数据
摘要
最近的报道表明肠道菌群参与了结直肠癌(CRC)的进展。我们利用焦磷酸测序技术对16S rRNA基因进行分析，以确定结直肠癌患者和健康对照组中微生物群的整体结构;我们研究了肠腔、癌变组织和匹配的正常非癌变组织的微生物群。此外，我们使用直肠拭子样本调查了粘膜粘附的微生物组成，因为组织粘附的细菌群落的结构可能在肠道清洁后发生改变。我们的研究结果表明，肠腔和癌变组织的微生物结构有显著差异。增强从饮食中获取能量或与宿主进行代谢交换的系统类型在腔内更为丰富。腔内厚壁菌门较多，拟杆菌门和变形菌门较少。癌变组织和非癌变组织的整体微生物结构相似;但肿瘤菌群的多样性较低。与健康个体相匹配的肠道菌群相比，CRC患者的肠道菌群和粘膜粘附菌群结构不同。 Lactobacillales was enriched in cancerous tissue, whereasFaecalibacterium是减少了。在粘膜粘附菌群中，双歧杆菌,Faecalibacterium,Blautia在CRC患者中降低，而梭菌属，Porphyromonas，消化链球菌属,Mogibacterium是丰富。在肿瘤患者腔内，与代谢紊乱或与宿主代谢交换相关的主要类群为丹毒科、普雷沃菌科和科里杆菌科。结合之前的报道，这些结果表明肠道菌群与结直肠癌风险相关，肠道菌群可能通过与宿主的共代谢或代谢交换来影响结直肠癌风险。然而，粘膜相关微生物群主要通过与宿主的直接相互作用潜在地影响CRC风险。
引用:陈伟，刘峰，凌志，佟晓霞，项超(2012)结直肠癌患者肠道管腔及黏膜相关菌群。PLoS ONE 7(6): e39743。https://doi.org/10.1371/journal.pone.0039743
编辑器:Antonio Moschetta，意大利巴里大学和南马里奥内格里财团
收到:2012年1月12日;接受:2012年5月25日;发表:2012年6月28日
版权:©2012 Chen et al。这是一篇开放获取的文章，根据创作共用署名许可的条款发布，允许在任何媒介上不受限制地使用、分发和复制，前提是要注明原作者和来源。
资助:国家基础研究与发展计划(973计划)2007CB513001项目资助http://www.973.gov.cn/AreaAppl.aspx)．资助者在研究设计、数据收集和分析、发表决定或手稿准备中没有任何作用。
利益冲突:作者宣称不存在竞争利益。
简介
结直肠癌是世界上最常见的恶性肿瘤类型之一。与结直肠癌相关的重要因素之一是肠道菌群[1]．人类胃肠道中有大约1000种细菌，共计10种14细胞，是人类真核细胞数量的10倍多[２]．肠道菌群除了通过代谢影响宿主营养外，还通过控制上皮细胞增殖和分化、影响免疫系统发育、抵御病原体等方式影响人体[3]．
越来越多的证据表明，肠道菌群与结直肠癌的进展密切相关[1]，[4]．魏等．发现增加了瘤胃球菌属obeum而且Allobaculum类似于发生癌前粘膜病变的大鼠粪便中的细菌［5］．的增加普氏菌在CRC患者中有报道吗[6]．王等．发现CRC患者粪便中产生丁酸盐的细菌减少[7]表明细菌代谢物的益处。
然而，肠组织中的粘膜相关微生物群与腔内不同[8]这些微生物也可能发挥重要作用。Marchesi和同事分析了6名CRC患者的细菌16S rDNA序列，并确定益生菌如Coriobacteria通过分析6例CRC患者的细菌16S rDNA序列，发现其在肿瘤组织中富集[9]这表明益生菌可能在结直肠癌的进展中发挥特殊作用。梭菌属nucleatum在结肠癌组织中发现与结直肠癌密切相关[10]．然而，肠道菌群的确切组成及其在CRC进展中的作用尚不清楚，因为CRC患者肠道菌群的整体结构尚未完全阐明。
细菌或细菌组分通过与宿主的直接相互作用或与宿主的间接共代谢或代谢交换来发挥作用。Van der Waaij等．发现共生菌生活在肠管悬浮液中，与上皮细胞无直接接触[11]．我们假设粘膜相关菌群主要通过与宿主直接相互作用发挥作用，肠道内(即粪便)菌群主要通过共代谢或代谢交换发挥作用。在本研究中，我们对16S rRNA基因进行了焦磷酸测序，以分析CRC患者和健康对照组微生物群的整体结构。我们研究了肠腔、癌变组织和匹配的正常非癌变组织的微生物群。此外，我们使用直肠拭子样本检查了粘膜粘附的微生物组成，因为组织粘附的细菌群落的结构可能在肠道清洁后发生改变[12]．此外，我们试图识别在CRC发展中可能发挥重要作用的关键细菌系统类型或潜在生物标志物。
材料与方法
患者和对照组
选取中国浙江大学医学院附属第一医院37-88岁CRC患者46例。我们从这些患者中收集了以下样本:[21个粪便(stp)样本，32个肠道拭子(swp)样本和每个癌组织(cat)的27个样本，匹配的癌旁组织(pa2t)距离癌组织2-5厘米，以及匹配的癌旁组织距离癌组织10-20厘米(pa10t)]。没有从所有CRC患者中收集粪便、直肠拭子和组织样本，原因如下:水样便、粪便太稀而无法收集;样品在室温下存放时间过长;或患者在采集直肠拭子样本时感觉不舒服。此外，选择56名符合性别匹配、年龄与结直肠癌患者样本相近、无结肠腺瘤的健康志愿者作为对照;从这些志愿者身上收集了22份粪便样本(stc)和34份棉签(swc) (表1)．我们将组织、粪便和拭子的微生物区系分别定义为组织微生物区系、管腔微生物区系和粘膜粘附微生物区系。我们将组织微生物区系和粘膜粘附微生物区系定义为粘膜相关微生物区系。没有研究对象患有糖尿病、传染病或特殊饮食。所有受试者的BMI都在20到24之间。本研究由中国浙江大学医学院附属第一医院伦理委员会批准;所有研究参与者均获得书面知情同意。
样本采集和DNA提取
所有受试者在样本采集时均未服用药物，在样本采集后至少一个月内也未使用抗生素。在排便前采集每个受试者的拭子和粪便样本。术中从癌变组织和癌旁组织(分别离癌变组织2-5 cm和10-20 cm)中采集肠道样本。所有样品都被冷冻并保存在−80°C，直到进一步使用。
基因组DNA从组织和拭子样本中提取，使用QIAamp DNA Mini Kit (Qiagen, Hilden, Germany)，根据制造商的说明进行了微小的修改。用1ml PBS剧烈搅动拭子中的细菌细胞。将细胞在17000g离心10分钟后制成颗粒。将颗粒重新悬浮在80 μ l酶溶液中(22.5 mg溶菌酶粉[目录编号:;L6876，西格玛]和40个单位的mutanolysine[目录编号:M9901, Sigma]溶解于每个样品80 μ l TE中)[13]，加入锆珠(0.1 mm) 100 mg。混合物在小型珠状搅拌器(FastPrep, Thermo Electron Corporation, USA)中搅拌三次，每次40秒，然后在37°C下孵育40分钟[14]．后续步骤按照制造商的建议执行。肠组织用无菌水大量冲洗，用电动均质器(PRO Scientific, Oxford, Connecticut, USA)在80 μ l酶溶液中均质，37℃孵育40分钟，然后在56℃ATL缓冲液和蛋白酶k中完全裂解1-3小时。70℃孵育步骤从10分钟延长到30分钟[8]．使用QIAamp DNA Stool Mini Kit提取粪便细菌基因组DNA，并进行如上所述的修改。
焦磷酸测序
使用通用引物(27F5 ' -AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3 '533 r5 ' -TTACCGCGGCTGCTGGCAC-3 ')结合FLX钛适配器和样本条形码序列。循环参数为:95℃初始变性5 min;在95°C (30 s)变性25个循环，55°C (30 s)退火，72°C (30 s)伸长;72°C最后延伸5 min。每个样品的3个单独PCR反应汇总用于焦磷酸测序。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳分离，QIAquick凝胶提取试剂盒(Qiagen)纯化。从每个样品中提取相同浓度的扩增子。按照制造商的建议进行乳状液PCR和测序［15］．
所有焦磷酸测序reads均根据条形码和引物序列进行筛选。结果序列被进一步筛选和筛选质量和长度。去除小于150 nt、包含歧义字符、包含两个以上引物错配或包含单个核苷酸重复超过6 nt的序列[16]．经条形码和引物序列过滤，共获得高质量序列808008条，有效序列占80.8%。
生物信息学分析
根据条形码将高质量的序列分配到样品中。序列按照SILVA比对比对[17]，[18]并聚成操作分类单元(OTUs)。达到97%相似水平的otu用于多样性(Shannon)、丰富度(Chao)、Good’s覆盖率和使用Mothur (version 1.5.0)进行稀疏曲线分析。http://schloss.micro.umass.edu/[19]．在80%的置信水平下，根据SILVA 106使用Mothur对相似度为97%的OTUs进行分类分配。
利用R gplots包的热图2函数和7个类群的属信息构建热图[20]．使用OTUs对每个样本进行未加权UniFrac距离度量分析[21]，[22]，根据距离矩阵进行主成分分析(PCA)。为了选择组间结构偏析显著的OTUs，采用Simca-P+12.0 (http://www.umetrics.com/)．PLS-DA用于代谢组学、宏基因组学和微阵列分析，具有可变重要性投影(VIP)>1的OTUs被认为是模型的重要贡献者［5］，[23]，[24]，[25]．
结果
焦磷酸测序结果的特点
本研究共获得高质量序列808008条，平均每个样本4253条。摘要信息显示在表2，每个样品的详细特征见表S1．
群落丰富度(Chao)和多样性(Shannon)的估计量显示在表2．cat组与pa10t组Shannon指数差异有统计学意义(3.77±0.67 vs. 4.13±0.40，P= 0.012)，表明与癌组织相比，非癌性正常组织(即距离癌组织10-20厘米的组织)的多样性显著更高。每个样品的详细特征列于表S1．7个类群的稀疏性分析见图S1表明在探索更多的序列后，很可能会检测到更多的系统型。The Good对每一组的覆盖率都超过97%，这表明在这些组中鉴定出的16 S rDNA序列代表了本研究样本中存在的大多数细菌。
肠管和癌组织的微生物结构有显著差异
我们研究了结直肠癌患者的粪便、直肠拭子和组织微生物群，以及健康个体的粪便和直肠拭子细菌群落。在门水平上，每一组别的整体菌群结构显示于图1．所有类群的优势门均为厚壁菌门、拟杆菌门和变形菌门。组织标本和拭子标本中分别有17门和13门，粪便标本中仅有9门。微生物区系序列的门特异性相对丰度显示，拭子微生物区系表现出与组织更接近的相似性。根据细菌属水平的热图也显示了同样的现象(图S2)．
“其他”代表未分类的细菌，氯黄菌属、转铁杆菌属、氯黄菌属、热球菌属、酸杆菌属、板菌属、Lentisphaerae、螺旋体属、协同菌属、软菌属、疣菌属和蓝藻属。前8个门在粪便样本中不明显，前4个门在拭子样本中不明显。
为了比较CRC患者的整体菌群结构，基于每个样本的OTUs计算Unifrac距离矩阵[26]．基于距离的PCA结果显示，肠腔内(即粪便)的细菌结构存在显著差异。此外，癌组织和粘膜粘附菌群(即拭子)与一些管腔和组织微生物群重叠，由前两个主成分评分显示，占总变异的30.57%和9.12% (图2一个)．
每个符号代表一个样本。(A) cat、stp、swp组;(B) cat组、pa2t组、pa10t组;(C) swp组和swc组;(D)组stp和stc。
在不同的细菌水平下，肠管和癌变组织的组成有显著差异。由LEfSe进行的组织和腔内微生物群及其优势细菌的结构的分支图表示显示在图3[27]；两个群落的类群差异最大。焦磷酸测序数据表明，与腔内相比，组织中存在更多的门。三种优势门厚壁菌门(50.82% vs. 77.59%)P<0.001)，拟杆菌门(26.37% vs. 13.68%，P= 0.002)，变形菌门(14.51% vs. 5.57%，P= 0.004) -在癌组织和肠管之间均表现出统计学上的显著差异。梭杆菌(4.97% vs. 0.47%，P<0.001)和增效因子(0.14% vs. 0%，P= 0.002)组间也有差异。在家族水平上，癌组织和肠管之间有26个统计学上的显著差异。拟杆菌科相对丰度(16.9% vs. 8.3%，P<0.001)，链球菌科(10.2% vs. 2.8%，P= 0.0029)， Fusobacteriaceae (4.57% vs. 0.47%，P<0.001)，消化性链球菌科(4.07% vs. 0.89%，P<0.001)，细孔科(2.87% vs. 0.68%，P= 0.004)和巴氏杆菌科(2.25% vs. 0.007%，P<0.001)在癌变组织中显著高于在肠腔中。Lachnospiraceae的比例显著降低(17.1% vs. 46.7%;P<0.001)，瘤胃球菌科(4.24%对13.3%，P<0.001)，乳酸杆菌科(0.02% vs. 2.88%，P<0.001)，与肠腔相比(表S2)．
(A)癌组织和肠腔在统计学和生物学上一致差异的分类学表示。差异由最丰富的一类的颜色表示(红色表示癌组织，黄色不显著，绿色肠腔)。每个圆的直径与分类单元的丰度成正比。(B)差异丰度属的LDA得分直方图。Cladogram是一种宏基因组分析方法，在Wilcoxon Mann-Whitney检验后进行线性判别分析，以评估每个差异丰度分类单元或OTU的效应大小;分支图根据效应大小显示。
在属水平上微生物组成也有显著差异，癌组织和肠管之间有43个显著不同属。拟杆菌，链球菌，普氏菌，梭菌属，消化链球菌属，嗜血杆菌，Gemella，韦永氏球菌属，Granulicatella，摩根氏菌属,Porphyromonas，占癌变组织中细菌总数的1%以上，在癌变组织中表现出相对较高的丰度。Pseudobutyrivibrio，Blautia，乳酸菌，Roseburia，Dorea而且Coprococcus，占粪便中细菌总数的1%以上，在肠腔中相对于癌变组织中更为丰富。关于腔内微生物群和癌组织微生物群之间差异的其他信息可以在表S2．
癌变组织和匹配的正常非癌变组织中的细菌群落
虽然癌组织微生物群的多样性(Shannon)较低(表2)，肿瘤组织与匹配的正常正常组织的微生物群落相似(图1，图S2)．经Unifrac非加权PCA分析，癌组织和非癌组织的微生物群落根据PC1和PC2相似(分别为51.37%和4.35%的解释方差)(图2 b)，表明肿瘤组织与非癌组织的微生物组成无明显差异。
进行了基于分类的比较，以确定肿瘤和非癌组织微生物群之间的差异。cat、pa2t和pa10t微生物区系分别为12、17和14门，169、198和198属。Shannon(多样性)分析证实了这一点。癌组织和非癌组织的微生物群落在门水平上无统计学差异。在pa2t和pa10t中，Alphaproteobacteria占细菌总数的比例都不到1%，在猫中最为普遍。更少的Ochrobactrum与猫相比，pa2t中存在属成员。与pa10t相比，cat中杆菌类高度富集。然而,属芽孢杆菌杆菌属，在猫中较少流行。与pa10t相比，猫的Ruminococcaceae家族显著降低。属Faecalibacterium与猫相比，隶属于Ruminococcaceae的大肠杆菌的pa10t也高度富集。属Paraprevotella，Parabacteroides, Phascolarctobacterium，Acidocella,Methylobacterium显示出低丰度;然而，与猫相比，它们的pa10t均有统计学意义上的富集。此外，样本中细菌的相对丰度随着与癌变组织的距离而逐渐增加或减少(表3)．
应用宏基因组分析方法LefSe鉴定导致cat和pa10t差异的关键系统型。乳酸菌属(主要成分乳酸菌属)，在猫中富集Phascolarctobacterium，瘤胃球菌科(主要成分Faecalibacterium)，它们在pa10t中富集，是导致癌组织和非癌组织微生物区系差异的主要系统类型。
结直肠癌患者和健康个体的粘膜粘附菌群
因为手术前肠道清洁可能会改变微生物组成，所以研究了直肠拭子上收集的样本中的粘膜粘附细菌。正如预期的那样，与组织相比，微生物结构略有不同(图1，图2一个)，与肠腔相似(部分样本在PCA图上重叠)，因为拭子样本上不可避免地有粪便。
基于每个样本otu相对丰度的未加权Unifrac PCA使用PC1和PC2在CRC患者和健康个体之间进行了分离(解释方差分别为10.64%和6.58%)(图2 c)．卟啉单胞菌科(3.86% vs. 1.41%;P= 0.045)，梭杆菌科(3.72% vs. 0.18%，P= 0.045)和Peptostreptococcaceae (2.13% vs. 0.66%，P= 0.03)，而双歧杆菌科(0.03% vs. 0.32%，P<0.001)和Alcaligenaceae (0.39% vs. 0.63%，P= 0.03)在CRC患者中降低。属梭菌属(Fusobacteriaceae),Porphyromonas(Porphyromonadaceae),消化链球菌属(Peptostreptococcaceae),Gemella，Mogibacterium,而且克雷伯氏菌在CRC患者中富集。Filifactor，Catonella而且月形单胞菌属在健康个体中是不存在的Faecalibacterium，Blautia，毛螺菌属，双歧杆菌属(Bifidobacteriaceae)和Anaerostipes在CRC患者中降低，以及Catenibacterium而且加德纳菌属(双歧杆菌科)在结直肠癌患者样本中缺失(图4)．
(A) swp和swc的属不同。(B) stp和stc之间的区别。曼-惠特尼检验用于评估各组间比较的重要性。* * * P < 0.05, P < 0.01。
Porphyromonas(隶属于卟啉单胞科)，梭菌属，消化链球菌属,而且Mogibacterium在CRC患者中富集，而Faecalibacterium，Blautia,双歧杆菌属在这些病人中被消耗殆尽。根据LefSe分析，这些是促成结直肠癌患者和健康个体粘膜粘附菌群结构分离的关键系统类型。
结直肠癌患者和健康个体肠道微生物组成
经Unifrac非加权PCA分析，结直肠癌患者肠道菌群可与健康人区分(图2 d)．丹毒科(6.09% vs. 2.42%;P= 0.035)， Prevotellaceae (1.46% vs. 1.14%，P= 0.035)，科里杆菌科(1.19% vs. 0.74%，P= 0.035)和Peptostreptococcaceae (0.89% vs. 0.45%，P= 0.035)在CRC患者中显著富集。在结直肠癌患者的拭子样本中，消化性链球菌也丰富，但相对丰度高于癌变组织。属消化链球菌属(Peptostreptococcaceae),Porphyromonas，Mogibacterium，Anaerococcus，Slackia，Anaerotruncus，Collinsella(Coriobacteriaceae),脱磷孤菌属，真细菌而且Paraprevotella与对照组相比，在患者中也更普遍(图4 b)．
丹毒科、普氏菌科、科氏菌科(Collinsella)，消化链球菌属,Anaerotruncus(Clostridiales)，在患者中富集，被归类为有助于CRC患者和健康个体肠道菌群结构分离的关键系统型。
识别负责癌症和对照样品粘膜相关菌群结构分离的关键OTUs
西尔斯和帕尔多尔在最近的一份报告中提出了一种Alpha-Bug假说——某些微生物组成员具有独特的毒力特征，如肠毒素脆弱拟杆菌，不仅直接促癌，而且能够重塑整个微生物群，从而促进粘膜免疫反应和结肠上皮细胞改变，导致结肠癌[28]．我们假设这种Alpha-Bug可能属于粘膜相关细菌群落。首先，利用严格工具LEfSe识别显性otu。我们发现了6个主要的OTUs，它们都在癌组织中减少，这些关键贡献者属于Faecalibacterium，Dorea，无教养的瘤胃球菌属sp。瘤胃球菌属gnavus、蛇螺旋体和消化性链球菌科。我们生成了一个PLS-DA模型来寻找更多可能导致分离的OTUs。根据其在投影中的可变重要性(VIP)选择差异分布的otu。共有27个具有VIP>2的OTUs被认为是相对重要的贡献者(其中4个富集于cat;其他的都减少了)。它们分别属于Lachnospiracea(14)、Bacteroidaceae(6)、Ruminococcaceae(6)和Peptostreptococcaceae (1);cat和pa10t均表现出显著差异(P<0.05, Mann-Whitney检验)。另外两个OTUs密切相关瘤胃球菌属gnavus4个OTUs属Faecalibacterium在癌变组织中也被发现减少了。
此外，使用粘膜粘附的细菌样本进行分析。两个主要的OTUs消化链球菌属sp.和Parvimonassp.在CRC患者中富集超过100倍。相关的一个OTU拟杆菌caccae一个是关于梭状芽胞杆菌sp也得到了丰富。两个OTUs属于Faecalibacterium而且Blautia在患者中显著减少。我们根据PLS-DA选择了69个VIP>2的OTUs，这些OTUs是重要的贡献者，其中64个在CRC患者和对照组之间存在显著差异。其中OTUs属6个Faecalibacterium6个OTUs属Blautia在结直肠癌患者中减少。另外，两个OTUs与梭菌属varium，一个OTU相关拟杆菌xylanisolvens，一个OTU相关Dialister pneumosintes在结直肠癌患者中高度富集。另外两个OTUs与消化链球菌属sp。而且Parvimonas sp。在结直肠癌患者中富集。
讨论
我们推测，粘膜相关菌群主要通过与宿主的直接相互作用作用，肠腔微生物群主要通过与宿主的共代谢或代谢交换作用。我们利用条形码多重-454焦磷酸测序技术比较CRC患者与健康对照组癌组织和肠管的细菌组成。我们还通过使用直肠拭子样本调查了粘膜粘附的微生物组成，因为肠道清洁后细菌群落可能会发生改变。我们发现癌组织中微生物群的结构与肠腔有明显不同。厚壁菌门、拟杆菌门、变形菌门和优势属的相对丰度拟杆菌，链球菌,Pseudobutyrivibrio都是不同的。厚壁菌门已被证明可以增强从饮食中获取的能量，在肠腔中高度富集[29]，[30]，[31]．此外，优势属Pseudobutyrivibrio表现为主要代谢物丁酸，以及乳酸和甲酸[32]．相比之下，在黏膜中高度富集的拟杆菌门(Bacteroidetes)可能主要参与与肠道的相互作用[33]．黏膜中高度富集的革兰氏阴性主要细菌Proteobacteria，其外膜由脂多糖组成，可能通过T2SS或T3SS等细菌分泌系统与肠细胞直接相互作用[34]，[35]．此外，粘膜中富集的梭杆菌和增效菌也感染肠道组织[36]，[37]，[38]．不出所料，我们的研究结果表明，粘膜粘附菌群的结构与组织菌群更相似。粘膜粘附微生物结构也与腔内微生物群相似;部分原因是不可避免的粪便在棉签上交叉。我们假设拭子菌群代表粪便菌群和较不紧密附着的粘膜菌群的组合，而组织菌群代表紧密定植的细菌。Unifrac非加权PCA分析证实了这一结果。癌变组织和非癌变组织的总体微生物结构相似。与健康个体相匹配的肠道菌群相比，CRC患者的肠道菌群和粘膜粘附菌群在结构上是分离的。
Sears和Pardoll提出了一种Alpha-Bug假说——某些微生物组成员不仅直接促癌，而且能够重塑整个微生物组以促进癌症进展。我们假设，也有某些微生物群落可以抵御病原体，防止癌症的进展;例如，在小鼠肠道中发现的节段性丝状细菌会诱导炎症并抵御病原体[39]，[40]．焦磷酸测序数据表明Faecalibacterium在癌组织中的含量明显低于正常组织。与健康对照组相比，这一发现在CRC患者的粘膜粘附菌群中得到了证实。此外，四种被认为是区分肿瘤和正常组织微生物结构的关键因素的OTUs显著减少。此外，6种被认为是区分CRC患者和健康个体粘膜粘附微生物结构的关键因素的OTUs显著减少。这些结果表明Faecalibacterium与CRC呈负相关。索科尔等．报道称,f . prausnitzii的主要种Faecalibacterium通过阻断NF-κB的表达和IL-8的分泌，对结肠炎具有抗炎作用[41]．此外,f . prausnitzii诱导对病原体的定植抗性[42]．我们假设Faecalibacterium在结直肠癌中发挥益生菌作用。有趣的是，我们发现三种OTUs与瘤胃球菌属gnavus在癌变组织中显著减少。r . gnavus产生一种抗菌肽，保护宿主免受病原体的侵害[43]．此外，益生菌的量双歧杆菌属，通过竞争粘附位点和分泌抗菌肽来对抗病原体的定殖[44]，在CRC患者中显著降低。此外,梭菌属是一种关键的系统型，在结直肠癌患者的拭子样本中显著富集，并与结直肠癌呈正相关。被确定为主要贡献者的充实的otu中有两个与梭菌属varium，可诱发溃疡性结肠炎[36]，[45]．梭菌属也在肿瘤组织中富集，尽管这一发现没有统计学意义(数据未显示)。综上所述，我们的发现表明梭菌属与结直肠癌密切相关。最近发表的两份报告证实了这些结果[46]，[47]．Porphyromonas与Porphyromonadaceae家族有关，在CRC患者中也大量发现。虽然很少在肠道中报道，p . gingivalis的一个主要种类Porphyromonas，穿透牙周组织，破坏宿主细胞活性，改变微生物群组成，诱发牙周炎[48]，[49]，[50]．然而,消化链球菌属是一种共生菌，可在免疫抑制或创伤性情况下感染包括肠粘膜在内的身体多个部位。这些结果表明，黏膜中的微生物组可能主要通过与宿主直接相互作用来发挥作用。
肠道菌群产生的代谢物和抗原可能与宿主代谢和免疫相互作用，在影响CRC风险中发挥重要作用[51]，[52]．关于肠道菌群，CRC患者的主要系统类型- - - - - -丹毒科、普氏菌科和科里杆菌科都与代谢紊乱或能量代谢有关。丹毒科(Erysipelotrichaceae)、普雷沃氏菌科(Prevotellaceae)和科里杆菌科(Coriobacteriaceae)在肥胖人群和肥胖小鼠以及“西方饮食”或高脂肪饮食相关小鼠中富集，它们与能量产生或肥胖密切相关[53]，[54]，[55]，[56]，[57]，[58]．流行病学研究表明，“西方饮食”或肥胖(及其相关代谢疾病)与结直肠癌之间存在很强的相关性。看来，腔内微生物群某些成员的富集是“西方饮食”或肥胖与结直肠癌之间联系的基础。此外，富集的细菌脱磷孤菌属还原硫酸盐以产生硫化氢，据报道，硫化氢可能是CRC的危险因素之一[59]，[60]．此外，王等．CRC患者粪便中产生丁酸盐的细菌减少了[7]丁酸盐在预防癌症方面起着重要作用[61]．这些发现表明，肠道菌群可能通过与宿主的共代谢或代谢交换对CRC风险产生重要影响。
总之，我们的结果表明肠道微生物群与结直肠癌风险相关，肠道内微生物群可能通过与宿主的共代谢或代谢交换来影响结直肠癌风险。粘膜相关微生物群可能主要通过与宿主的直接相互作用来影响CRC风险。Alpha-Bug假说可能是这样提出的:粘膜相关微生物群的某些微生物组成员不仅直接促癌，而且能够重塑整个肠腔微生物群，促进结肠癌的进展。我们的结果代表了CRC患者微生物结构的全面图景，有助于进一步阐明CRC的病因学。然而，关于粘膜相关菌群和腔内菌群的更详细的信息是必要的。此外，导致潜在变化的确切机制仍不清楚。因此，未来的研究有必要探讨CRC微生物区系及其在CRC进展中的不同作用。
支持信息
图S1。
稀疏曲线。利用cat、pa2t、pa10t、stc、stp、swc和swp组微生物群的焦磷酸测序数据，在3%距离处计算稀疏曲线。
https://doi.org/10.1371/journal.pone.0039743.s001
(PDF)
图S2。
cat、pa2t、pa10t、stc、stp、swc和swp组200个丰度最高属的热图分析。y轴是相邻连接的系统发生树，每一行都是不同的系统类型。丰度图显示16S rRNA基因热裂解序列在各组中的比例。
https://doi.org/10.1371/journal.pone.0039743.s002
(PDF)
作者的贡献
构思设计实验:WC CX ZL FL，执行实验:WC XT ZL FL，数据分析:WC CX ZL FL，贡献试剂/材料/分析工具:WC FL ZL XT CX。撰写论文:WC ZL CX FL。
参考文献
- 1.Azcarate-Peril MA, Sikes M, Bruno-Barcena JM(2011)肠道菌群、胃肠道环境与结直肠癌:益生菌在预防结直肠癌中的假定作用?美国物理杂志胃肠测试肝脏物理301:G401-424。
- 2.Ley RE, Peterson DA, Gordon JI(2006)形成人类肠道微生物多样性的生态和进化力量。124号电话:837-848。
- 3.Rowland IR(2009)胃肠道微生物群在结直肠癌中的作用。Curr Pharm Des 15:15 24 - 1527。
- 4.Candela M, Guidotti M, Fabbri A, Brigidi P, Franceschi C，等。(2011)人肠道微生物群:与宿主的交叉对话及其在结直肠癌中的潜在作用。暴击Rev微生物37:1 - 14。
- 5.魏华，董磊，王涛，张敏，华伟，等。(2010)以肠道微生物群结构变化作为监测致癌物暴露引起宿主健康变化的替代终点。FEMS微生物生态学73:577-586。
- 6.王晓明，王晓明，王晓明，等。(2011)结直肠癌患者微生物代谢失调的研究进展。PLoS One 6: e16393。
- 7.王涛，蔡刚，邱勇，费楠，张敏等。(2011)结直肠癌患者与健康志愿者肠道菌群的结构分离。ISME J。
- 8.Eckburg PB, Bik EM, Bernstein CN, Purdom E, Dethlefsen L，等(2005)人体肠道微生物菌群多样性。科学308:1635-1638。
- 9.Marchesi JR, Dutilh BE, Hall N, Peters WH, Roelofs R等(2011)人类结直肠癌微生物群研究。PLoS One 6: e20447。
- 10.Ray K(2011)结直肠癌:在结肠癌组织中发现有核梭杆菌——感染会导致结直肠癌吗?胃肠醇肝醇8:662。
- 11.van der Waaij LA, Harmsen HJ, Madjipour M, Kroese FG, Zwiers M，等。(2005)16S rrna荧光探针在人结肠和回肠末端活检中的细菌种群分析:共生细菌悬浮生活，与上皮细胞无直接接触。肠炎11,865 - 871。
- 12.Mai V, Stine OC, Morris JG Jr(2005)收集粪便样本的时间。科学310:1118;作者重播1118。
- 13.范豪特，胡ys G, Brandt E, Swings J(2004)利用16S rRNA基因引物对人粪便中微生物群的变性梯度凝胶电泳进行时间稳定性分析。FEMS微生物生态48:437-446。
- 14.凌志，孔杰，刘峰，朱华，陈霞等。(2010)细菌性阴道病相关阴道菌群多样性的分子分析。BMC Genomics 11: 488。
- 15.马格丽斯，李志强，李志强，等。(2005)微制造高密度皮升反应器的基因组测序。自然437:376-380。
- 16.Hamady M, Walker JJ, Harris JK, Gold NJ, Knight R(2008)用于焦磷酸测序的纠错条形码引物。Nat方法5:235-237。
- 17.Pruesse E, Quast C, Knittel K, Fuchs BM, Ludwig W，等(2007)SILVA:与ARB兼容的质量检查和校准核糖体RNA序列数据的综合在线资源。核酸Res 35: 7188-7196。
- 18.Schloss PD, Westcott SL, Ryabin T, Hall JR, Hartmann M, et al.(2009)介绍母亲:用于描述和比较微生物群落的开源、平台独立、社区支持的软件。应用环境微生物75:7537-7541。
- 19.Brown KR(1977)厌氧感染的诊断和管理。热带理论7:111-114。
- 20.Gentleman RC, Carey VJ, Bates DM, Bolstad B, Dettling M，等(2004)生物导体:计算生物学和生物信息学的开放软件开发。基因组生物学5:R80。
- 21.Lozupone C, Hamady M, Knight R (2006) unifrac—一种在系统发育背景下比较微生物群落多样性的在线工具。BMC生物信息学7:371。
- 22.Lozupone C, Knight R (2005) UniFrac:一种比较微生物群落的系统发育新方法。应用环境微生物71:8228-8235。
- 23.陈艳，杨峰，陆华，王波，雷东等。(2011)肝硬化患者粪便微生物群落特征。国际肝病杂志54:562-572。
- 24.Domenici E, Wille DR, Tozzi F, Prokopenko I, Miller S等(2010)通过病例对照收集的多分析物分析抑郁症和精神分裂症的血浆蛋白生物标志物。PLoS One 5: e9166。
- 25.Perez-Enciso M, Tenenhaus M(2003)用微阵列数据预测临床结果:偏最小二乘判别分析(PLS-DA)方法。哼Genet 112: 581-592。
- 26.Costello EK, Lauber CL, Hamady M, Fierer N, Gordon JI等。(2009)人体栖息地细菌群落的时空变化。科学杂志326:1694-1697。
- 27.李文杰，李文杰，李文杰，等。(2011)宏基因组生物标记物的发现与解释。基因组生物学12:R60。
- 28.Sears CL, Pardoll DM(2011)视角:阿尔法细菌，它们的微生物伙伴，以及与结肠癌的联系。中华传染病杂志203:306-311。
- 29.Costello EK, Gordon JI, Secor SM, Knight R(2010)缅甸蟒餐后肠道菌群重塑。Isme j 4: 1375-1385。
- 30.Ley RE, Turnbaugh PJ, Klein S, Gordon JI(2006)微生物生态学:人类肠道微生物与肥胖相关。自然444:1022-1023。
- 31.Turnbaugh PJ, Ley RE, Mahowald MA, Magrini V, Mardis ER，等(2006)与肥胖相关的肠道微生物组具有增加的能量收集能力。自然444:1027-1031。
- 32.Paillard D, McKain N, Chaudhary LC, Walker ND, Pizette F，等。(2007)瘤胃不同类丁酸弧菌的系统发育位置、脂质代谢和丁酸盐产量的关系。安东尼·范·列文虎克91:417-422。
- 33.乔利F, Mayeur C, Bruneau A, Noordine ML, Meylheuc T，等(2010)成年短肠综合征患者粪便和粘膜相关菌群的急剧变化。Biochimie 92: 753-761。
- 34.Beeckman DS, Vanrompay DC(2010)细菌分泌系统，重点是衣原体III型分泌系统。当前问题Mol生物学12:17-41。
- 35.Brown NF, Finlay BB (2011) III型分泌系统和效应物的潜在来源和水平转移。暴徒Genet元素1:118-121。
- 36.Ohkusa T, Sato N, Ogihara T, Morita K, Ogawa M，等(2002)溃疡性结肠炎患者结肠黏膜中定位的变异梭杆菌刺激种特异性抗体。中国胃肠病杂志17:849-853。
- 37.Strauss J, Kaplan GG, Beck PL, Rioux K, Panaccione R等(2011)肠道粘膜源性核梭杆菌的侵袭潜能与宿主IBD状态呈正相关。肠炎
- 38.Vartoukian SR, Palmer RM, Wade WG(2007)“增效剂”厌氧菌13:99-106。
- 39.Atarashi K, Tanoue T, Honda K(2010)肠道共生细菌诱导固有层Th17细胞。疫苗28:8036-8038。
- 40.王志刚，王志强，王志强，等。(2009)丝状细菌诱导肠道Th17细胞的实验研究。139号号房:485-498。
- 41.Sokol H, Pigneur B, Watterlot L, Lakhdari O, bermuez - humaran LG, et al. (2008) prausnitzii Faecalibacterium prausnitzii是一种通过克罗恩病患者肠道菌群分析鉴定的抗炎共生菌。中国科学院学报(自然科学版)105:16731-16736。
- 42.Benus RF, Harmsen HJ, Welling GW, Spanjersberg R, Zijlstra JG，等(2010)ICU患者消化口咽去污对肠道菌群的影响。重症监护医学36:1394-1402。
- 43.戴伯德，李志强，李志强，等。(2001)从人类粪便中分离出的一株耐腐瘤胃球菌(Ruminococcus gnavus)。应用环境微生物学67:4111-4118。
- 44.陈志伟，陈志伟，陈志伟，等。(2008)乳酸菌与双歧杆菌与人肠上皮细胞的相互作用:黏附特性、肠道病原体的竞争及IL-8产生的调节。中国食品微生物学杂志125:286-292。
- 45.大usa T, Okayasu I, Ogihara T, Morita K, Ogawa M，等。(2003)从溃疡性结肠炎患者结肠粘膜分离的变异梭杆菌诱导实验性溃疡性结肠炎。内脏52:79-83。
- 46.Castellarin M, Warren RL, Freeman JD, Dreolini L, Krzywinski M，等(2011)人结直肠癌中核梭杆菌感染普遍存在。基因组Res。
- 47.柯晓明，陈晓明，陈晓明，等。(2011)梭杆菌与结直肠癌的相关性研究。基因组Res。
- 48.张志强，张志强，张志强，等。(2011)牙周病患者牙周炎发病机制的研究进展。细胞宿主微生物10:497-506。
- 49.李志强，王志强，王志强，王志强(2002)牙龈卟啉单胞菌诱导t细胞凋亡的分子介质。口腔微生物免疫17:224-230。
- 50.Andrian E, Grenier D, Rouabhia M(2006)牙龈卟啉单胞菌-上皮细胞在牙周炎中的相互作用。中国机械工程学报，27(4):529 - 529。
- 51.Saleh M, Trinchieri G(2011)结肠炎和结肠炎相关结直肠癌的先天免疫机制。免疫生物学11:9 - 20。
- 52.Davis CD, Milner JA(2009)胃肠道菌群、食物成分与结肠癌预防。生物化学杂志20:743-752。
- 53.Martinez I, Wallace G, Zhang C, Legge R, Benson AK等(2009)高胆固醇血症仓鼠模型中饮食诱导的代谢改善与肠道菌群的改变密切相关。应用环境微生物学75:4175-4184。
- 54.Turnbaugh PJ, Ridaura VK, Faith JJ, Rey FE, Knight R，等(2009)饮食对人类肠道微生物群的影响:人源化gnotobiae小鼠的宏基因组分析。科学翻译医学1:6 ra14。
- 55.张华，DiBaise JK, Zuccolo A, Kudrna D, Braidotti M，等(2009)肥胖和胃分流术后肠道菌群的变化。中国自然科学学报(自然科学版)106:2365-2370。
- 56.Fleissner CK, Huebel N, Abd El-Bary MM, Loh G, Klaus S，等。(2010)肠道菌群缺乏对小鼠饮食诱导肥胖的保护作用。中国生物化学学报(自然科学版)104:919-929。
- 57.陈志伟，陈志伟，陈志伟，等。(2011)定植诱导的宿主-肠道微生物代谢相互作用。MBio 2: e00271-00210。
- 58.Goodman AL, Kallstrom G, Faith JJ, Reyes A, Moore A，等(2011)在gnotobiomice中描述和操纵广泛的个人人类肠道微生物培养集合。中国科学:自然科学与工程学报。
- 59.Huycke MM, Gaskins HR(2004)共生细菌、氧化还原应激和结直肠癌:机制和模型。Exp生物医学(Maywood) 229: 586-597。
- 60.杨晓明，王晓明，王晓明，等(2008)硫酸盐还原菌的生态学与生物技术。微生物学6:441-454。
- 61.王晓燕，王晓燕，王晓燕，等。(2009)膳食纤维在肠道菌群发酵过程中形成丁酸盐和其他产物对原发性癌症的预防作用。Mutat Res 682: 39-53。