo2和SW480 MLL3野生型,和lovos SW48,杂合的移码突变,MLL3抗体。相比之下,没有检测到乐队和HCT116, RKO都移码突变纯合子。这些结果与基因表达水平和蛋白质分析MLL3 (图3 b, C)。
讨论
在这项研究中,我们发现频繁的失活的MLL3移码突变以前没有报道。
我们已经表明,(一个)9道错配修复缺陷MLL3突变的肿瘤。一项研究[1]排除错配修复缺陷的肿瘤在2.2%的情况下,仍然发现突变(6/37)。原发性肿瘤,然而,我们之前报道的突变筛查受影响的地区,发现只有聚束突变。我们因此低估了精确的基因突变率,因为我们没有在所有肿瘤59所有外显子序列。然而,很明显,MLL3其他重要的肿瘤抑制基因的突变与CRC - TGFBRII。两个基因,大多数突变在CRC聚束错配修复缺陷的突变情况[14],但少数的突变也发现聚束外,包括在案件没有错配修复缺陷。测序技术的改善和成本应该允许MLL3突变在初级crc的精确估计在不久的将来。
表观遗传和基因沉默的组合特征等肿瘤抑制和cancer-predisposing基因P16,一种VHL等等。MLL3看似显示DNA甲基化在原发肿瘤中CRC细胞还定量亚硫酸氢焦磷酸测序分析。这个试验分析了DNA甲基化的CpG网站+ 224 bp的TSS在CRC细胞系,这表明甲基化主要肿瘤和正常的结肠。然而,我们发现的TSS MLL3有高度同源(∼92.0%)的伪基因在染色体22日命名psiTPTE22 (pseudo-gene跨膜磷酸酶与tensin同源染色体上22)。TPTE(跨膜磷酸酶tensin同调)位于人类21号染色体和有许多同源拷贝/假基因在染色体13日,15日,21日,22日和Y[15]。
接下来我们分析这些CpG网站使用硫酸氢直接TOPO-TA克隆后测序CRC细胞系(图S1A-I))和初级正常结肠样本(图4 j))。亚硫酸氢直接测序检测能够区分psiTPTE22 MLL3测序后因为psiTPTE基因的启动子区域是10个基点小于MLL3基因(图4一)。我们发现MLL3显示只有0 - 5%甲基化除了RKO甲基化在13.0%。另一方面,psiTPTE22是甲基化在所有CRC细胞系(65 - 90%之间图4 b我)。柴鸡蛋,psiTPTE22甲基化水平在正常结肠组织类似于我们以前观察到的几个基因[16]。
伪基因都已经不复存在了已知基因的亲戚已经失去了蛋白质编码能力或否则不再细胞中的表达[17]。虽然有些没有内含子或发起人,大多数有一些基因特性(如启动子、CpG岛和拼接网站),他们仍然认为非功能,由于他们缺乏蛋白质编码能力造成各种基因损坏(停止密码子,转移,或缺乏转录)或无法编码的RNA。假基因具有同源性的组合到一个已知基因和nonfunctionality。,虽然每一个假基因的DNA序列类似于一些功能基因,他们仍然无法生产功能的最终产品[18]。
有趣的是,梁等描述psiTPTE22-HERV由DNA甲基化沉默不仅胃肠道癌症,而且肾脏,肝脏和肺癌[19]。和HERV-related序列psiTPTE22-HERV大多拼接是内含子的成绩单,和15 kDa的蛋白质的氨基酸序列并不是任何逆转录病毒蛋白同系物。这些使HERV-related psiTPTE22-HERV基因一个普通的体细胞基因。
总之,我们报告MLL3灭活在CRC遗传改变。特别是,我们发现微卫星不稳定的CRC细胞行经常移码突变(A)中9束的编码区MLL3引起蛋白质功能的丧失,和以前的研究报道突变在微卫星这束外稳定的癌症。此外,MLL3发起人CpG岛是高度同源的CpG岛假基因的启动子区域psiTPTE22。psiTPTE22欢快的甲基化主要crc和正常上皮与衰老相关但不MLL3 (图4 j)。MLL3损失函数可能是早期CRC肿瘤发生的一个重要特征。
支持信息
图S1。
亚硫酸氢MLL3和psiTPTE22甲基化状态的直接序列分析6 CRC细胞系。(ⅰ)我们发现0 - 5%的甲基化MLL3细胞系。相比之下,pseudo-gene (psiTPTE22)甲基化在65 - 90%之间所有的细胞系。
https://doi.org/10.1371/journal.pone.0023320.s001
(每股收益)
作者的贡献
构思和设计实验:YW J-PJI。进行了实验:YW这RO SSA MT。分析了数据:YW这。造成试剂/材料/分析工具:HSK WC M-YC FI MRHE LS JJ J-PJI TH。该报写道:YW BN这J-PJI。
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