数据
文摘
肠道crypt-niche相互作用被认为是必不可少的功能,维护和扩散祖干细胞发现肠道隐窝的基地。这些干细胞不断更新肠道上皮隐窝的底部通过发送分化细胞Lieberkuhn绒毛的技巧,他们抛弃到肠道内腔。肠道利基由各种类型的细胞,细胞外基质,生长因子和围绕着肠道祖细胞。有最近进展的理解的交互调节肠上皮细胞的行为和隔离的方法有极大的兴趣和扩大可行的肠上皮细胞。然而,没有方法来维持主要人类小肠上皮细胞在文化长期的时间。同样没有公布方法描述人类肠道上皮的隔离和支持在活的有机体内模型。我们描述一种技术来分离和维护人类小肠上皮细胞在体外从手术标本。我们还描述了一种新颖的方法来维持人类肠道上皮细胞皮下注射的小鼠模型长期的时间。我们的方法需要多种生长因子和肠道之间的亲密互动sub-epithelial myofibroblasts (ISEMFs)和肠上皮细胞支持上皮在体外和在活的有机体内增长。没有这些myofibroblasts杜绝成功维护上皮细胞的形成和扩散超出几天,即使在支持经济增长因素的存在。我们相信,这里描述的方法可以用来探索人类肠道干细胞的分子基础支持,维护和增长。
引用:火山泥流N, Lei纽约,王J, Jabaji Z,东SC, Joshi V, et al。(2011)肠道牙龈Myofibroblasts支持在体外和在活的有机体内人类小肠上皮细胞的增长。《公共科学图书馆•综合》6 (11):e26898。https://doi.org/10.1371/journal.pone.0026898
编辑器:迪恩·g·唐,德克萨斯大学的M。D安德森癌症中心,美利坚合众国
收到:2011年6月1日;接受:2011年10月6日;发表:2011年11月17日
本文是一个开放、自由的版权,并可自由复制,分发,传播,修改,建立或由任何人任何合法目的使用。下的工作可用Creative Commons CC0公共领域奉献。
资助:这项工作是支持由国家糖尿病、消化和肾脏疾病研究所U01肠道干细胞财团(DK085535-01和DK085535-02S2), DK083762, DK083319和加州再生医学研究所(CIRM)(批准号rt2 - 01985)。这个刊物的内容是完全的责任作者和不一定代表这个或任何其他机构的官方观点的加州。投资者没有参与研究设计、数据收集和分析,决定发表,或准备的手稿。
利益冲突:作者宣称没有利益冲突存在。
介绍
永远分裂的肠上皮细胞是由上皮细胞组成的五个主要细胞类型:普通吸收肠上皮细胞,enteroendocrine细胞,粘液分泌的杯状细胞,细胞簇,Paneth细胞[1],[2]。这些细胞不断被新的隐窝的底部Lieberkuhn肠道干细胞驻留的地方[3]。这些祖细胞分化他们的旅程的地穴绒毛,这些crypt-villus单位占肠道上皮细胞的功能元素[1],[4]。
肠道干细胞是极大的兴趣的潜在临床应用[4]。重大进展最近制造的理解这些干细胞之间的亲密互动,发现肠道隐窝的底部,和周围的环境[5],[6]。
特别感兴趣的因素中扮演一个角色在干细胞利基肠道牙龈myofibroblasts (ISEMFs)。这些细胞位于固有层接近隐窝细胞[6]。ISEMFs有品质的平滑肌细胞和成纤维细胞[7]。他们通过各种守恒的细胞内途径如Wnt交互,Bmp,和切口调节干细胞的行为,可能通过直接接触和旁分泌方式[2],[8],[9],[10]。然而,ISEMFs并不是唯一的细胞已被证明有支持和监管影响隐窝干细胞。最近,Paneth细胞已经涉及维护肠道干细胞和可能通过途径类似于ISEMFs交互[11]。的交替模式Paneth隐窝细胞和干细胞在地下基地向这些细胞类型的亲密接触,类似ISEMFs和隐窝干细胞[5]。事实上,Lgr5就+干细胞生长在体外Paneth细胞被证实的存在形式的肠上皮细胞结构的数量显著高于干细胞培养[11]。此外,myofibroblasts只是各种各样的间充质细胞之一crypt-villus利基。最近的研究表明,有几个不同的不定地平滑肌肌动蛋白阳性固有层间充质细胞和其他各种各样的细胞表面标记也可以导致肠道上皮细胞的功能[12]。虽然ISEMFs经常与调节肠道上皮细胞,多种因素和细胞类型在肠道干细胞调控中发挥作用。ISEMFs可能扮演其他支持性的角色;牙龈myofibroblast迁移可以促进上皮再生,提高的屏障功能损伤或压力[13]。电子显微镜显示了迁移myofibroblast通过基底膜孔后上覆上皮的损失[14]。
在这项研究中我们展示能力的老鼠和人类ISEMFs支持增长,肠道上皮细胞分化,扩大人类从先前孤立的人类隐窝。我们证明myofibroblasts必须保持人类上皮细胞在长期的基础上在一个文化环境。我们还表明,老鼠myofibroblasts可以维护人类上皮细胞集群皮下注射在活的有机体内。这些培养人类上皮细胞表现出免疫组织化学标记的完整、成熟的肠道上皮细胞。
结果
评价小鼠ISEMFs
为了确定ISEMFs获得C57BL / 6小鼠小肠,免疫荧光是用来证实特征myofibroblasts的特殊标记。细胞染色阳性α平滑肌肌动蛋白(SMA)、波形蛋白和肌间线蛋白- (图1一个)。定量实时PCR用于检查SMA的mRNA表达波形蛋白和肌间线蛋白(图1 d)。成人和婴儿人类小肠样本染色,并演示了myofibroblast染色特征。然而,SMA染色不匀强如发现在小鼠myofibroblasts (无花果。1 b和c)。定量实时PCR的mRNA的人类SMA myofibroblasts产生了类似的模式,与小鼠myofibroblasts波形蛋白,肌间线蛋白表达。
(A) C57 BL / 6小鼠myofibroblasts镀塑料培养皿中为四天。用免疫荧光染色细胞典型的肠道myofibroblasts积极SMA和波形蛋白染色和消极的肌间线蛋白染色。蓝色伪彩色DAPI对比染色细胞核。(B) Myofibroblasts成人回肠造口术手术标本中分离的镀四天前免疫荧光染色。类似于小鼠myofibroblasts, SMA和波形蛋白染色呈阳性而肌间线蛋白染色是负面的。(C)镀Myofibroblasts隔绝人类婴儿回肠造口术,四天前免疫荧光染色。像成年人样本,SMA是积极但微弱。波形蛋白染色阳性,而肌间线蛋白染色是负面的。(D) PCR结果对C57 BL / 6小鼠myofibroblasts执行一致的免疫荧光结果积极的SMA和波形蛋白染色和消极的肌间线蛋白染色。
人类肠道隐窝在体外关于时间
人类隐窝与小肠手术样本,悬浮在基底膜基质和放入24-well板块没有myofibroblast支线层(n = 16)。肠道球状体被观察到文化第二天但第三天他们的上皮细胞边界清楚破裂,呈现球状体不能存活(图2)。然而,当人类隐窝被放置在一个小鼠myofibroblasts支线层,上皮细胞可以持续至少56天在体外,维护他们的不同的边界(n = 16)。这样的文化观察每天第一周期间,每周和随后。他们的形态依然在本质上是一个简单的囊肿没有复杂的结构在整个生长时期(图2 b)。这样的囊性结构观察生长在小鼠myofibroblasts大约80%的时候。
(A)人类小肠隐窝培养没有myofibroblasts (MFs)或生长因子(GFs)将生活大约两天前死了。(B)人类小肠隐窝培养的小鼠myofibroblast但没有生长因子无限期维持囊形状但没有显著增长。(C)人类小肠隐窝培养和Wnt3a FGF10生长因子在老鼠面前myofibroblasts开始简单的囊肿,填补和挤压他们的内容和形态随着时间的推移变得更加复杂。(D)人类上皮集群成长成人myofibroblasts在生长因子的存在组织成简单的囊肿但不能维持超过3天。(E)婴儿myofibroblasts能够支持人类肠道上皮细胞通过9天post-explantation增长转化为复杂的囊性结构。对于A和B,比例尺是µm 200元。C, D, E,比例尺是µm 100元。
Wnt和FGF上皮生长因子的影响发展是人类隐窝生长在小鼠myofibroblasts评估使用。串行图像得到的培养肠道隐窝在8天时间。孤立的隐窝很快发展成简单的球状体,定义良好的边界(图2 c第二天,第1天)。这些球状体充满碎片从上皮衬里,最终被挤压腔enterospheres (图2 c一天,在接下来的几天(3)。图2 c第8天),有额外的增长enterospheres及其形态变得更加复杂和增加囊肿壁折叠,将被称为“肠状的。最可行的肠状的被发现的边缘文化的井,一个共同的发现与小鼠肠状的文化模型(数据没有显示,[15])。
成年人myofibroblasts从小肠手术分离样品,电镀,用来评估他们的能力来支持孤立的人类肠道隐窝。这些enterospheres中培养这些成年人ISEMFs仍然可行的2 - 3天(n = 9)。然后他们迅速失去了独特的优势,成为不可行的(图2 d和数据未显示)。然而,我们能够成长成人肠状的长时期在myofibroblasts隔绝人类婴儿(n = 8,图2 e)。每次都这样肠状的形成,他们仍然可行的超过56天(图3)。有趣的是,肠状的生长在人类婴儿ISEMFs不需要FGF10, Wnt3a甚至R-spondin来维持增长。肠状的生长在这些文化表现出各种不同的形态。这些形态包括简单cyst-like结构与上皮薄墙,cyst-like结构与初露头角的扩展和细长薄壁结构(图2 e)。cyst-like结构的规模继续扩大,0.2毫米直径的增加最初超过2毫米线性尺寸(图3 d)。cyst-like结构小时,我们可以转移到一个新的文化与myofibroblasts,和这些结构将继续扩大规模。
人类小肠隐窝的显微图,培养对人类婴儿myofibroblasts (A) 2天,(B) 8天,(C) 23天,(D) 56天的文化。小囊肿变大,时间,有时相互融合形成更大的结构。
人类上皮扩大文化
一些人类肠状的准备小鼠ISEMFs获准种植,直到一天18时从文化机械和加工。各种类型的细胞表面标记特征的小肠上皮细胞被用来检查部分。相衬显微术的人类上皮肠状的证明显著增加结构的复杂性在18天比天1 - 8 (图4)。苏木精和伊红染色(圆))演示了一个极性形成上皮组织(图4 b)。杯状细胞和肠上皮细胞被发现在顶端极核染色发现基底肠状的区域。在文化与钙粘蛋白和免疫组织化学染色CDX-2证实肠道上皮细胞培养细胞的性质(图4 c, D)。CDX-2通常表达了更强烈的地下室基础肠道上皮细胞。核染色的强度由CDX-2不规则,暗示独立的地下室和绒毛域内肠状的。Myofibroblasts SMA阳性,被发现在丰富的基底一侧肠状的(图4 e)。杯状细胞使用高碘酸希夫染色法进行评估。高碘酸希夫阳性细胞中挤压黏液状的材料出现在相邻的上皮覆盖区域(图4 f)。通常Paneth细胞形态学锥体形状和lysozyme-positive位于地下室地下室基础柱状细胞之间的基地[15]。我们演示了黑暗交替的锥体细胞溶菌酶阳性染色文化(图4 g)。Enteroendocrine肠上皮细胞是罕见的细胞和Synaptophysin和Chromogranin积极污点[16]。这里我们展示enteroendocrine细胞的存在使用Synaptophysin免疫组织化学染色(图4 h)。当人类上皮隐窝是生长在小鼠ISEMFs 58天,他走时染色显示出极化上皮细胞层(图5)。这些上皮细胞CDX-2和钙粘蛋白阳性(图5 b和C分别)。相比之下,邻myofibroblasts SMA阳性(图5 d)。
人类隐窝培养小鼠myofibroblasts Wnt3a的存在和FGF10加工后18天在体外。(一)文化相衬显微镜。(B)苏木精和伊红染色。注意与上皮细胞极性在基底核区和杯状细胞顶端区域。(C)上皮,上皮细胞标记。(D) CDX-2,污渍肠道上皮细胞。值得注意的是,钙粘蛋白染色时相对甚至CDX-2染色显示不均匀染色暗示交替crypt-villus域。平滑肌肌动蛋白(E), myofibroblasts标记。杯状细胞(F),污渍。注意挤压在顶端的上皮粘液性物质文化。 (G) Lysozyme, a Paneth cell marker. (H) Synaptophysin, marker for enteroendocrine cells. For all images, scale bars are 100 µm.
人类小肠隐窝培养小鼠myofibroblasts Wnt3a的存在和FGF10 58天后加工在体外。(一)苏木精和伊红染色。(B) CDX-2,污渍肠道上皮细胞。(C)上皮,上皮细胞标记。(D)α平滑肌肌动蛋白,为myofibroblasts标记。
人类免疫力低下小鼠肠上皮植入皮下
人类上皮肠状的和相关的小鼠ISEMF培养11天前被赋予聚乙醇酸(PGA)支架植入皮下的NOD-SCID-IL2Rγnull (NSG)小鼠(n = 2)。11天的时间跨度选择由于ISEMFs及其上皮分离从文化内容,从而促进放置在聚乙醇脚手架。支架是收获后28天来确定其内容的可行性和肠道标记表达式。植入的28天被选中,是因为没有上皮文化能保持没有生长因子的支持对于这个在我们经验的时间长度。一旦切除,植入了10%福尔马林固定和染色。)表明上皮囊肿与嗜酸性细胞腔的内容和至少三个形态不同的细胞类型(图6)。类似于上皮文化,钙粘蛋白和CDX-2积极在囊肿壁细胞衬里,表明肠上皮细胞的存在(图6 b, C)。CDX-2污渍再一次证明了域的不规则染色暗示地穴沿着上皮囊肿和绒毛域。SMA-positive细胞暗示myofibroblasts被紧密结合囊肿,囊肿周围粘膜细胞(图6 d)。PAS染色再一次证明了mucin-producing细胞的存在符合杯状细胞(图6 e)。囊肿囊腔也为粘蛋白染色强烈。也像synaptophysin, chromogranin enteroendocrine细胞染色。一致,肠道集群的多个污渍孤立chromogranin染色。这个特殊的上皮囊肿演示了一个细胞阳性chromogranin (图6 f)。当人类上皮肠状的培养与人类婴儿ISEMF植入相同的动物模型,囊肿也类似于那些培养小鼠ISEMF形成(图7)。免疫组织化学染色证实CDX-2和钙粘蛋白的表达在上皮细胞,以及SMA的表达在细胞周围的囊肿。粘蛋白和溶菌酶也出现在一些细胞,分别的酒杯和Paneth细胞。尝试植入上皮细胞没有首先与ISEMF建立这种文化导致上皮细胞的生长模型。
人类小肠隐窝小鼠myofibroblasts生长在文化11天的Wnt3a FGF10,然后放在PGA觉得支架植入皮下注射到一个免疫力低下NOD-SCID-IL2Rγ零老鼠。28天后,植入物与肠上皮标记收获和评估。(A))演示了至少三个细胞形态,在囊肿腔和嗜酸性物质。(B)钙粘蛋白(C) CDX-2,肠道上皮细胞标记。再次注意变量CDX-2暗示染色强度的地下室和绒毛域(D)α平滑肌肌动蛋白染色myofibroblast相邻的上皮细胞。(E) PAS染色粘蛋白和粘蛋白生产杯状细胞(F) Chromogranin, enteroendocrine细胞的标志。对所有图像,比例尺是µm 100元。
人类小肠隐窝是生长在人类myofibroblasts 8天,然后放在PGA觉得支架植入皮下注射到一个免疫力低下NOD-SCID-IL2Rγ零老鼠。28天后,植入物与肠上皮标记收获和评估。(A))染色显示上皮组织。(B)钙粘蛋白和(C) CDX-2肠道上皮细胞标记。(D)α平滑肌肌动蛋白染色myofibroblast周围上皮细胞。(E) PAS染色粘蛋白和粘蛋白生产杯状细胞。(F)溶菌酶,对Paneth细胞标记。
讨论
小肠上皮细胞之间的亲密接触和相关sub-epithelial myofibroblasts老鼠和人类普遍认为促进细胞类型之间的相声,有助于促进整个上皮细胞的生长和分化[5],[10]。在这里,我们表明,老鼠和人类ISEMFs将支持被分离的肠上皮细胞的生长。在鼠标ISEMFs面前,人类上皮细胞培养维护至少60天。另一方面,上皮文化缺乏一个ISEMF支线层只有2 - 3天后死亡。孤立的鼠标ISEMFs维护ectopically放置人类肠道上皮细胞在活的有机体内,使他们能够存活28天皮下注射的免疫缺陷小鼠模型没有额外的外部生长因子的支持。虽然有长期的描述人类肠道上皮细胞培养系统之前,都需要转化细胞[17]。这是第一次报告的维护non-neoplastic人类肠道上皮细胞在活的有机体内在免疫力低下小鼠长期的时间。肠肠状的悬浮在基底膜基质,专有proteinacious混合物,其中包含许多元素和因子的细胞外环境。没有从ISEMFs支持,这些悬浮上皮细胞基底膜基质生存大约2天。我们证明了,人类上皮细胞中保持的时间更长ISEMFs的存在。这些发现与多种动物研究结论一致,细胞凋亡是预防上皮的直接互动与一个矩阵元素而长期上皮的文化在体外需要一些间质元素的支持[12]。
另一个有趣的发现是我们的观察肠状的发展明显绒毛和地下室域形成细胞形态相似,在文化和在活的有机体内标本。这一现象被认为与CDX-2染色变化最明显。这项发现暗示,即使在一周内上皮细胞的增长,在细胞水平上组织行为。FGF4和Wnt3a之前在决定人类多能干细胞的细胞命运后肠特定的域[18]。直到Wnt和FGF被添加到我们的文化系统,人类上皮囊肿在形态变得更加复杂和规模急剧扩大。进一步了解其他生长因子的作用将上皮细胞生存的希望提高产量和改善他们的增长。
暗示让人类ISEMFs支持人类肠肠状的仍有待确定。我们能够支持人类上皮生长在体外使用人类myofibroblasts至少60天。实验证明这种支持交互更难以证明已经比使用鼠标myofibroblasts。我们有测试能力的成年人myofibroblasts支持肠道上皮但未果。相比之下,ISEMF细胞从婴儿分离人类小肠上皮细胞培养的长期增长的支持。“经典”myofibroblasts标记细胞相似且一致的与鼠标。显然其他年龄相关性因素的长期支持人类上皮细胞。这些有待阐明。Myofibroblasts可能许多异构的间充质细胞之一,固有层中有不同的角色在支持肠道上皮细胞。可能的一些角色归因于ISEMFs实际上可能是由于其他SMA-positive细胞[12]。进一步评估的微妙因素,使各种myofibroblast行不同当然是必要的。
我们的研究结果有助于进一步的实验旨在澄清的具体因素ISEMFs支持上皮。理解了这些相互作用,它可能,例如,可以扩大单一肠道干细胞转变为可行的人类使用人类ISEMF肠道上皮细胞作为一种支持细胞层。此外,隐窝干细胞之间的关系,Paneth细胞,ISEMFs还需要调查进一步描绘这些细胞类型之间的分子间相互作用。维护这些文化的在活的有机体内环境打开细胞长期生存能力的可能性没有连续的外部补充细胞因子和生长因子。
材料和方法
道德声明
人体组织,新鲜组织得到适当的IRB的批准加州大学洛杉矶分校的病理临床病理核心实验室。
动物研究都是加州大学洛杉矶分校的动物研究委员会批准,IRB # 2005 - 169。加州大学洛杉矶分校设施是一个AALAC-accredited设施。本研究进行了严格按照指南中建议的实验动物保健和使用美国国立卫生研究院。所有的努力都是尽量减少痛苦。
鼠标保健
Myofibroblasts被隔绝5-day-old C57BL / 6野生型小鼠从我们自己的繁殖生长。六个免疫功能不全的NOD-SCID-IL2Rγnull (NSG)小鼠(缅因州杰克逊实验室,巴尔港)是用于人类上皮移植研究。两株小鼠被安置在加州大学洛杉矶分校动物设施。老鼠幼崽是牺牲/加州大学洛杉矶分校的医学实验动物(DLAM)协议使用异氟烷过量斩首紧随其后。NSG老鼠放在一个二氧化碳室和天然气每DLAM协议补充道。加州大学洛杉矶分校设施是一个AALAC-accredited设施。本研究进行了严格按照指南中建议的实验动物保健和使用美国国立卫生研究院。所有的努力都是尽量减少痛苦。
人类肠道组织
十几小肠肠切除标本的样本获得新鲜roux - en - y胃旁路手术过程和简单的回肠造口术拆卸程序。样本经手术病理部门在45分钟内切除并放在冰冷的杜尔贝科的磷酸缓冲溶液(PBS)。新鲜组织获得了加州大学洛杉矶分校的用适当的IRB批准病理学系临床病理核心实验室。
隔离肠隐窝
组织被撤PBS溶液和冰冷的PBS洗水洗多次,直到解决方案仍然清晰。标本被放置在皮氏培养皿中PBS冰上粘膜表面朝上。使用刀片,多余的上皮表面的黏液状的材料被取消。标本被分为大约0.5厘米2碎片。这些作品被放置到一个2.5更易在PBS / L EDTA溶液30分钟的孵化与温和的摇晃在4°C。这个潜伏期后,碎片被允许定居和上层的被丢弃。10毫升的冷PBS添加到样本,并随后涡10秒秒的脉冲。碎片被允许定居,和上层清液被保存在冰。又增加了10毫升的PBS,过程进行了八次。样本将在100 g 2分钟。浮在表面的被丢弃。球团的内容使用尼康TMS光学显微镜显微镜下检查评估的纯洁地穴分数。通常,所有的分数都汇集在一起上皮隐窝的产量增加。 The pooled fractions were then purified using a 100-µm pore filter (BD Biosciences, Bedford, MA). Fetal Bovine Serum at 10% per volume was then used to suspend the contents of the filtrate. These clusters were examined under light microscopy and counted. 500 crypt clusters were suspended in 50 µL Matrigel (BD Biosciences) as previously described in Sato's 3-D Matrigel culture system developed for murine intestines[15]。隐窝细胞/人工基底膜悬挂被人类myofibroblasts直接镀在以前的鼠标/。基底膜基质被允许在myofibroblasts聚合。地下室培养基被添加到井中。媒体包括先进的DMEM / F12(表达载体,卡尔斯巴德,CA) penicillin-streptomycin(表达载体),GlutaMax补充(表达载体,2更易/ L),消息灵通的缓冲区(表达载体,10更易/ L), n -补充(表达载体),B-27补充(表达载体),EGF (PeproTech,落基山,新泽西,50µg /毫升),小鼠的大脑(µg PeproTech 100 /毫升)和R-spondin(研发系统,明尼阿波利斯,1µg /毫升)[15]。研究使用不同剂量的子集Wnt3a(研发系统,100 ng / mL),和FGF10(研发系统,100 ng / mL)。媒介是每两天更换一次相同的因素。
Myofibroblast隔离和文化
从7天小鼠小肠切除了。组织放入培养皿中含有钙和镁免费汉克的缓冲盐溶液(表达载体)和葡萄糖(σ,20毫克/毫升),penicillin-streptomycin(表达载体),和谷酰胺(表达载体,4更易/ L) (hbs *解决方案)。肠道被冲毁,冲洗。肠道组织丁到0.3 - -0.5毫米2碎片。丁材料被转移到T25烧瓶。30毫升的冷hbs *的解决方案是添加到烧瓶之后就动摇了在室温下2分钟。瓶就可以解决和上层的丢弃。重复此过程,直到解决方案是明确的。
一旦最后上层清液是丢弃,20毫升dispase(表达载体,0.31毫克/毫升)/胶原酶类型XI(σ,圣路易斯,密苏里州,0.25毫克/毫升)的解决方案是添加到组织中。瓶是在室温下轻轻摇晃适度30分钟。
瓶内容被转移到50毫升锥形管和大力动摇了30秒。10毫升冷hbs *添加到解决方案,全部内容可以解决。上层清液被转移到一个新的50毫升锥形管。这是重复6次50毫升锥形管。
样品被悬浮在25毫升的高葡萄糖杜尔贝科修改鹰介质的胎牛血清(表达载体,5% v / v)、谷酰胺(表达载体,4更易/ L),山梨糖醇(σ,20毫克/毫升)和penicillin-streptomycin(英杰公司)(DMEM-S解决方案)。解决方案是倒,直到混合然后离心机在100 g在4°C两分钟。管被放置在冰和上层的丢弃。颗粒被转移到一个5毫升离心管。内容被允许定居和任何上层清液被丢弃。颗粒resuspended在哈佛商学院与镁和钙补充penicillin-streptomycin(英杰公司)、谷酰胺(表达载体,4更易/ L)。整个内容被高速旋转10秒钟。上层清液是丢弃和颗粒悬浮在媒体myofibroblasts基本增长。基本增长媒体包括DMEM(表达载体),与Antibiotic-Antimycotic(表达载体),胎牛血清(v / v)表达载体,10%,EGF (PeproTech,落基山,新泽西,50µg /毫升),转铁蛋白(σ,圣路易斯,密苏里州,10µg /毫升),和胰岛素(σ,圣路易斯,密苏里州,0.25 U /毫升)补充道。
免疫组织化学
免疫组织化学研究使用石蜡包埋文化进行样品的准备如下:文化与PBS样本清洗一次。样本然后为∼12小时10%缓冲福尔马林固定的解决方案。福尔马林溶液被移除和80%乙醇溶液添加10分钟然后删除。95%的乙醇溶液添加15分钟两次。最后,100%的乙醇添加10分钟。文化内容被小心翼翼地机械地从培养皿中删除。样本然后石蜡包埋。系列8µm削减组织获得的微观评价和染色。免疫组织化学染色进行使用DAKO (Carpinteria, CA)自动Flex系统。主要抗体CDX-2,钙粘蛋白、SMA Synaptophysin DAKO和在制造商获得浓度。 Antibody to lysozyme (DAKO) was diluted 1∶1500 in Antibody Diluent (DAKO). Antibody to Chromogranin A (Immunostar, Hudson, WI) was diluted 1∶200 in Antibody Diluent (DAKO).
植入
7 - 11天文化样本被允许提升和部分分离培养板作为自然生长过程的一部分。这些样本被放置在无纺布5毫米聚乙醇酸(PGA)感到磁盘(外植,休斯顿,德克萨斯州)。免疫功能不全的NOD-SCID-IL2Rγnull (NSG)小鼠麻醉的方式符合协议建立由加州大学洛杉矶分校DLAM集团(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/19052619)。在前腹壁皮下口袋里了。培养细胞的PGA觉得放在口袋里和6 - 0缝线缝合(Ethicon,萨默维尔市,新泽西)被用来缝合底层肌肉的脚手架。覆盖切口关闭没有张力使用3 - 0丝绸(Ethicon,萨默维尔市,新泽西)缝合。鼠标是牺牲后28天,植入是切除和固定在缓冲10%福尔马林溶液。样品是嵌入式,切片,染色显微镜评估。
定量实时聚合酶链反应
信使RNA是孤立的和样品RNeasy RNA隔离设备(试剂盒,瓦伦西亚,CA)制造商的协议。信使rna样本然后准备的rt - pcr反应Quantitect探针rt - pcr试剂盒(试剂盒)和TaqMan基因表达分析(应用生物系统公司,卡尔斯巴德,CA)平滑肌肌动蛋白(化验ID Mm01546133_m1),肌间线蛋白(Mm00802455_m1)、波形蛋白(Mm00449208_m1)和GAPDH (Mm99999915_g1)。GAPDH是用作内务工作规范化RNA基因数量。样本分析LightCycler 480实时PCR系统(罗氏,印第安纳波利斯)中描述设置Quantitect探测设备。比较CT方法被用来计算相对基因表达。
确认
人类肠道组织适当的机构批准了加州大学洛杉矶分校病理学系临床病理核心实验室。我们感谢莎拉博士干这项工作以及协调实验室人员实现采购协议。
免疫组织化学染色和加工进行外科病理学实验室。蕾妮·鲍尔斯和Nazlin谢里夫给专家建议和慷慨的技术援助。
作者的贡献
构思和设计实验:米高梅JCYD女士。进行了实验:问NYL JW ZJ SCT VJ。分析了数据:问NYL JW毫升ZJ米高梅JCYD女士。造成试剂/材料/分析工具:毫升米高梅JCYD女士。该报写道:米高梅JCYD女士问毫升。
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