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研究文章

的绒毛状蛋白质Akkermansia muciniphila调节宿主免疫反应和肠道屏障功能

  • Noora Ottman,

    从属关系荷兰瓦赫宁根大学微生物实验室，芬兰赫尔辛基赫尔辛基大学生物科学系，瑞典斯德哥尔摩卡罗林斯卡学院环境医学研究所

    ⨯
  • 贾斯特斯Reunanen,

    联系癌症和转化医学研究单位，奥卢生物中心和医学院，奥卢，芬兰

    ⨯
  • Marjolein Meijerink,

    从属关系宿主-微生物相互作用组学，动物科学，瓦赫宁根大学，瓦赫宁根，荷兰，产品开发风险分析部门，TNO, Zeist，荷兰

    ⨯
  • 泰雅·E. Pietilä，

    联系赫尔辛基大学兽医学院兽医生物科学系，芬兰赫尔辛基

    ⨯
  • 维拉Kainulainen,

    联系赫尔辛基大学医学院药理学，赫尔辛基，芬兰

    ⨯
  • Judith Klievink

    从属关系芬兰赫尔辛基大学免疫生物学细菌学和免疫学系，免疫生物学研究项目单元，赫尔辛基大学赫尔辛基血液学研究单元和赫尔辛基大学综合癌症中心血液学部门，芬兰赫尔辛基

    ⨯
  • 劳拉·Huuskonen

    联系赫尔辛基大学兽医学院兽医生物科学系，芬兰赫尔辛基

    ⨯
  • 史蒂文•Aalvink

    联系荷兰瓦赫宁根大学微生物实验室

    ⨯
  • 米凯尔Skurnik,

    从属关系芬兰赫尔辛基赫尔辛基大学细菌学和免疫学系，免疫生物学研究项目单元，赫尔辛基大学中心医院实验室诊断学，芬兰赫尔辛基

    ⨯
  • Sjef Boeren,

    联系荷兰瓦赫宁根大学生物化学实验室

    ⨯
  • Reetta Satokari,

    联系赫尔辛基大学，芬兰赫尔辛基，细菌学和免疫学系，免疫生物学研究项目单位

    ⨯
  • Annick Mercenier,

    联系宿主-微生物相互作用组学，动物科学，瓦赫宁根大学，瓦赫宁根，荷兰

    ⨯
  • Airi Palva,

    联系赫尔辛基大学兽医学院兽医生物科学系，芬兰赫尔辛基

    ⨯
  • Hauke Smidt,

    联系荷兰瓦赫宁根大学微生物实验室

    ⨯
  • 威廉·m·德沃斯，

    从属关系荷兰瓦赫宁根大学微生物学实验室，芬兰赫尔辛基赫尔辛基大学兽医医学院兽医生物科学系，芬兰赫尔辛基赫尔辛基大学细菌学和免疫学系，免疫生物学研究项目单位

    ⨯
  • […),
  • 克莱拉茨

    clara.belzer@wur.nl

    联系荷兰瓦赫宁根大学微生物实验室

    ⨯
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摘要

肠道屏障功能是维持宿主和其微生物组之间平衡反应的关键。微生物群可以调节肠道屏障的变化以及代谢和炎症反应。这个高度复杂的系统涉及大量微生物源性因子。肠道共生体Akkermansia muciniphila与瘦表型，减少体重增加，改善代谢反应和通过调节黏液层厚度恢复肠道屏障功能正相关。然而，其代谢和免疫调节特性背后的分子机制尚不清楚。在此，我们鉴定了一个高度丰富的外膜绒毛样蛋白一个．muciniphilaMucT直接参与免疫调节和增强跨上皮抗性。纯化的Amuc_1100蛋白和包含其所有相关蛋白的富集蛋白通过激活toll样受体(TLR) 2和TLR4诱导特定细胞因子的产生。这主要导致IL-10的高水平，类似于由其他有益的免疫抑制微生物诱导的IL-10Faecalibacterium prausnitziia2 - 165和乳杆菌WCFS1。综上所述，这些结果表明，外膜蛋白的组成，特别是新发现的高度丰富的绒毛样蛋白Amuc_1100一个．muciniphila参与宿主肠道黏膜的免疫稳态，改善肠道屏障功能。

引用:Ottman N, Reunanen J, Meijerink M, Pietilä TE, Kainulainen V, Klievink J，等。(2017Akkermansia muciniphila调节宿主免疫反应和肠道屏障功能。PLoS ONE 12(3): e0173004。https://doi.org/10.1371/journal.pone.0173004

编辑器:Yolanda Sanz，西班牙食品农业技术研究所

收到:2016年10月12日;接受:2017年2月12日;发表:2017年3月1日

版权:©2017 Ottman et al。这是一篇开放获取的文章，根据创作共用署名许可协议它允许在任何媒介上不受限制地使用、传播和复制，前提是要注明原作者和出处。

数据可用性:所有相关数据都在论文及其支持信息文件中。

资助:本研究得到欧洲研究理事会高级研究基金250172 (MicrobesInside)的支持。https://erc.europa.eu/)、WMdV、重力(SIAM)和荷兰科学研究组织(NWO)的Spinoza基金http://www.nwo.nl/en)到WMdV，欧洲共同体第七个框架规划(FP7/2007-2013，https://ec.europa.eu/research/fp7/)，以及芬兰科学院(http://www.aka.fi/en)(138902 & 258439至RS, 252803至JR, 141130至WMdV)。资助者在研究设计、数据收集和分析、发表决定或手稿准备中没有任何作用。

利益冲突:作者宣称不存在竞争利益。

简介

人类胃肠道为复杂多样的微生物群提供了生存环境，这些微生物群与宿主有许多代谢、营养、生理和免疫方面的相互作用[1］．

宿主免疫系统在区分共生菌和致病菌方面起着重要作用。一方面，免疫系统需要保持警惕，以识别潜在的病原体，另一方面，它必须容忍寄生在肠道中的共生细菌。2］．这种稳态是通过在免疫细胞中表达的模式识别受体(PRR)家族实现的。PRRs，如toll样受体(TLRs)和核苷酸结合和寡聚结构域样受体(NLRs)，识别微生物相关的分子模式(MAMPs)。MAMPs是与共生微生物和病原微生物相关的分子。粘膜免疫系统的另一个重要组成部分是分泌性免疫球蛋白，如IgA和IgG，它们由浆细胞分泌，通过将细菌排除在上皮细胞外发挥作用[3.，4］．确定微生物群成员的免疫调节能力对于了解它们参与建立黏膜耐受性和平衡肠道免疫反应至关重要。也有越来越多的证据表明肠道菌群对系统免疫系统的影响，从而导致自身免疫性疾病的发展[5］．

结肠黏液相关微生物群的关键参与者之一是Akkermansia muciniphila，在人类人口中占相当一部分，并占健康成年人粪便菌群的1-4% [6，7］．这种细菌高度适应其生活环境，因为它能够使用粘蛋白作为唯一的碳和氮源。水平的一个．muciniphila已被证明与几种疾病呈负相关[8]，例如炎症性肠病[9，10]、阑尾炎[11]、肥胖[12，13]和糖尿病[14]，但对其免疫作用机制知之甚少。

的影响一个．muciniphila已在(单相关)小鼠和类器官中对宿主进行了研究，其中大多数受细菌影响的基因与免疫和代谢反应有关[13，15，16］．免疫应答相关基因的诱导在大肠癌中最为明显一个．muciniphila其中60多个基因，包括编码分化簇抗原标记的16个基因和编码免疫细胞膜受体的10个基因，在暴露后被上调。对宿主代谢的影响符合一个．muciniphila可以抑制肥胖和糖尿病的发展。丰富的一个．muciniphila在肥胖和2型糖尿病小鼠中降低，用细菌治疗扭转了高脂肪饮食诱导的代谢障碍，如脂肪组织炎症[17］．这在后来的研究中得到了证实一个．muciniphila高脂饮食喂养的小鼠表现出改善的葡萄糖耐量和杯状细胞和脂肪组织驻留CD4+ Foxp3+调节性T细胞数量的增加[18］．相反，这些研究暗示了保护作用一个．muciniphila在肠屏障功能和免疫刺激方面，一些小鼠研究报告了右旋糖酐硫酸钠(DSS)诱导的结肠炎中这些粘膜细菌的数量增加[19- - - - - -21］．这可以用一种简单的生长来解释一个．muciniphila以应对dss诱导的结肠炎期间黏液层的增厚。类似的解释可以使观察结果合理化一个．muciniphila最小社区的行政管理出现恶化沙门氏菌血清鼠伤寒诱导的鼠肠炎症模型[22］．

本研究的目的是描述免疫调节特性一个．muciniphila通过测量人源性外周血单个核细胞(pmcs)中细胞因子的产生和表达TLR2/4/5/9或nod2受体的报告细胞系炎症通路的激活。免疫反应一个．muciniphila与其他两种共生体进行比较，Faecalibacterium prausnitziia2 - 165和乳杆菌WCFS1。使用蛋白质组学方法从细菌组分中鉴定候选信号分子，并从过量生产中纯化这些蛋白质的集合大肠杆菌克隆。在Caco-2模型系统中检测这些蛋白诱导tlr2信号、细胞因子产生和影响跨上皮耐药(TEER)的能力。利用特异性抗体进行免疫荧光标记，研究特异性蛋白的定位。

材料与方法

细菌生长条件

Akkermansia muciniphilaMucT (ATTC BAA-835)如前所述在基础培养基中生长[7］．培养基中添加猪胃黏蛋白(0.5%，III型;Sigma-Aldrich，圣路易斯，MO，美国)，一种糖的混合物(d -葡萄糖，L-焦点，n -乙酰葡萄糖胺，n -乙酰半乳糖胺;每个2.5 mM, Sigma-Aldrich)或葡萄糖(10 mM, Sigma-Aldrich)。不含粘蛋白的培养基中添加色氨酸(8 g/l, Oxoid Ltd, Basingstoke, Hampshire, England)和l -苏氨酸(2 mM, Sigma-Aldrich)。在182 kPa (1.5 atm) N的厌氧条件下，用丁基橡胶塞子密封的血清瓶中进行培养2/公司2(80/20比率)。用分光光度计测定生长，光密度为600 nm (OD600)。

Faecalibacterium prausnitziiA2-165在添加33 mM葡萄糖的YCFA培养基中37℃厌氧生长[23］．乳杆菌WCFS1是有氧生长的双歧杆菌谕令DSM-20213在37°C的Difco™乳酸杆菌MRS肉汤中进行厌氧(Becton Dickinson, Sparks, USA)。

外周血单个核细胞测定

三名健康献血者的外周血来自荷兰奈梅亨的Sanquin血库。根据制造商的方案(Amersham biosciences, Uppsala, Sweden)，使用Ficoll-Paque Plus梯度离心从健康献血者的血液中分离外周血单个核细胞(pbmc)。离心后收集单个核细胞，在Iscove’s Modified Dulbecco’s Medium (IMDM) +谷氨酰胺(Invitrogen, Breda, Netherlands)中洗涤，并调整至0.5 × 106细胞/ml用IMDM +谷氨酰胺补充青霉素(100 U/ml) (Invitrogen)、链霉素(100 μg/ml) (Invitrogen)和10%热灭活胎牛血清(FBS, Lonza, Basel, Switzerland)。pmcs (0.5 × 106细胞/孔)接种于48孔组织培养板。

每个供体一个阴性对照(中等)和一个阳性对照(LPS来自E．杆菌1 μg/ml)。用活细菌或细菌组分刺激pbmc。对于热杀死的细胞，细菌培养在99°C保持10分钟。PBMC与细菌的比例为1:10。细胞孵育24小时，收集培养上清液进行细胞因子分析。根据制造商在FACS CantoII (Becton Dickinson)上的协议，使用多重分析(Human inflammation CBA kit, Becton Dickinson)测量IL-6、IL-8、IL-10、TNF-α、IL-1β和IL-12p70的细胞因子水平，并使用BD FCAP软件(Becton Dickinson)进行分析。按厂家规定的检出限为:IL-8 3.6 pg/ml, IL-1β 7.2 pg/ml, IL-6 2.5 pg/ml, IL-10 3.3 pg/ml, TNF-α 3.7 pg/ml, IL-12p70 1.9 pg/ml。

在体外人HEK-Blue hTLR2/4/5/9/NOD2细胞系的培养和刺激

炎症通路分析使用HEK-Blue hTLR2、hTLR4、hTLR5、hTLR9和hNOD2细胞系(Invivogen, CA, USA)。这些细胞系直接从Invivogen获得，并在那里进行了验证。定期检测细胞系是否受到污染支原体使用基于pcr的方法。相应配体刺激受体激活NF-κB和AP-1，诱导分泌性胚胎碱性磷酸酶(SEAP)的产生，用分光光度计(Spectramax)测定其水平。所有细胞系以Dulbecco’s Modified Eagle medium (DMEM)为维持培养基，添加4.5 g/l d -葡萄糖、50 U/ml青霉素、50 μg/ml链霉素、100 μg/ml Normocin、2 mM l -谷氨酰胺和10% (v/v)热灭活胎牛血清，培养并传代至70-80%合流度。对每个细胞系接种HEK-blue细胞(体积180 μl，细胞数量见表B)，进行免疫反应实验S1文件)，加20 μl菌悬液刺激96孔平板。悬浮液的浓度表示为图1．96孔板在5% CO2培养箱中37°C孵育20-24小时。受体配体Pam3CSK4 (hTLR2为10 ng/ml)、LPS-EB (hTLR4为50 ng/ml)、RecFLA-ST (hTLR5为0.1 ng/ml)、ODN 2006 (hTLR9为50 μM)和L18-MDP (hNOD2为0.1 ng/ml)为阳性对照，阴性对照为不含任何选择性抗生素的维持培养基。在20 μL诱导的HEK-Blue hTLR2/4/5/9/NOD2上清中加入180 μL QUANTI-Blue (Invivogen)后15 min、1 h、2 h、3 h测定OD600，检测SEAP分泌情况。这里显示的数据来自1小时的测量点。实验一式三次。

缩略图
下载:
图1所示。 一个．muciniphila通过TLR2和TLR4激活信号通路。

(A) TLR4信令活一个．muciniphila(~ 107细菌/),一个．muciniphila上清液(蛋白~5 μg /孔)和LPS一个．muciniphila(浓度对应于~10的LPS量7一个．muciniphila细胞,~ 105-10年6欧盟/毫升)。DMEM:中对照，LPS- eb:阳性对照(浓度为~10的LPS量7E．杆菌细胞)。(B) TLR2信令活一个．muciniphila(~ 107细菌/),一个．muciniphila上清液(蛋白~5 μg /孔)和LPS。DMEM;介质控制，PAM3CSK4;积极的控制。(C) TLR2信令活一个．muciniphila，l．杆菌的，F．prausnitzii而且B．谕令(~ 106细菌/)。(D) Transwell系统中的TLR2信号与对照(即未被膜从细胞系分离的样品，~4 × 10)相比7细菌/)。(E)滤过的上清液信号分子的TLR2信号。(F) TLR2信令一个．muciniphila细菌组分(1 μg蛋白质/孔)。(G) TLR2信令一个．muciniphila纯化蛋白Amuc_1100(0.01、0.1、1 μg蛋白/孔)。(H) TLR2信令由一个．muciniphila纯化蛋白Amuc_0451, Amuc_0625和Amuc_2136(0.1和1 μg蛋白/孔)。DMEM;中对照，*，与DMEM比较P<0.05。所有实验均进行三次重复，如果方差齐性满足则采用单因素方差分析(ANOVA)，如果方差不均等则采用Tukey 's HSD，如果方差不均等则采用Games-Howell。

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0173004.g001

Transwell化验

为了研究分泌分子的TLR2信号活性，使用Transwell (Corning, USA)细胞培养膜插入物(0.4 μm孔径)将细菌从细胞系中分离出来。菌悬液(100 μl， ~4 × 107细菌/孔)直接加入到含有HEK-TLR2细胞的孔中，或先加入Transwell插入室，然后将其插入含有HEK-TLR2细胞的孔中(体积900 μl)。如上所述，培养板并测量SEAP分泌。

细菌滤液

为了研究信号分子的大小，使用不同孔径和分子质量截断尺寸的过滤器对细菌上清液进行过滤。使用以下过滤器:0.45 μm和0.2 μm聚醚砜注射器过滤器(Advanced Microdevices, Ambala Cantt。，India), 1000 kDa Vivaspin 20 Polyethersulfone ultrafiltration unit (Sartorius, Goettingen, Germany), 3K and 300K Pall Nanosep® centrifugal device with Omega membrane (Pall corporation, Ann Arbor, Michigan), 10K Amicon® Ultra regenerated cellulose centrifugal filter (Merck Millipore Ltd., Cork, Ireland), Vivaspin 500 with 30,000 MWCO (Polyethersulfone) Membrane Concentrator (Vivascience, Sartorius Group, Hannover, Germany). 500 μl of supernatant was passed through the filter and the filtrate was used in the assays.

细菌分馏法

膜一个．muciniphila从以葡萄糖为碳源的培养物中分离出来，采用蔗糖密度梯度离心，如前所述[24］．样品储存在- 20°C的2ml低结合管(Eppendorf, Hamburg, Germany)中。使用Qubit®Protein Assay Kit (Life technologies, Oregon, USA)根据制造商的说明来测定细胞提取物的蛋白质含量。样品使用mini-PROTEAN 3细胞(Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA)加载在10%丙烯酰胺分离凝胶(25201,Precise™蛋白凝胶，Thermo Scientific, Rockford, IL, USA)上。电泳程序是根据制造商的说明。按照mini-PROTEAN 3系统的方案，使用CBB R-250对凝胶进行染色。

蛋白质的凝胶消化和多肽的纯化是按照先前描述的方案的修改版本进行的[25］．用还原溶液(10 mM二硫苏糖醇，pH 7.6，在50 mM NH中)覆盖整个凝胶，可以还原蛋白质中的二硫桥4HCO3.)，凝胶在60°C下孵卵1小时。加入25 mL碘乙酰胺溶液(10 mM碘乙酰胺在100 mM Tris-HCl中，pH 8.0)进行烷基化1小时。凝胶用dd H彻底冲洗2啊，台阶间的水。将SDS-PAGE凝胶每道切成一片，切片约为1mm3.并转移到分离的0.5 ml蛋白LoBind管(Eppendorf)中。在50 mM NH中加入5 ng/μl胰蛋白酶溶液，进行酶解4HCO3.)，并在室温下轻轻摇动孵育一夜。在超声水浴中手动超声提取多肽1 s，然后将上清液转移到清洁的蛋白LoBind管中。在上清液中加入10%的三氟乙酸，使pH值在2 ~ 4之间。上清液LC-MS/MS分析。如前所述，使用Proxeon EASY nLC和LTQ-Orbitrap XL质谱计对样品进行nLC - MS/MS测量[26］．

LC-MS数据分析如前所述[25]，在肽和蛋白质水平上的错误发现率(FDRs)设置为0.01，并进行额外的结果过滤(至少需要2个肽来识别蛋白质，其中至少一个是唯一的，至少一个是未修饰的)。为了分析各组分中蛋白质的丰度，比较了它们的无标签定量(LFQ)强度[27］．由于没有足够的定量肽而不存在的LFQ强度值被替换为一个低于最少丰度的检测肽的LFQ强度值。

质粒构建和蛋白质生产

Amuc_0451、Amuc_0625、Amuc_1100和Amuc_2136基因采用无信号序列PCR扩增，引物见表AS1文件．基因PCR产物克隆到pET-24d或pET-26b载体(Novagen®，Merck Millipore, MA, USA)。对于Amuc_0451、Amuc_0625和Amuc_1100基因，pET-26b与限制性位点NdeI和XhoI一起使用。Amuc_2136基因采用pET-24d技术，在载体的NcoI和XhoI位点克隆包含PciI和XhoI限制位点的PCR产物。

E．杆菌将构建的质粒分别用电穿孔或热休克的方法转化XL1Blue或TOP10细胞。将转化后的细胞接种在含50 μg/ml卡那霉素的LB琼脂板上，筛选出耐卡那霉素的细胞。从这些菌落中分离的质粒通过PCR检查是否具有正确的插入长度，随后，对分离的质粒进行测序以确认正确的插入。

E．杆菌用正确的质粒转化BL21(DE3)细胞进行蛋白表达。将含有卡那霉素(50 μg/ml)的LB肉汤接种过夜培养，在37℃下220转/分钟震动生长至指数期，加入1 mM的IPTG诱导蛋白生成。诱导3小时后，在5000 g下离心10 min将细胞制成颗粒，-20℃保存至裂解。

使用溶菌酶和超声波(Sonifier 450, Branson Ultrasonics Corporation, Danbury, CT)重新悬浮和溶解细胞颗粒。离心后收集上清，在天然条件下使用Ni-NTA His•Bind树脂(Novagen®，Merck Millipore, MA, USA)通过金属亲和纯化His-tag蛋白。洗脱缓冲液交换为50 mM Tris-HCl, 50 mM NaCl, pH为7.4的缓冲液，使用5 ml树脂床Zeba旋转柱(Pierce, Rockford, IL, USA)。交换缓冲液后，用BCA法(Pierce)测定蛋白质含量，并将蛋白质储存在-20°C。

免疫荧光显微镜

对纯化的重组Amuc_1100蛋白进行兔抗体培养，用免疫显微技术分析其在重组Amuc_1100蛋白中的位置一个．muciniphila．产生的抗体总数一个．muciniphila全细胞作为对照。免疫接种在Eurogentec(比利时Seraing)和赫尔辛基大学实验动物中心(芬兰)进行，如前所述[28］．

免疫荧光染色证实了Amuc_1100在细胞表面的存在一个．muciniphila如前所述[29］．简单地说,一个．muciniphila细胞以葡萄糖为碳源培养24 h，用磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤，3.5% (w/v)多聚甲醛固定在PBS中，用葡萄糖标记一个．muciniphila用全细胞抗血清或抗amuc_1100前免疫血清作为一抗血清，用Alexa-488 (Invitrogen)偶联抗兔IgG (1 μg/ml)作为二抗。然后用带有Alexa-488标签过滤器的epifluorescence显微镜(徕卡DM 4000B)检查细菌(激发，450至490 nm;使用CellP生命科学显微镜成像软件(Soft imaging System GmbH)对图像进行数字记录。

LPS的提取

一个．muciniphila如前所述，使用热苯酚-水萃取法提取LPS [30.]，只做了一些小修改。简单地说，从过夜培养的5ml中离心收集细菌细胞，用水清洗一次，重悬到500 μl超纯水中。细菌悬浮液在65°C下加热，然后与等量的饱和水苯酚混合，预热至65°C。将混合物在65°C下孵育10分钟，然后转移到冰块中冷却。在4°C离心5分钟后，将水层小心地转移到新的Eppendorf管中，用等体积的热苯酚重复孵卵两次。在此之后，将两体积的丙酮添加到水层中以沉淀LPS。悬浮液-20℃孵育2小时，4℃离心10分钟，用50 μl不含lps的水溶解颗粒。通过银染色检查LPS的质量(图B)S1文件)，根据制造商的协议，使用EndoLISA®内毒素检测试剂盒(Hyglos GmbH, Bernried am Starnberger See, Germany)检查LPS的数量。

经上皮电阻(TEER)测定

Caco-2细胞(5 x 104细胞/insert)接种于孔径为3 μm的Millicell细胞培养插入物中;默克Millipore)，培养8天。Caco-2细胞的生长条件如前所述[31］．细菌细胞用RPMI 1640清洗一次，并在RPMI 1640中以OD600为0.25涂抹在插入物上。纯化一个．muciniphilaAmuc_0451、Amuc_0625、Amuc_1100和Amuc_2136蛋白分别以0.05、0.5和5 μg/ml的浓度施于插片。在加入细菌细胞或蛋白质后0 h、24 h和48 h，用Millicell ERS-2 TEER仪(默克Millipore公司)测定细胞培养的跨上皮耐药。

统计分析

数据以均数±标准差表示。对HEK-Blue细胞株和细胞因子分析的结果进行统计学分析，采用单因素方差分析(ANOVA)，如果方差齐性满足则采用Tukey 's HSD，如果方差不相等则采用Games-Howell。采用IBM SPSS统计软件(IBM SPSS Statistics 22)进行分析;P值< 0.05为显著。

结果

一个．muciniphila与其他共生生物相比，刺激物种特异性细胞因子模式

刺激外周血单个核细胞(pbmc)一个．muciniphilaMucT诱导抗炎和促炎细胞因子(IL-1β， IL-6, IL-8, IL-10和TNF-α)。这种诱导在活细胞以及热杀伤细胞和上清液(表1)．在所测细胞因子中，IL-10、IL-8、IL-6和TNF-α的诱导量最高。

缩略图
下载:
表1。细菌和细菌组分对人pbmc细胞因子产生的影响。

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0173004.t001

一个．muciniphila将PBMCs中的免疫刺激与其他两种已知的有益肠道微生物进行了比较，F．prausnitziia2 - 165和l．杆菌的WCFS1。对pbmc的刺激导致了所有被测微生物的微生物特异性模式。相比之下F．prausnitzii，一个．muciniphila诱导IL-6和IL-8水平升高，而IL-10水平相似，TNF-α水平较低(表1，图2 a-2d)．相比l．杆菌的，一个．muciniphila诱导IL-6、IL-8和IL-10水平升高，TNF-α水平降低(表1，图2 a-2d)．这些细菌的上清液也刺激了pbmc，导致IL-10和TNF-α的细胞因子反应显著不同，而IL-8和IL-6与活菌相比表现出更相似的模式(图2 e-2h)．值得注意的是,一个．muciniphila上清液诱导IL-10显著高于对照组F．prausnitzii上清液中IL-10和TNF-α含量高于对照组l．杆菌的上层清液(图2E和2F)．当分析TNF-α/IL-10比值作为炎症的衡量指标时，发现一个．muciniphila有较低的炎症潜力F．prausnitzii和L．杆菌的(图AS1文件)．

缩略图
下载:
图2所示。的影响一个．muciniphila，F．prausnitzii而且l．杆菌的对细胞因子产生的影响

IL-10 (A)， TNF-α (B)， IL-8 (C)和IL-6 (D)对人pmcs (n = 3个供体)的刺激反应一个．muciniphila，F．prausnitzii而且l．杆菌的活细胞。IL-10 (E)， TNF-α (F)， IL-8 (G)和IL-6 (H)对人pbmc (n = 3个供体)的刺激反应一个．muciniphila，F．prausnitzii而且l．杆菌的上层清液。*, P < 0.05。统计学分析采用单因素方差分析(ANOVA)，如果方差齐性满足则采用Tukey 's HSD，如果方差不相等则采用Games-Howell。

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0173004.g002

一个．muciniphila通过TLR4和TLR2受体激活NF-κB信号通路

确定哪些肠受体参与免疫刺激一个．muciniphila，采用表达TLR2、TLR4、TLR5、TLR9或NOD2受体的报告细胞株。TLR4的激活最强(图1)和TLR2 (图1 b)．一个．muciniphila没有激活TLR5和TLR9，只有少量激活NOD2 [32］．

TLR2反应在一个．muciniphila相比l．杆菌的（图1 c)，但两组间TLR2反应无显著性差异F．prausnitzii而且一个．muciniphila（图1 c)．然而，TLR2对一个．muciniphila是否低于革兰氏阳性的诱导双歧杆菌谕令dsm - 20213 (图1 c)．

TLR4是识别革兰氏阴性敏感脂多糖(LPS)的重要受体。我们首先验证了LPS的存在一个．muciniphila通过使用从细菌细胞中提取LPS的方案，并应用银染色在凝胶上观察它(图B)S1文件)．在这些报告细胞系实验中，活细菌和一个．muciniphilaLPS通过TLR4显著刺激NF-κB依赖的分泌性胚胎碱性磷酸酶(SEAP)的产生(图1)．在此之上，一个．muciniphilaLPS诱导pbmc产生IL-8、IL-6和少量IL-10、TNF-α。正如所料,一个．muciniphilaLPS未诱导TLR2反应(图1 b)．

30kda外膜绒毛样蛋白(Amuc_1100)是一种强TLR2激活剂，可诱导pmcs中的细胞因子

一个．muciniphilaTranswell实验中，当细菌被膜从细胞系中分离时，上清液激活TLR2，因为NF-κB活性持续存在(图1 d)．这表明一个．muciniphila可以通过细胞源性片段和细胞外分子激活TLR2。发酵产物主要在上清液中一个．muciniphila是醋酸和丙酸，但在1 mM的浓度下，这些脂肪酸对NF-κB活性没有影响(图C在S1文件)．使用不同孔径的离心膜过滤器，我们可以证明，对于TLR2和细胞因子诱导，来自上清液的信号分子的大小必须大于100 kDa (图1 e)．pmcs产生IL-8、IL-1β、IL-6、IL-10和TNF-α的量随着过滤上清液分子大小的增加而增加(表1)．

接下来，我们用蔗糖密度梯度离心法从细胞内蛋白质中分离细菌膜。LC-MS/ ms -分析沿着梯度进行了四个不同的分数，以识别蛋白质并确定其相对数量。用蔗糖密度梯度离心分离的两个样品(分数1和分数2)在细胞包膜蛋白的相对数量上存在显著差异。在这些组分中共检测到117种细胞包膜蛋白，其中84种仅在组分1中发现(图3)．与分数2相比，分数1中涉及蛋白质运输和分泌的蛋白质含量特别丰富。根据蛋白质功能，分数2的蛋白质含量更不均匀，但整体蛋白质多样性较低。在分数2中含量最多的蛋白质是黏蛋白降解酶(糖基水解酶、β -半乳糖苷酶、n-乙酰己糖苷酶)和其他酶(丙氨酸-乙醛转氨酶、透明质酸onglucosaminidase)。这些部分也在TLR2细胞系和相同蛋白质浓度的pbmc上进行了测试。分数1诱导的TLR2活性高于分数2 (图1 f)．与分数2相比，分数1也诱导pmcs产生更高的细胞因子(表1)．

缩略图
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图3所示。由Amuc_1098到Amuc_1102基因簇编码的蛋白质在富含膜蛋白和细胞包膜蛋白的部分中被大量发现。

(A)数量一个．muciniphila用LC-MS/MS从蔗糖密度梯度分离方法检测膜蛋白和细胞包膜蛋白。(B) Amuc_1098到Amuc_1102基因簇。(C)分数1和分数2中蛋白质的丰度。蛋白质的相对丰度以log10刻度表示。log10相对丰度为3.5表示未检测到或低于检测限的蛋白质。

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0173004.g003

基于LC-MS /MS的蛋白质组学分析，我们发现由Amuc_1098到Amuc_1102位点对应的基因簇编码的所有蛋白质的相对丰度(图3 b)，分数1比分数2高出至少10倍(图3 c)．在此之前，我们已经证明了来自该基因簇的蛋白质在整个蛋白质组中也是高度丰富的一个．muciniphila，其中Amuc_1098外膜蛋白含量最高[24］．Amuc_1098被预测编码II型和III型分泌系统蛋白，Amuc_1101被预测编码细胞分裂蛋白FtsA。其他三个基因(Amuc_1099, Amuc_1100, Amuc_1101)被注释为假设蛋白质。除Amuc_1101外，所有基因在N端都有一个信号序列，表明它们注定通向分泌通路，并可能参与Derrien等人，2004年所描述的毛球状结构的形成[7］．最近，经纯化的重组Amuc_1100蛋白被证明可以改善糖耐量，与相同饮食的未处理小鼠相比，饲喂高脂肪饮食的小鼠可诱导较低的体重和脂肪量增加[32］．我们利用免疫荧光标记对细菌中的蛋白质进行定位，成功鉴定出Amuc_1100 (32 kDa)为外膜蛋白(图4 b)．然而，在标记的强度上观察到一些变化一个．muciniphila具有抗amuc_1100抗体的细胞(图4 b)．同样，标记强度也有所不同，但不太广泛，全细胞抗体(图4)．

缩略图
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图4所示。Amuc_1100位于的外膜上一个．muciniphila．

免疫荧光染色一个．muciniphila全细胞抗血清(A)或抗amuc_1100 (B)和alexa -488偶联的次级IgG。相同显微场的相位对比图像如下所示。图片是从原始图像中裁剪出来的。

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0173004.g004

纯化的重组Amuc_1100蛋白特异性诱导TLR2 (图1克)，并能诱导pmcs产生IL-1β、IL-6、IL-8、IL-10和TNF-α (表1)．由于基因Amuc_1101和Amuc_1102不会导致可溶性蛋白的过量生成，我们无法测试这些蛋白对免疫应答的影响。作为Amuc_1100的对照，分泌的酶参与一个．muciniphila进行粘蛋白降解试验。研究发现，Amuc_0451(磺化酶)、Amuc_0625(外源性α -唾液酸酶)和Amuc_2136(糖苷水解酶)是由其大量产生的酶一个．muciniphila并且检测到剂量依赖的tlr2信号(图1 h)．然而，与Amuc_1100相比，这些质周酶的tlr2信号响应往往较低。

此外，我们还测试了一个．muciniphila通过测定Caco-2单分子层的TER，研究纯化的重组蛋白对上皮细胞层完整性发育的影响。一个．muciniphila与Caco-2细胞共培养24小时后，TEER显著增加[33) (图5)．在我们的实验中，Amuc_1100在24小时也显示出显著增加的TEER (图5)，而其他纯化蛋白(Amuc_2136, Amuc_0625和Amuc_0451)并没有显著提高TEER(图DS1文件)．E．杆菌已知对上皮细胞单层完整性有不良影响，并降低TEER (图5) [34］．

缩略图
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图5所示。 一个．muciniphila外膜蛋白Amuc_1100促进了上皮电阻的发展。

的影响一个．muciniphila，纯化蛋白Amuc_1100 (0.05 μg/ml)或E．杆菌对Caco-2单层刺激24 h后TEER发育的影响。显示了三个平行井的平均值和标准差。与对照组(无细菌培养基)相比，24 h时TEER值有显著差异(p < 0.05)，用星号表示。统计学分析采用单因素方差分析(ANOVA)。

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0173004.g005

讨论

一个．muciniphilaMucT能够诱导广泛的免疫调节反应在体外．免疫调节能力可以追溯到分子大小超过100 kDa的大分子复合物。随后，我们发现富集在细胞包膜蛋白中的细菌部分，可能包括暴露在细菌表面的大结构，在pbmc中诱导高TLR2信号通路和细胞因子的产生。我们发现该片段高度富集在Amuc_1098-Amuc_1102基因簇编码的一组蛋白质中，可以构成电子显微镜图像中观察到的桩状结构[7］．Amuc_1100是该基因簇的一部分，其30kda产物可能在该基因簇中过量生产E．杆菌并发现在pbmc中诱导产生IL-6, IL-8和IL-10。此外，利用免疫荧光显微镜，我们可以定位Amuc_1100蛋白的外部一个．muciniphila细胞，与其在桩状结构中的位置相容。在免疫标记中观察到一些异质性，可能反映了每个细胞有不同数量的毛毛。作为一个．muciniphila位于黏液层，离上皮细胞不远，当与宿主相互作用时，它可能受益于这些类型的附属物。

此外，一些分泌的粘液蛋白降解酶也能激活pmcs和TLR2。此前有报道称一个．muciniphila细胞外囊泡(EV)刺激IL-6分泌，但在处理结肠上皮细胞系之前，先用这些EV处理它们E．杆菌EV降低了IL-6的产生E．杆菌EV单独[20.］．目前尚不清楚哪些蛋白质存在于一个．muciniphila引发反应的EV，以及是否来自培养基的粘蛋白片段可能混淆了结果。我们的研究中一个．muciniphila在非黏液培养基上进行所有免疫试验，以防止猪胃黏液化合物干扰免疫反应。

诱导IL-8、IL-6、IL-1β、IL-10和TNF-α一个．muciniphila这表明它不能严格地定义为抗炎或促炎，而是可能在维持肠道生态系统平衡方面具有更复杂的作用。有趣的是，活菌诱导产生的IL-1β明显高于热杀菌，这表明细胞衍生片段以及分泌的化合物在免疫信号传导中具有重要作用。免疫调节外膜结构也可能在热处理过程中被破坏。刺激pmcs一个．muciniphila导致促炎IL-8的产生然而，最近的一项研究表明一个．muciniphila诱导肠细胞中IL-8的产生，其细胞浓度比对照组高100倍E．杆菌，表明肠道的炎症可能性相当低[33］．

观察到的免疫调节作用一个．muciniphila与微生物群成员不同吗F．prausnitziia2 - 165和l．杆菌的WCFS1。不同宿主对一个．muciniphila而且F．prausnitzii在一项用小鼠衍生类器官进行的研究中也很明显[16］．其中,一个．muciniphila与之相比，主要触发代谢标志物的调节F．prausnitzii．在本研究中使用的模型系统中一个．muciniphila而且F．prausnitzii活细胞诱导的IL-10数量非常相似。有趣的是,一个．muciniphila上清液诱导大量IL-10，而F．prausnitzii上清液几乎不刺激IL-10的产生。此外，TNF-α/IL-10细胞因子诱导比，常用于衡量新出现的益生菌的炎症潜能[35，36)的分数较低一个．muciniphila相比之下F．prausnitzii而且l．杆菌的．这些观察结果表明，两种生物都具有更强的抗炎能力一个．muciniphila以及与其分泌的产物和代谢物相比较F．prausnitzii而且l．杆菌的．

Amuc_1100被证明位于一个．muciniphila，该蛋白也可能被释放到上清液中，从而促进IL-10的刺激。这两种细菌分泌的化合物之间的另一个可能的重要区别是粘液蛋白降解酶的产生，这种酶在人体中大量存在一个．muciniphila，但不在F．prausnitzii．

人pbmc的细胞因子反应始终较低l．杆菌的相比一个．muciniphila，除诱导TNF-α外。这与小鼠对定殖的转录反应的比较是一致的一个．muciniphila或l．杆菌的，结果显示一个．muciniphila诱导参与免疫应答信号和ERK/MAPK信号的基因相对较高的上调[15］．尽管有更强的免疫反应一个．muciniphila-定殖小鼠没有出现显微镜可见的炎症或表现出任何不适的迹象。不同的免疫刺激引起的一个．muciniphila因此，可能是肠道免疫耐受这种共生。两者之间的区别一个．muciniphila而且l．杆菌的在肥胖和2型糖尿病小鼠中也得到了证实一个．muciniphila改善了代谢结果，而用l．杆菌的根本没有这种有益的效果[17］．

不同的免疫反应一个．muciniphila，F．prausnitzii而且l．杆菌的这可能表明它们的生理或代谢差异，或者这些细菌在肠道中定植于不同的生态位。作为一种黏蛋白降解剂，一个．muciniphila与腔内定植的细菌相比，与宿主的接触更密切。我们的研究进一步加强了上述研究的结果[15- - - - - -17]对这些共生细菌之间宿主反应的差异进行研究。

一个．muciniphilaLPS对TLR4有强烈的反应，很可能是TLR4受体的激活分子一个．muciniphila．最近有报道称，细菌LPS脂质A中磷酸盐的位置可能在将细菌-宿主先天免疫系统相互作用区分为共生关系或致病关系中发挥重要作用[37］．确定的分子结构的一个．muciniphilaLPS对于理解其在肠道中的免疫刺激作用是有价值的。之前，有人提出LPS的一个．muciniphila在实验性酒精性肝病小鼠模型中，炎症是否如一个．muciniphila慢性胃内酒精喂养后Muc2-/-随着血浆脂多糖浓度的降低[38］．

TLR2最广为人知的作用是识别革兰氏阳性细菌的脂磷酸(LTA)，但一些含有非经典LPS的革兰氏阴性细菌也被证明可以通过TLR2发出信号[39，40］．的脂质结构一个．muciniphila膜没有详细的表征，我们对其能力进行了评价一个．muciniphilaLPS刺激TLR2。即使活菌和上清液诱导了强烈的TLR2反应，纯化的LPS也没有。

一个．muciniphila没有激活肠道鞭毛蛋白受体TLR5，这反映了在一个．muciniphila［41］．只有高浓度的一个．muciniphila(107细菌/well)诱导了TLR9受体的轻微反应，该受体识别DNA分子中的未甲基化CpG序列。孤立的一个．muciniphilaDNA没有引起任何TLR9反应。基因组一个．muciniphila与其他59种细菌相比，其GTCGTT六聚体的中位数频率(255 vs. 401)较低[42]，这可能解释了观察到的TLR9低激活。另一种解释可能是TLR9的细胞内位置，这使得配体更难到达它，特别是在一个在体外设置。

的本土化一个．muciniphila在黏液层，靠近上皮层，可能对这种细菌的免疫调节机制产生了很大的影响。作为一个．muciniphila在许多炎症性疾病中是减弱的，可以推测是没有的一个．muciniphila如有炎症，可防止粘膜上皮边界的免疫抑制。相互之间的一个．muciniphila宿主可能会影响肠道内的免疫耐受和稳态，可能是通过保持免疫系统警惕潜在的破坏。一个．muciniphila已被证明可以恢复饮食诱导的肥胖小鼠黏液层厚度并增加肠道内源性大麻素[17]，这表明它同时有助于改善肠道屏障功能。这里我们展示了一个．muciniphila外膜蛋白Amuc_1100促进了caco2细胞TEER的发展，这也表明了上皮屏障功能的增强。重组Amuc_1100蛋白在改善肠道屏障和抑制高脂饮食诱导的肥胖发展方面的疗效最近已在小鼠中得到证实[32］．

总而言之，这些结果可以部分解释的正相关水平一个．muciniphila还有肠道健康。一些研究报告了一个．muciniphila在溃疡性结肠炎患者的粪便微生物群中，两者都处于缓解状态[10，43]和临床活动性疾病[44］．除了粪便菌群，降低水平一个．muciniphila在ibd患者的肠粘膜活检中也发现了与健康对照组相比[9］．

总之，本研究揭示了不同的免疫刺激能力一个．muciniphila并确定了介导这种刺激的候选细菌产物。我们还表明，现有的和下一代益生菌具有广泛的物种特异性免疫刺激特性，在开发新的应用和干预措施时应考虑到这一点。

支持信息

S1文件。支持信息。

图A. TNF- α/IL-10细胞因子诱导比。图B.银染色一个．muciniphila有限合伙人。图C.乙酸和丙酸的TLR2信号。图D. TEER在纯化蛋白中的发育一个．muciniphila．表A.用于质粒构建的pcr引物。表B.人HEK-Blue hTLR2/4/5/9/NOD2细胞系的细胞数量。

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0173004.s001

(PDF)

S1数据集。蛋白质组学分析答:muciniphila蔗糖密度梯度分数。

结果以log10无标签量化(LFQ)强度表示。由于没有足够的定量肽而不存在的LFQ强度值被替换为值3.5。

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0173004.s002

(XLSX)

致谢

我们感谢Jerry M. Wells在这项工作过程中提出的富有启发性的意见。感谢李智霖在脂多糖分析方面的帮助。

作者的贡献

  1. 概念:无JR MM步长MS RS AM AP HS WdV CB。
  2. 正式的分析:没有JR MM TEP MS SB RS WdV CB。
  3. 调查:没有jr mm tep vk jk lh sa ms sb。
  4. 方法:无JR MM步长MS RS AM AP HS WdV CB。
  5. 写作-初稿:无WdV CB。
  6. 写作-审阅编辑:没有JR MM TEP VK JK LH SA MS SB RS AM AP HS WdV CB。

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