doi: 10.1111 / j.1462-5822.2009.01381.x。
Epub 2009年9月11日。
克罗恩氏变异adherent-invasive大肠杆菌复制细胞受损青睐的选择性自噬
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- PMID:19747213
- PMCID:PMC3743084
- DOI:10.1111 / j.1462-5822.2009.01381.x
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克罗恩氏变异adherent-invasive大肠杆菌复制细胞受损青睐的选择性自噬
细胞Microbiol。
2010年1月。
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文摘
克罗恩病(CD)患者回肠病变是由致病性殖民adherent-invasive大肠杆菌(AIEC)能够入侵和肠上皮细胞内复制。最近的全基因组关联研究强调了自噬通路与CD相关风险。在目前的研究中我们调查了自噬缺陷是否提高复制的共生体,致病性大肠杆菌和CD-associated AIEC。我们表明,自噬功能限制细胞内AIEC复制和细胞内细菌的族群是位于LC3-positive自噬小体。IRGM和ATG16L1缺乏细胞胞内AIEC LF82细菌增强复制。惊人的自噬缺陷不会影响到胞内细菌生存的能力和/或复制任何其他大肠杆菌菌株测试,包括非致病性、环境、共生的,或致病菌株参与胃炎肠炎。这些发现证明一个核心作用对自噬抑制Adherent-Invasive大肠杆菌菌株与回肠CD。AIEC感染患者在自噬基因多态性可能产生重大影响的结果肠道炎症。
利益冲突声明
数据
实验与野生型小鼠胚胎成纤维细胞(黑色矩形)和自噬缺陷atg5 /−−mef(白色矩形)。与非致病性感染进行大肠杆菌k - 12株MG1655,环境大肠杆菌短信3.5,共餐者的压力大肠杆菌应变HS,致肠病的大肠杆菌(EPEC)应变E2348/69 (D),广泛地坚持大肠杆菌(DAEC)应变C1845产肠毒素的大肠杆菌(ETEC)应变H10407 enteroinvasive大肠杆菌(EIEC)应变E12860/0, CD-associated adherent-invasive大肠杆菌(AIEC)应变LF82。测定细胞内细菌的数量在不同时期感染后从1 h - 6 h。结果表示为入侵对应百分比平均比例的培养液检索1 h(庆大霉素治疗后细胞内细菌感染后1 h (一个)或胞内细菌感染后6 h后的比例相对于获得1 h庆大霉素曝光后,作为100% (B)。共焦显微镜检查时,AIEC LF82-GFP感染wt mef和自噬缺陷atg5−−/ mef后6 h感染后(C),细菌表达GFP的绿色,肌动蛋白在红色和蓝色的细胞核。代表共焦显微图LAMP-1(紫色)和lysotracker AIEC-LF82感染wt mef(红色)标签和Atg5−−/ mef 6 h后感染(D)。
一个。使用抗体免疫印迹分析LC3和肌动蛋白分析LC3 II / LC3在早期感染或感染后的我比AIEC LF82。B。共焦显微镜检查时,AIEC LF82-GFP感染wt mef和atg5−−/ mef感染后6 h分析LC3 colocalisation使用单克隆抗体LC3(红色)。核是蓝色的。C。的百分比LC3积极液泡包含LF82-GFP细菌由共焦显微镜在不同时期感染后。数据显示表示意味着+ /−SEM的三个独立的实验中,计算每50个细胞实验。
一个。细胞内复制AIEC LF82细菌在感染后1 h和6 h在海拉,Hep-2和肠- 407上皮细胞。结果表示为平均数量+ /−SEM集落形成单位(CFU)。每个点的意思是至少三个独立的实验。B。超微结构分析肠- 407和Hep-2上皮细胞感染AIEC应变LF82 6 h通过透射电子显微镜显示各种细胞内胞内细菌LF82隔间:单一细菌单层膜空泡(1 - 5),一些细菌在一个单一的膜泡(2和6),细菌破坏液泡(3和7)和细菌multilamellar膜泡还含有隔离细胞质(4和8)。C。共焦显微镜检查时,AIEC LF82 GFP-infected海拉细胞在感染后6 h贴上lysotracker(红色)和LAMP-1(紫色)液泡形象化。D。共焦分析与洋地黄皂苷和标签的质膜透化作用后的免费胞质AIEC LF82 O83抗体(红色)和液泡的LAMP-1抗体(紫色)。
一个。使用抗体免疫印迹分析LC3 B或肌动蛋白LC3 II / LC3我比率分析在不同时期感染后与AIEC LF82。诱导自噬与雷帕霉素进行治疗(2 h 40µg /毫升)作为LC3二世的积极控制转变。B。共焦显微镜检查时,AIEC LF82-GFP(绿色)感染海拉在感染后6 h分析LC3 colocalisation使用单克隆抗体LC3(红色)。核是蓝色的。
一个。雷帕霉素剂量依赖性降低细胞内的数量AIEC LF82细菌。细胞与细菌感染的治疗。结果表示为平均数量+ /−SEM集落形成单位(CFU)在感染后1 h。每个点的意思是至少三个独立的实验。B。比较早期或晚期诱导自噬的雷帕霉素治疗的能力AIEC LF82细菌生存和/或复制细胞。雷帕霉素在添加了3 h感染,或在1 6到20 h感染后。结果表示为治疗细胞的胞内细菌数量相对于获得的未经处理的细胞,为100%。C。共焦显微镜检查时,雷帕霉素治疗的海拉细胞感染AIEC LF82-GFP 1 h和20 h与LC3感染后贴上标签(红色)和LAMP-1(紫色)。D。在海拉细胞诱导自噬的影响由饥饿或有限合伙人(100 ng / mL)和IFN-γ(1000 u /毫升)刺激细胞内的数字AIEC LF82细菌。结果表示为治疗细胞的胞内细菌数量相对于获得的未经处理的细胞,为100%。E。的表达Atg5K130R主导-海拉细胞导致增加数量的细胞内AIEC LF82细菌。海拉细胞与质粒转染野生型Atg5 pEGFP-Atg5编码(黑条)或Atg5 pEGFP-Atg5K130R编码K130R显性负3 h(白色酒吧)被感染。结果表示为平均数量+ /−SEM集落形成单位(CFU)。每个点的意思是至少三个独立的实验。
核实验对内生ATG16L1成绩单进行海拉细胞转染与ATG16L1特定siRNA寡核苷酸。一个。内生ATG16L1 mRNA击倒由特定核在海拉细胞转染48 h后被实时定量rt - pcr规范化GAPDH评估,而控制工器。rt - pcr进行了一式三份。代表独立的实验结果。B。ATG16L1击倒的能力增加AIEC LF82细菌复制细胞。海拉细胞转染与控制(黑条)或ATG16L1小干扰rna寡核苷酸(白色bar)直接被感染3 h。结果表示为平均数量+ /−SEM集落形成单位(CFU)。每个点的意思是至少三个独立的实验。C。ATG16L1击倒和allele-specific救援揭示妥协AIEC介导的自噬CD-associated * 300等位基因。HeLa-GFP-LC3细胞转染与控制(原文如此)或小干扰rna工器ATG16L1-targeting,连同空质粒(siATG16L1),感染AIEC之前或allele-specific救援构造。三个小时后感染,细胞被固定和染色进行微观分析。数据显示表示意味着+ /−SEM的三个独立的实验中,计算每50个细胞实验。意义决定用双尾学生t Bonferroni调整为多个比较。D。共焦显微镜检查细胞内的colocalization AIEC LF82细菌与GFP-LC3 HeLa-GFP-LC3细胞转染和小干扰rna工器控制或ATG16L1-targeting,连同空质粒,或感染AIEC之前allele-specific救援构造。E。ATG16L1击倒的allele-specific表达水平和救援的结果相似。表达式的救援结构相同的情况下,由西方墨点法与ATG16L1-specific抗体,利用肌动蛋白作为加载控制。
siRNA实验对内生IRGM记录进行的海拉细胞cotransfected Flag-tagged IRGM表达质粒pCMV-3xFlag和小干扰rna寡核苷酸IRGM具体。一个。使用anti-Flag抗体免疫印迹分析IRGM表达式。B。IRGM击倒的能力增加AIEC LF82细菌复制细胞。海拉细胞转染与控制(黑条)或IRGM小干扰rna寡核苷酸(白色bar)直接被感染3 h。结果表示为平均数量+ /−SEM集落形成单位(CFU)。每个点的意思是至少三个独立的实验。C。IRGM击倒不修改的生存/复制非致病性大肠杆菌。结果表示为胞内细菌感染后6 h的数量相对于1 h感染后,获得了100%。D。共焦显微镜检查显示出增加的细胞内AIEC LF82 IRGM击倒的细菌细胞。核控制siRNA-treated (siControl)和IRGM siRNA-treated IRGM)细胞被感染AIEC LF82-GFP细菌和共焦显微成像。控制细胞显示细胞内GFP-bacteria(绿色)小集群包含在LC3积极(红色)液泡。E。共焦显微镜检查时,IRGM siRNA-treated海拉细胞感染AIEC LF82 GFP在6 h与lysotracker感染后贴上标签(红色)和LAMP-1(紫色)液泡形象化。
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