所使用的所有菌株见表1．实验中，细菌在37℃下培养16 h(双歧杆菌:de Man-Rogosa Sharpe培养基，0.5 g/L半胱氨酸，厌氧;大肠杆菌:脑心输注介质，有氧;所有媒体BD Difco，巴塞尔，瑞士)。HT-29细胞维持在50% CO下₂在DMEM中(4.5 g/L葡萄糖;Amimed，巴塞尔，瑞士)添加100 mL/L胎牛血清(FCS;Amimed)， 10 mL/L非必需氨基酸(NEAA, Sigma，巴塞尔，瑞士)，10 mL/L青霉素-链霉素溶液(pen-strep, Sigma)。用pNF-κB-SEAP-NPT质粒稳定转染HT-29细胞系，获得HT-29克隆34个细胞。48]。该质粒含有分泌性碱性磷酸酶(SEAP)的报告基因。它含有融合到单纯疱疹病毒胸苷激酶启动子tata样启动子区域的κB4增强子元件，允许在NF-κB信号通路激活后报告基因的表达。SEAP编码序列之后是SV40晚期聚腺苷化信号，以确保SEAP转录物在真核细胞中得到正确和有效的处理。载体主干还包含一个用于复制的pUC起源和一个用于繁殖和选择的氨苄西林抗性基因大肠杆菌．此外，它还含有新霉素磷酸转移酶基因，是真核细胞遗传素抗性的优势选择标记。放大后大肠杆菌使用lipofectamine (Invitrogen, Basel, Switzerland)将质粒TG1转染到HT-29细胞中等［48用重组人TNF-α (10 μg/L, R&D Systems, Oxon, England)作为刺激，稳定克隆34表现出良好的报告基因激活动力学，用于报告基因检测。将HT-29克隆34个细胞培养于含有100 mL/L FCS、10 mL/L NEAA、0.5 g/L遗传素的DMEM中;英杰公司)。实验中，HT-29和HT-29克隆34个细胞均以2 × 10的倍率接种⁵细胞/mL, 12孔格式细胞培养板(Falcon^®(Milian, Geneva, Switzerland)，并在各自的培养基中培养，直到达到90%-100%的融合。在这个阶段，大约是1 × 10⁶细胞/孔计数。

按上述方法培养HT-29或HT-29克隆34个细胞。在90%-100%汇合时，洗涤细胞，将培养基改为0.9 mL DMEM，加入100 mL/L FCS, 10 mL/L NEAA, 50 mmol/L Hepes (Invirogen)和青霉素G (100 kU/L;丙烯酰胺)。按照上述方法培养细菌，并在指定的感染倍数(莫伊)加入0.1 mL细胞培养基中。在一些实验中，细胞与细菌一起预孵育1小时，然后用TNF-α (10 μg/L)或LPS (10 μg/L，血清型B55:O5;σ)。如有指示，在50ml /L人乳(HM)的存在下进行攻毒。从不同的母亲(哺乳期第20天)抽取乳汁并汇总。本研究使用的HM池含有26 mg/L的sCD14 (ELISA测定;P.仆人，个人沟通)。孵育16 h后，离心收集上清液，用于定量SEAP或IL-8。通过台盼蓝(Sigma)排除镜连续检查真核细胞的活力，所有实验的真核细胞活力均为95%。

使用PhosphaLight™试剂盒(Tropix, MA, USA)通过生物发光定量SEAP的磷酸酶活性。生物发光在TECAN SPECTRAFluor Plus光谱仪中以相对光单位(RLU)测量，积分时间为100毫秒，增益设置为100。数据分析采用XFlour 4.40版软件。RLU因实验性质不同而不同。如果使用多个实验来呈现数据和进行统计分析，则通过将数据归一化来校正这些日常变化，为阳性对照(LPS + HM)设置100 RLU单位。在一个实验中，10 μg/L TNF-α和10 μg/L LPS联合HM后，NF-κB活化水平相似。

采用IL-8酶联免疫吸附测定试剂盒(Diaclone, CT, USA)，定量测定分泌的IL-8蛋白。用Dynex MRX微孔板读卡器(Dynex Technologies, Worthing, England)在450 nm处测量吸光度。

real-time PCR的方法是，在5% (v/v) HM存在下，用NucleoSpin对HT-29细胞进行细菌预处理和LPS攻毒4小时后分离RNA^®RNAII试剂盒(Macherey-Nagel, d ren，德国)。RNA用Ribogreen定量^®RNA定量试剂盒(分子探针，巴塞尔，瑞士)。使用Agilent RNA 6000 Nano Assays和2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies, CA, USA)及其相应软件(版本A.01.16)验证RNA的质量。用TaqMan逆转录试剂将总RNA的1 μg转录为cDNA。用5 μL TaqMan建立实时反应^®2 × PCR Master Mix, 0.5 μL TaqMan^®检测-按需引物/探针混合物(甘油醛-3磷酸脱氢酶(GAPDH): Hs99999905_mL;引发:Hs00174103_mL;肿瘤坏死因子-α:Hs00174128_mL;cox - 2: Hs00153133_mL;ICAM-1: Hs00164932_mL;所有试剂均购自Applied Biosystems)和4.5 μL H₂O含有cDNA，对应于10-20 ng RNA，取决于目标基因。采用ABI Prism 7900HT序列检测系统(Applied Biosystems)进行实时PCR，并使用SDS软件包2.1版进行分析。使用GAPDH基因对不同RNA样品的RNA量进行归一化。

为了研究双歧杆菌对IECs炎症事件的影响，即对NF-κB激活的影响，我们在HT-29克隆34细胞中进行了报告基因检测。细胞与细菌(莫伊= 100)作用16 h。随后，在培养上清液中测定NF-κ b驱动的报告蛋白SEAP的活性(图2)1）.而非致病性大肠杆菌D2241诱导了显著的报告基因活性，所有测试的双歧杆菌都没有诱导任何高于背景水平的NF-κB活化。同样的基于细胞的实验用于研究双歧杆菌对lps诱导的IECs炎症的影响。用LPS刺激HT-29克隆34个细胞16 h，随后在培养上清液中测定SEAP活性(表2)2）.仅LPS对NF-κB活化的诱导作用是未刺激细胞的2.5倍。为了模拟IBD患者肠上皮中CD14表达增加的情况，在实验中加入50 mL/L含有sCD14的HM。添加HM可使lps诱导的NF-κB活化增加50倍，而HM单独不导致NF-κB活化。此外，在HM存在的情况下，没有一种双歧杆菌在刺激时诱导NF-κ b依赖性报告基因活性高于背景水平大肠杆菌D2241增强约200倍(数据未显示)，进一步支持双歧杆菌不会诱导IECs炎症事件的结果。

图1 HT-29克隆34个细胞在moi = 100作用16 h时，上清液中NF-κ b驱动的SEAP活性测定。 结果以RLU表示，为三个独立实验中一个代表的三次测量的平均值±标准差(SD)。阴性:阴性对照，无细菌。

一些报告表明含有双歧杆菌的益生菌具有抗炎作用[38，44，49]。因此，本研究中使用的所有双歧杆菌在不同细菌剂量下对lps诱导的NF-κB活化的潜在抑制作用进行了评估。在一个莫伊结果1，没有双歧杆菌对nfκ b依赖性报告基因活性有影响(数据未显示)。如图所示2，在一个莫伊= 10，然而，预处理用b . lactisNCC362和b . bifidumNCC189、S16和S17显著降低NF-κ b依赖性报告基因活性，为阳性对照的47%-71%。当预处理的细菌剂量进一步增加到每个细胞100个细菌(莫伊= 100)，抑制作用b . bifidumNCC189和b . bifidumS17几乎完全(阳性对照的5%)b . lactisNCC362,b . longumNCC2705,b . adolescentisNCC251和b . bifidumS16为中度(阳性对照的20%-52%)。相比之下,b . longum /对象E18和b .谕令MB226对两者的SEAP激活均无抑制作用或仅有极轻微的抑制作用莫伊．为了评估双歧杆菌的物理存在是否需要其抑制作用，进一步的实验使用双歧杆菌预处理16 h的细胞培养基，然后使用过滤器灭菌去除双歧杆菌细胞。使用这种条件培养基对lps诱导的HT-29克隆34细胞的NF-κB活化没有任何抑制作用(数据未显示)。这些结果表明，8种双歧杆菌中有6种显著抑制lps诱导的IECs中NF-κ b的激活，并且双歧杆菌的这种抑制能力是菌株和剂量依赖性的。此外，双歧杆菌细胞在LPS攻击期间的存在是其抗炎作用所必需的，这表明这种抑制不是由于分泌的化合物。为了证明报告蛋白活性的降低不是高剂量细菌与LPS联合作用导致细胞凋亡的结果，我们用台锥蓝排斥法证实了细胞的活力。用两种代表性菌株(b . longumNCC2705和b . bifidumS17)，在所有实验中，LPS + HM激发的双歧杆菌的生存能力为bb0 95%，这表明双歧杆菌抑制LPS诱导的报告基因活性不是由于细胞死亡(图17)3.）.

图2不同双歧杆菌对lps诱导的NF-κ b活化的抑制作用呈剂量和菌株依赖性。 用不同双歧杆菌对HT-29克隆34细胞进行预孵育，定量测定其上清液中SEAP活性莫伊= 10(深灰色条)或莫伊= 100(浅灰色条)，随后用LPS + HM刺激16小时。培养基处理的细胞仅作为阴性对照(阴性;白色条)和阳性对照(pos;黑色条形图)的细胞用LPS + HM攻毒，未经细菌预处理。结果为三个独立实验的均数±标准误差(SEM)。每个实验的RLU归一化为100 RLU为阳性对照。

图3细胞活力显微镜检查。 用LPS + HM攻毒的HT-29克隆34个细胞在双歧杆菌(b . longumNCC2705或b . bifidum肌力;莫伊= 100)。阳性对照(pos)为不经细菌预处理的LPS + HM孵育细胞。台盼蓝染色细胞在pH为4(死亡)的细胞培养基中孵育16h作为对照。

为了进一步研究双歧杆菌对NF-κB激活后炎症事件的影响，我们在细菌预处理后的HT-29细胞中监测IL-8分泌和IL-8、TNF-α、COX-2和ICAM-1编码基因mRNA水平b . bifidum肌力和b . longumNCC2705和随后的LPS挑战。Pre-incubation与b . bifidumS17使IECs的IL-8分泌减少到阳性对照的20%左右莫伊= 10，在每个细胞100个细菌时能够完全抑制IL-8的分泌(表2)3.）.有效抑制b . longumNCC2705仅在a莫伊= 100。因此，IECs对IL-8分泌的剂量反应与对NF-κ b驱动的SEAP报告基因活性的剂量反应相似。

采用实时荧光定量PCR技术研究双歧杆菌预处理HT-29细胞对已知受NF-κB调控基因mRNA水平的影响。预处理与b . longumNCC2705和b . bifidumS17 at a莫伊= 100严重抑制了HM存在下LPS刺激HT-29细胞中IL-8、TNF-α、COX-2和ICAM-1基因的转录激活(表2)4）.再一次。b . bifidumS17比b . longumNCC2705。综上所述，这些结果表明，选定的双歧杆菌菌株能够抑制lps诱导的iec炎症事件。

除LPS外，NF-κB可通过多种刺激被激活(见介绍)。因此，有趣的是，测试是否可以观察到双歧杆菌对除LPS以外的促炎刺激(如TNF-α)的类似抑制。在莫伊= 100时，当10 μg/L TNF-α攻毒HT-29克隆34个细胞时，所测双歧杆菌均未对NF-κ b依赖性报告基因活性产生抑制作用(图2)4）.进一步实验采用低剂量TNF-α (1 μg/L)作为刺激，不同剂量细菌(莫伊= 10和100)。在所有测试条件下，双歧杆菌对TNF-α诱导的NF-κB活化均无抑制作用(数据未显示)。这些结果表明双歧杆菌对lps诱导的IECs中NF-κB活化的抑制能力是特异性的。

图4不同双歧杆菌对HT-29克隆34个细胞进行预孵育，在50 mL/L HM存在下，TNF-α (10 μg/L)刺激16 h，细胞上清中NF-κ b驱动的SEAP活性。 培养基处理的细胞仅作为阴性对照(negative)，阳性对照(pos)是未经细菌预处理的TNF-α + HM攻毒的细胞。结果以RLU表示，是两个独立实验的一个代表性的三次测量的平均值±SD。