协会梭菌属胰腺癌组织中的物种、分子特征和预后

介绍

胰腺癌是一种高度侵袭性恶性肿瘤，诊断后存活6个月的患者< 50%。由于化疗方案只能略微延长生命，胰腺癌患者目前的死亡率与发病率几乎相同[1- - - - - -13］．因此，未来的研究有望阐明胰腺癌的发病机制，并为该病的诊断和治疗方法探索新的可能性。

最近，引起牙周病的细菌感染作为胰腺癌的危险因素，引起相当关注[3.，6，7，10，14］．患有牙周病的人全身炎症标志物水平升高，口腔细菌可扩散到血液中[3.，6，7，15]，胃肠道[16- - - - - -19]，肝脏[20.，21]，或胰腺[22]甚至可以到达大脑[23］．因此，口腔细菌也可能通过胆道的循环或转导传播到达胰腺，并可通过与其他调节炎症和免疫反应的胰腺癌危险因素(如肥胖、吸烟和食道癌)共同作用而促进胰腺癌的发生土著居民的遗传变异[4，6，7］．

梭菌属种(一组非孢子形成，厌氧革兰氏阴性细菌)是人类微生物组的口腔细菌群。该协会的成员梭菌属物种是高度异质性的，其中一些已被认为是机会性病原体，不仅涉及牙周炎[6，7，24]也可用于炎症性肠病[17- - - - - -19]、胰脏脓肿[22，25]及肝脓肿[20.，21，25］．关于的关联梭菌属包括全基因组测序、转录组测序和16S核糖体RNA基因DNA测序在内的宏基因组分析均显示其富集梭菌属结直肠癌组织中的物种[26- - - - - -30.］．此外，增加的水平梭菌属物种与病人的生存有关[29]和结直肠癌的特定分子亚群[28］．

因此，越来越多的证据表明梭菌属物种可能在胃肠道癌症中发挥作用;然而，以前的研究没有报道梭菌属患有胰腺癌的物种。因此，我们检查了是否梭菌属物种存在于胰腺癌组织中，并在疾病进展中发挥作用。为了确定其在胰腺癌中的作用，我们还分析了其与肿瘤的关系梭菌属利用283例患者的数据库，研究物种状态与分子特征的关系，包括表观遗传改变和microRNA表达水平，以及患者预后。

结果

检测梭菌属胰腺癌组织标本中的物种

我们用TaqMan梭杆菌基因表达法评估了302份福尔马林固定、石蜡包封(FFPE)的胰腺癌组织标本，得到283份(94%)阳性结果。梭菌属8.8%(25/283)的胰腺癌组织标本中检出了物种。图1显示DNA数量(2^−ΔCt)梭菌属species-positive病例。

利用肿瘤梭菌属种阳性组，我们还测试了正常胰腺粘膜组织成对标本梭菌属物种。我们的数据表明梭菌属正常组织成对标本中检出物种的比例为28%(7/25)。

肿瘤之间的联系梭菌属胰腺癌的种类、临床、病理和分子特征

表1总结283例胰腺癌按肿瘤分类的临床、病理及分子特征梭菌属物种状态(积极与消极)。肿瘤梭菌属物种状态与女性性别和高microRNA-21 (miR-21)表达水平略有但不显著相关。microRNA-31 (miR-31)和microRNA-143 (miR-143)均与肿瘤无关梭菌属物种的地位。

梭菌属胰腺癌与患者生存的物种现状

在283名胰腺癌患者的随访中，109名患者死亡(所有死亡均被证实可归因于胰腺癌)。癌症特异性生存期的中位随访期为30.3个月。在Kaplan-Meier分析中，观察到的生存期显著缩短梭菌属物种阳性组[中位癌症特异性生存期(月):17.2对32.5;log-rankp= 0.021;图2］．

分子改变与胰腺癌患者生存的关系

喀斯特在283名胰腺癌患者中，69%的患者(表1)．BRAF（V600E)，国家管制当局方面(密码子12、13或61)，以及PIK3CA(外显子9或20)突变均未发现。CpG岛甲基化表型(CIMP)-高状态[三/四个或更多甲基化启动子之间CACNA1G, CDKN2A，IGF2,RUNX312%(34/283)的胰腺癌病例(表1)．283例病例中未检测到微卫星不稳定(MSI -高状态)。

在Kaplan-Meier分析中，高表达水平的miR-21 (log-rankp= 0.0025;图3一)， miR-31 (log-rankp= 0.0003;图3 b)， cmp -high状态(log-rank . log)p= 0.024;图4)与较短的生存期显著相关。相比之下，两者都不是喀斯特突变和miR-143与患者生存相关(数据未显示)。

胰腺癌患者的多因素Cox回归分析

在单变量Cox回归分析中，比较梭菌属种阴性病例中，死亡率明显较高梭菌属物种阳性病例[危险比(HR): 1.91;95%置信区间(CI): 1.04-3.24;p= 0.037;表2］．

多变量模型最初包括性别、诊断年龄、肿瘤大小、肿瘤位置、诊断年份、喀斯特CIMP状态以及miR-21、miR-31和miR-143的表达水平。同样地，与梭菌属种阴性病例与较差的预后独立相关梭菌属在癌症特异性生存的多因素分析中，物种阳性病例(HR: 2.16;95% ci: 1.12-3.91;p= 0.023;表2)．

讨论

在目前对接受手术治疗的胰腺癌患者的研究中，我们测试了是否梭菌属胰腺癌组织中存在物种。检测率梭菌属本研究胰腺癌组织标本中标本种数为8.8%。此外，我们发现梭菌属胰腺癌组织标本的物种状态与较差的预后独立相关。因此，我们的数据表明梭菌属胰腺癌组织中存在不同的物种，可能与恶性潜能有关。虽然我们的数据需要在其他(独立的)数据集中得到证实，但肿瘤梭菌属物种状态可作为胰腺癌预后的生物标志物。

目前，胰腺癌的发病机制尚不清楚。关于细菌感染与胰腺癌的关系，另一项前瞻性队列研究显示，牙周病史与胰腺癌风险增加有关[10］．在口腔细菌中，Porphyromonas gingivalis（p . gingivalis)，是导致牙周病的病原体，与胰腺癌的发生有关[6］．此外，抗体水平较高p . gingivalis与较低的胰腺癌风险相关[7］．根据培养方法，从胰腺分离出的微生物群与口腔微生物群有相似之处，特别是在胰腺炎病例中[6，22］．此外，动物模型和人类实验对象都记录了口腔细菌通过传播向胰腺的传播[7，15，31］．

除了牙周病，属梭菌属种与胃肠道炎症性疾病有关[16- - - - - -19]，患有胰脏脓肿[22，25]、肝脓肿[20.，21]、脑脓肿[23]和利米埃氏综合症[32］．这些数据表明，口服梭菌属种类可以通过循环(即血液或淋巴管)到达胰腺。此外，多项研究表明，口腔微生物群与胃肠道微生物群重叠;这些数据表明口腔细菌在体内有多种传播途径[7，33，34］．胆道的传导(上行或下行)也被认为是[31，35］．需要进一步的研究来确定的途径梭菌属物种扩散到胰腺。

最近的研究表明，梭菌属在胃肠道癌症中检测到的种类，如胃癌[34]和结直肠癌[26，29，30.];然而，已发表的研究并没有检验的关系梭菌属在大样本中具有癌症结果的物种(n> 100)这样的病人。在目前的研究中，我们发现肿瘤梭菌属物种状态与胰腺癌患者较短的生存期独立相关。据我们所知，这是第一份证明与肿瘤存在相关的报告梭菌属与胰腺癌结果相关的物种。虽然没有发现明显的联系，梭菌属胰腺尾癌的种数较高(4/18;22%)高于头部(16/203;7.9%)或体癌(5/62;8.0%)。高流行率梭菌属胰腺尾癌的种类仍然不确定。一种可能的解释是胰尾与头部或身体之间的血管供应不同。而且，在肿瘤中梭菌属species-positive情况下,梭菌属在28%的正常组织配对标本中检测到这些细菌，这表明这些细菌可能在胰腺癌的发病机制中发挥作用。我们的发现应该有助于阐明胰腺癌发生的细节，并可能导致胰腺癌患者的一种新的诊断或治疗方法(即根除)的发展。

由于横断面(观察)设计和未知偏倚(如选择偏倚)可能混淆结果的风险，我们的研究有一些局限性。此外，我们的分析不包括治疗数据;因此，另一个未知的偏倚，例如，差异治疗分配，可能会使结果偏斜。此外，我们排除了没有可用肿瘤组织的病例:另一个可能的偏见。尽管如此，我们的回归分析结果针对潜在的混杂因素进行了调整，包括疾病分期、诊断年份、CIMP状态以及miR-21和miR-31表达水平。

的作用梭菌属胰腺癌发生的物种仍然未知。最近的研究表明，梭菌属在结直肠癌中增加活性氧(ROS)和炎症细胞因子(如IL-6和TNF)的产生[30.］．炎症和ROS可导致错配修复蛋白MLH1的表观遗传沉默[36］．据此，我们在此评估肿瘤的可能关联梭菌属具有表观遗传改变的物种状态，例如一种甲基化和CpG岛甲基化表型(CIMP)在胰腺癌中的作用。

在过去的十年中，术语“CIMP”被反复用于描述包括胰腺癌在内的各种人类恶性肿瘤中的CpG岛启动子甲基化[12，28，37- - - - - -39］．与结直肠癌研究相比，在胰腺研究领域，CIMP是一个陌生的术语。一项研究表明，在36种胰腺癌中有5种(14%)观察到cmp水平高;然而，CIMP状态与预后之间无显著相关性[12］．相比之下，我们目前的数据显示cmp -高状态(根据甲基化启动子在结直肠癌研究中广泛使用)，和一种甲基化在12%和3.9%的胰腺癌中被检测到。虽然既不是CIMP状态也不是一种甲基化与肿瘤相关梭菌属我们的研究结果表明，cmp -高状态与胰腺癌的不良预后相关。CIMP被认为不仅对分子表征有用，而且对多种人类癌症的治疗反应评估也有用[37］．因此，需要进一步的研究来阐明表观遗传改变在胰腺癌中的作用。

MicroRNAs是一类小的非编码RNA分子，具有转录后基因调节功能，已越来越多地被认为是各种人类癌症的生物标志物[2，5，8，9，40- - - - - -42］．某些microRNAs在巨噬细胞炎症反应期间被诱导，并具有调节宿主细胞对病原体反应的能力[43］．此外，病原体本身可能调节microRNA的表达[44］．MicroRNAs通过调控信号通路影响控制先天和适应性免疫及细胞凋亡的网络[43］．以前的研究表明，细胞可以分泌microRNAs，这些microRNAs可以被递送到受体细胞，在那里它们可以改变基因表达[45，46］．因此，免疫系统相关的microRNAs有可能到达胰腺，即使病原体位于其他地方。然而，此前没有研究报道胃肠道癌中微生物区系与microRNA表达之间的关系。

关于胰腺癌中的microRNA表达水平，最近的一项研究表明，miR-21, miR-31 [2，9，11]，以及miR-143的表达[47水平与更高阶段或更差的生存期显著相关。因此，我们分析了肿瘤之间的关系梭菌属miR-21、miR-31或miR-143在胰腺癌中的表达水平。未发现显著相关性。与之前的研究一致[2，9，11]，我们目前的数据也表明，miR-21和miR-31表达水平与胰腺癌患者较短的生存期有关。因此，这些microRNAs可能是胰腺癌患者的诊断生物标志物或治疗靶点。

总之,梭菌属在胰腺癌组织中检测到物种。虽然没有发现明显的联系梭菌属胰腺癌的种类现状及分子改变梭菌属物种地位与胰腺癌预后较差独立相关。因此，我们的数据表明肿瘤梭菌属物种是胰腺癌的一个有前途的生物标志物，可以打开令人兴奋的机会，以提高我们对这种致命疾病的发病机制的理解。

材料与方法

患者和肿瘤组织标本

我们收集了2003年至2013年间在札幌医科大学医院、Teine Keijinkai医院或小樽市立医院接受手术治疗的302例胰腺癌(胰腺导管腺癌(PDACs)患者的FFPE组织标本。为了尽可能避免选择偏差，我们收集了连续的FFPE肿瘤组织标本。澄清之间的关联梭菌属我们将接受辅助化疗的患者限制为吉西他滨或5-FU(包括S-1)治疗的患者。切除前接受化疗或放疗的患者被排除在外。

胰腺癌组织标本的组织学数据由不了解临床和分子信息的病理学家(T.S.和T.H.)进行评估。癌症特异性生存期定义为胰腺癌手术治疗至死亡或最后一次随访的时间。这些患者被跟踪到死亡或2014年7月，以先到者为准。标本采集前，所有患者均知情同意。这项研究得到了三个参加机构的机构审查委员会的核可，并符合《赫尔辛基宣言》的原则。我们对胰腺癌组织标本的分析完全符合REMARK指南[48］．

DNA提取和定量PCR梭菌属物种

使用QIAamp DNA FFPE组织试剂盒(Qiagen, Valencia, CA, USA)从FFPE组织标本中提取基因组DNA。我们使用定制的TaqMan引物/探针组(应用生物系统公司，福斯特城，CA，美国)梭菌属物种(序列可根据要求提供)。的循环阈值(Ct)值梭菌属如前所述，每种反应均归一化为前列腺素转运蛋白(PGT) [27，49］．PCR混合物为:基因组DNA 4 μl (20 ng/μl)、1× TaqMan Environmental Master mix 2.0 (Applied Biosystems) 10 μl、TaqMan environment Master mix 2.0 1.0 μl梭菌属种特异性20× TaqMan引物和探针组，PGT引物和探针组1.0 μl，无微生物dna水(Qiagen) 4 μl。定量PCR的条件如下:95°C持续10分钟，然后进行40个循环，95°C持续15秒，60°C持续60秒。使用SDS v1.4软件(Applied Biosystems)对循环阈值进行比较分析(ΔCt)。

焦磷酸测序的喀斯特，国家管制当局方面，BRAF,PIK3CAMSI分析

利用基因组DNA进行PCR和靶向焦磷酸测序喀斯特(密码子12,13,61或146)，国家管制当局方面(密码子12,13,61)，BRAF（V600E),PIK3CA(外显子9或20)，如前所述[38，50］．MSI分析使用两个标记(BAT25和BAT26)进行，如前所述[50］．

亚硫酸氢钠处理和实时PCR (methyllight)评估启动子甲基化CACNA1G，CDKN2A（p16)，IGF2，一种,RUNX3

使用BisulFlash™DNA修饰试剂盒(Epigentek, Brooklyn, NY, USA)对基因组DNA进行亚硫酸氢盐修饰[39］．DNA甲基化在五个启动子中定量[CACNA1G, CDKN2A（p16)，IGF2，一种,RUNX3]使用Real-Time PCR (methyllight)。cmp高状态定义为存在3 / 4个或更多甲基化启动子[CACNA1G, CDKN2A（p16)，IGF2,RUNX3]， CIMP-low/ 0定义为前面描述的存在0 / 4到2 / 4个甲基化启动子[39］．

miR-21、miRNA-31和miRNA-143的RNA提取和定量逆转录pcr (RT-PCR)

使用miRNeasy FFPE Kit (Qiagen)从FFPE组织中提取总RNA。如前所述，使用TaqMan MicroRNA逆转录试剂盒(应用生物系统公司)和TaqMan MicroRNA测定试剂盒(应用生物系统公司)，通过定量RT-PCR分析MiR-21-5p、miR-31-5p和miR-143-3p的表达水平[50］．U6小核RNA (snRNA;RNU6B;应用生物系统公司)作为内源性对照。如前所述，我们将miR-21和miR-31的高表达水平组定义为四分位数中的第四水平(Q4) [50］．相比之下，miR-143低表达水平组被定义为四分位数中的第一水平(Q1)。

统计分析

JMP(版本10)和SAS(版本9)软件应用程序用于所有计算(SAS研究所，卡里，NC，美国)。为了评估临床、病理和分子特征之间的联系，我们使用了χ²性别测试;胰腺肿瘤位置;肿瘤大小;淋巴结侵犯;诊断年份;喀斯特突变;miR-21、miR-31和miR-143的表达;一种甲基化和CIMP状态或Fisher疾病阶段的精确测试(UICC分类)。为了比较患者的平均年龄，t-test被使用。

采用Kaplan-Meier法和log-rank检验评估两组间的相关性梭菌属胰腺癌种类现状与患者死亡率。在癌症特异性死亡率的分析中，除胰腺癌以外的其他原因导致的死亡被审查。为了调整混杂因素的结果，我们使用多变量Cox比例风险回归模型根据肿瘤计算HR梭菌属胰腺癌的种类现状。我们使用SAS“proc phreg”命令中的“strata”选项将疾病分期(I、II、III、IV或未知)作为分层变量。多变量模型最初包括性别(男性vs女性)、诊断时年龄(连续变量)、肿瘤大小(< 2,2 - 4,4 - 6或≥6cm)、肿瘤在胰腺的位置(头部、身体或尾部)、诊断年份(连续变量)、喀斯特突变状态(密码子12/13/61/146;存在与不存在)、CIMP状态(CIMP-高与CIMP-低/零)以及miR-21、miR-31和miR-143表达水平(高与低表达水平)。为避免过拟合，最终模型中的变量选择采用后向逐步消元法，阈值为p= 0.10。

致谢

我们非常感谢札幌医科大学医院、田因经今会医院和小樽市立医院的病理科为我们提供的组织标本。

利益冲突

没有利益冲突。

写作帮助

作者要感谢Enago (www.enago.jp)浏览英文语文复习。

给予的支持

这项工作得到了日本科学促进协会(JSPS)挑战性探索性研究(资助号25670371给Y.S.)，小野癌症研究基金会(给K.N.)，武田科学基金会(给K.N.)，苏原纪念基金会(给K.N.)，汤浅纪念基金会(给K.N.)，日本胰腺研究基金会(给K.N.)和大和证券健康基金会(给H.I.)的支持。

作者贡献声明

研究理念与设计;K.m, k.n, y.s。

数据采集;K.M Y.M。香港,我方,M.I, S.K, T.N, M.T。Y.K K.H.

数据分析和解释;K.m, k.n, t.s, t.h, y.a，

文稿起草;K.M, K.N.

对重要的知识内容进行批判性的修改;k.m.， k.n.， y.s.， y.m.， r.m.， h.m.。

统计分析;K.m, k.n, y.s。

材料支持;T.n, t.t, h.m, t.s, t.h, m.i, y.k, k.h。

研究监督;K.n, h.m, h.s, h.y, k.h, k.i, y.s。

稿件最终审稿;所有作者

缩写

CI -置信区间;FFPE -福尔马林固定石蜡包埋;CIMP - CpG岛甲基化表型;HR -危险比;IBD——炎症性肠病;miR-31 - microRNA-31;MSI -微卫星不稳定性;PDAC -胰导管腺癌RT-PCR -逆转录- pcr;SD——标准差;UICC -国际反坎库姆联盟

参考文献

1.Vincent A, Hong SM, Hu C, Omura N, Young A, Kim H, Yu J, Knight S, Ayars M, Griffith M, Van Seuningen I, Maitra A, Goggins M. EYA2在胰腺腺癌中的表观遗传沉默促进肿瘤生长。Oncotarget。2014;5:2575 - 2587。

2.马明志，孔霞，翁明志，程凯，龚伟，权志伟，彭春春。胰腺导管腺癌候选microRNA生物标志物:meta分析、实验验证及临床意义。临床癌症杂志，2013;32:71。

3.Farrell JJ，张磊，周华，Chia D, Elashoff D, Akin D, Paster BJ, Joshipura K, Wong DT。口腔微生物群的变化与包括胰腺癌在内的胰腺疾病有关。肠道。2012;61:582 - 588。

4.Risch公顷。胰腺癌:幽门螺杆菌定植、n -亚硝胺暴露和ABO血型。Mol Carcinog. 2012;51:109 - 118。

5.Mace TA, Collins AL, Wojcik SE, Croce CM, Lesinski GB, Bloomston M.缺氧诱导胰腺癌细胞microRNA-21过表达。《外科杂志》2013;184:855 - 860。

6.米肖德DS。细菌感染在胰腺癌中的作用。致癌作用。2013;34:2193 - 2197。

7.Michaud DS, Izard J, Wilhelm-Benartzi CS, You DH, Grote VA, Tjonneland A, Dahm CC, Overvad K, Jenab M, Fedirko V, Boutron-Ruault MC, clvel - chapelon F, Racine A, Kaaks R, Boeing H, Foerster J，等。在一项大型欧洲前瞻性队列研究中，口腔细菌血浆抗体与胰腺癌风险。肠道。2013;62:1764 - 1770。

8.王萍，庄玲，张娟，范娟，罗娟，陈红，王凯，刘玲，陈铮，孟Z。血清miR-21水平可作为晚期胰腺癌化疗敏感性的预测因子，miR-21表达可通过靶向FasL实现化疗耐药。Mol Oncol, 2013;7:334 - 345。

9.Frampton AE, Giovannetti E, Jamieson NB, Krell J, Gall TM, Stebbing J, Jiao LR, Castellano L.胰腺导管腺癌microRNA meta-signature。2014;14:267 - 271。

10.Michaud DS, Joshipura K, Giovannucci E, Fuchs CS。美国男性卫生专业人员牙周病和胰腺癌的前瞻性研究中华泌尿外科杂志2007;99:171 - 175。

11.Papaconstantinou IG, Manta A, Gazouli M, Lyberopoulou A, Lykoudis PM, Polymeneas G, Voros D.胰腺癌患者microrna的表达及其预后意义。胰腺。2013;42:67 - 71。

12.上木，孙T，杨CJ，伊萨JP, Hruban RH, Goggins M.胰腺腺癌多基因高甲基化的研究。癌症决议2000;60:1835 - 1839。

13.Khan S, Ebeling MC, Zaman MS, Sikander M, Yallapu MM, Chauhan N, Yacoubian AM, Behrman SW, Zafar N, Kumar D, Thompson PA, Jaggi M, Chauhan SC. MicroRNA-14靶向MUC13并抑制胰腺癌的生长和侵袭。Oncotarget。2014;5:7599 - 7609。

14.安J，西格斯S，海耶斯RB。牙周病、牙龈卟啉单胞菌血清抗体水平与口腔消化系统癌死亡率。致癌作用。2012;33:1055 - 1058。

15.Hayashi C, Gudino CV, Gibson FC, 3rd CA.综述:远离口腔感染部位的病原体诱导炎症:细菌持久性和细胞特异性先天免疫炎症通路的诱导。Mol口腔微生物学。2010;25:305 - 316。

16.Swidsinski A, Dorffel Y, Loening-Baucke V, Theissig F, Ruckert JC, Ismail M, Rau WA, Gaschler D, Weizenegger M, Kuhn S, Schilling J, Dorffel WV。急性阑尾炎的特点是有核梭杆菌/坏死杆菌的局部侵袭。肠道。2011;60:34-40。

17.大usa T，冈杉I, Ogihara T，森田K，小川M，佐藤N.溃疡性结肠炎患者结肠粘膜分离的变异梭杆菌诱导实验性溃疡性结肠炎。肠道。2003;52:79 - 83。

18.Minami M, Ando T，冈本A, Sasaki N, Ohkura T, Torii K, Hasegawa T, Ohta M, Goto H.日本溃疡性结肠炎患者中变异梭杆菌的血清阳性率。免疫医学微生物学。2009;56:67 - 72。

19.Strauss J, Kaplan GG, Beck PL, Rioux K, Panaccione R, Devinney R, Lynch T, Allen-Vercoe E.肠道粘膜源形核梭杆菌的侵袭潜能与宿主IBD状态呈正相关。肠炎病2011;17:1971 - 1978。

20.Yoneda M, Kato S, Mawatari H, Kirikoshi H, Imajo K, Fujita K, Endo H，高桥H，稻森M，小林N，久保田K，斋藤S，东内I，渡之K，和田K，前田S，等。坏死梭杆菌牙周细菌感染引起肝脓肿。国际肝病杂志2011;41:194 - 196。

21.由梭杆菌引起的肝脓肿与恶性转移性肝病相似。中华临床微生物感染杂志2002;21:884 - 886。

22.我是布鲁克，我是弗雷泽。胰腺脓肿的微生物学分析。1996年《临床感染杂志》;22:384 - 385。

23.Han XY, Weinberg JS, Prabhu SS, Hassenbusch SJ, Fuller GN, Tarrand JJ, Kontoyiannis DP。梭菌性脑脓肿:五例回顾及可能的发病机制分析。神经外科杂志。2003;99:693 - 700。

24.标记B, Roques C, Poulet P, Duffaut D.有核梭杆菌在牙周健康和疾病中的作用。《Mol生物学》2011;13:25-36。

25.Shahani L, Khardori N.尸磷梭杆菌-超越Lemierres综合征。BMJ病例报告。2011;doi: 10.1136 / bcr.07.2011.4527。

26.Kostic AD, Gevers D, Pedamallu CS, Michaud M, Duke F, Earl AM, Ojesina AI, Jung J, Bass AJ, Tabernero J, Baselga J, Liu C, Shivdasani RA, Ogino S, Birren BW, Huttenhower C，等。基因组分析确定梭杆菌与结直肠癌的相关性。Genome Res. 2012;22:292 - 298。

27.Castellarin M, Warren RL, Freeman JD, Dreolini L, Krzywinski M, Strauss J, Barnes R, Watson P, ellen - vercoe E, Moore RA, Holt RA。有核梭杆菌感染在人大肠癌中普遍存在。Genome Res. 2012;22:299 - 306。

28.田原T，山本E，铃木H, Maruyama R, Chung W, Garriga J, Jelinek J, Yamano HO, Sugai T, An B, Shureiqi I, Toyota M，近藤Y, Estecio MR, Issa JP。结肠菌群中的梭菌与大肠癌的分子特征。2014年癌症决议;74:1311 - 1318。

29.Flanagan L, Schmid J, Ebert M, Soucek P, Kunicka T, Liska V, Bruha J, Neary P, Dezeeuw N, Tommasino M, Jenab M, Prehn JH, Hughes DJ。有核梭杆菌与结直肠肿瘤发展阶段、结直肠癌和疾病结局相关。中华临床微生物感染杂志2014;33:1381 - 90。

30.Kostic AD, Chun E, Robertson L, Glickman JN, Gallini CA, Michaud M, Clancy TE, Chung DC, Lochhead P, Hold GL, El-Omar EM, Brenner D, Fuchs CS, Meyerson M, Garrett WS。有核梭杆菌增强肠道肿瘤发生和调节肿瘤免疫微环境。细胞宿主和微生物。2013;14:207 - 215。

31.Fritz S, Hackert T, Hartwig W, Rossmanith F, Strobel O, Schneider L, Will-Schweiger K, Kommerell M, Buchler MW, Werner J.急性坏死性胰腺炎的细菌易位和感染性胰腺坏死源于小肠而非结肠。美国外科杂志2010;200:111 - 117。

32.郑玲，吉丽。利米尔综合征胃肠道变异:有核梭杆菌血症相关性肝静脉血栓形成一例报告及文献复习。Am J Ther。(印刷中)。

33.裴志，毕尼殷杰，杨林，周敏，弗朗索瓦，Blaser MJ。人类食管远端细菌菌群。美国国立自然科学研究院2004;101:4250 - 4255。

34.Aviles-Jimenez F, Vazquez-Jimenez F, Medrano-Guzman R, Mantilla A, Torres J.胃微生物组成在非萎缩性胃炎患者和肠型胃癌患者之间存在差异。科学报告。2014;4:4202。

35.朗克尔NS，罗德里格斯LF，穆迪FG。负鼠急性胰腺炎脓毒症发生机制。美国外科杂志1995;169:227 - 232。

36.Schetter AJ, Heegaard NH, Harris CC.炎症与癌症:microRNA、自由基、细胞因子和p53通路的交织。致癌作用。2010;31:37-49。

37.Hughes LA, Melotte V, de Schrijver J, de Maat M, Smit VT, Bovee JV, French PJ, van den Brandt PA, Schouten LJ, de Meyer T, van Criekinge W, Ahuja N, Herman JG, Weijenberg MP, van Engeland M. CpG岛甲基化表型:名字中包含什么?2013年癌症决议;73:5858 - 5868。

38.Irahara N, Baba Y, Nosho K, Shima K, Yan L, Dias-Santagata D, Iafrate AJ, Fuchs CS, Haigis KM, Ogino S. NRAS突变在结直肠癌中很少见。《病理与病理诊断》2010;19:157 - 163。

39.伊藤M，三桥K，五十岚H，诺正K，内藤T，吉井S，高桥H，藤田M，须川Y，山本E，高桥T，安达Y，野岛M，佐佐木Y，东野T, Baba Y，等。在锯齿状病变中MicroRNA-31表达与BRAF突变、CpG岛甲基化和结直肠连续体的关系国际癌症杂志2014;135:2507 - 2515。

40.董娟，赵亚平，周玲，张春平，陈刚。miR-21直接相互作用诱导Bcl-2上调与MIA PaCa-2胰腺癌细胞凋亡和化疗耐药相关Arch Med Res. 2011;42:8-14。

41.Nagao Y, Hisaoka M, Matsuyama A, Kanemitsu S, Hamada T, fuyama T, Nakano R, Uchiyama A, Kawamoto M, Yamaguchi K, Hashimoto H.在胰腺导管腺癌中microRNA-21与其靶点PDCD4和TIMP3表达的相关性《Mod Pathol》，2012;25:112 - 121。

42.Farrell JJ, Toste P, Wu N, Li L, Wong J, Malkhassian D, Tran LM, Wu X, Li X, Dawson D, Wu H, Donahue TR.内镜下获得性胰腺囊肿液MicroRNA 21和221与浸润性癌症相关。美国胃肠病学杂志。2013;108:1352 - 1359。

43.德德A，王宏，杨晓峰。MicroRNAs和toll样受体/白细胞介素-1受体信号。中华血液病杂志2012;5:66。

44.Honda T, Takahashi N, Miyauchi S, Yamazaki K.牙龈卟啉单胞菌脂多糖诱导miR-146a而不改变炎症因子的产生。生物化学生物物理研究，2012;420:918 - 925。

45.瓦拉迪，K，波西奥斯，M，李俊杰，乔。外泌体介导的mrna和microRNAs转移是一种新的细胞间遗传交换机制。自然细胞生物学。2007;9:654 - 659。

46.Rechavi O, Erlich Y, Amram H, Flomenblit L, Karginov FV, Goldstein I, Hannon GJ, Kloog Y.细胞接触依赖获取细胞和病毒非自主编码的小rna。基因与发育。2009;23:1971 - 1979。

47.Tavano F, di Mola FF, Piepoli A, Panza A, Copetti M, Burbaci FP, Latiano T, Pellegrini F, Maiello E, Andriulli A, di Sebastiano P.胰腺癌中miR-143和miR-21表达的变化及临床病理相关性胰腺。2012;41:1280 - 1284。

48.McShane LM, Altman DG, Sauerbrei W, Taube SE, Gion M, Clark GM.肿瘤标志物预后研究报告建议(REMARK)。中华泌尿外科杂志2005;97:1180 - 1184。

49.Boutaga K, Winkelhoff AJ, vandenbruck - grauls CM, Savelkoul PH.牙周病原体:厌氧培养和实时PCR的定量比较。《FEMS免疫学与医学微生物学》2005;45:191 - 199。

50.Nosho K，五十岚H, Nojima M, Ito M, Maruyama R, Yoshii S, Naito T, Sukawa Y, Mikami M, Sumioka W, Yamamoto E，黑川S，安达立Y，高桥H，奥田H, Kusumi T，等。microRNA-31与BRAF突变、结直肠癌生存和锯齿状通路的关系致癌作用。2014;35:776 - 783。