一种独特的成年小鼠胆囊干细胞群的鉴定和扩增
肝脏病学．
2011年11月．
免费PMC文章
摘要
到目前为止，小鼠胆囊中常驻干细胞的鉴定还未被探索。此外，成人胆囊干细胞与肝内胆管(IHBD)细胞之间的关系尚不清楚。这项研究的目的是从成年小鼠胆囊中分离干细胞，并确定它们与IHBD细胞相比是否独特。通过限制性稀释分析和指数排序，我们发现，与EpCAM(+) CD49f(lo)细胞相比，来自原代胆囊的EpCAM(+) CD49f(hi)上皮细胞亚群在集落形成细胞中富集。EpCAM(+) CD49f(hi)细胞表达分化簇(CD)29、CD133和干细胞抗原-1，但谱系标记CD31、CD45和F4/80阴性。使用一种新的供体细胞培养系统，我们在体外观察了EpCAM(+) CD49f(hi)细胞的长期(>传代20)和克隆扩增。在基质分化试验中，体外扩增的EpCAM(+) CD49f(+)细胞发生了器官型形态发生，形成导管结构和囊肿。这些结构类似并概括了初级胆囊的运输功能。EpCAM(+) CD49f(+)细胞也移植到受体小鼠的皮下空间。我们通过流式细胞术比较了原代胆囊细胞和IHBD细胞，发现CD49f、CD49e、CD81、CD26、CD54和CD166的表达存在表型差异。 In addition, oligonucleotide microarrays showed that the expanded EpCAM(+) CD49f(+) gallbladder cells and IHBD cells exhibit differences related to lipid and drug metabolism. Notable genes that were different are cytochrome P450, glutathione S-transferase, Indian hedgehog, and solute carrier family genes.
结论:我们从原代小鼠胆囊中分离出具有干细胞特征的上皮细胞群，并发现它与IHBD细胞相比是独特的。
版权所有©2011美国肝病研究协会。
数据
(A)小鼠胆囊石蜡切片EpCAM染色。EpCAM仅对胆囊上皮细胞染色。上皮细胞基底外侧膜EpCAM+(箭头)。(B)丙酮固定切片用CK19和EpCAM染色。表观荧光(左图)和共聚焦(右图)显微照片显示CK19与EpCAM共染色。(C)原发胆囊的流式细胞分析显示CD49f异质性(标记百分比为亲本群体的频率)。流线图上的十字准星指示对照群体确定的未染色细胞的自身荧光。(D)用EpCAM和CD49f染色的丙酮固定切片共聚焦显微照片。白色箭头:EpCAM+CD49f嗨细胞。白色箭头:EpCAM+CD49f罗细胞。比例尺:100 μm。
收集雄性和雌性小鼠的胆囊(n≥5个)并进行分析或分类。(A)原代和扩增小鼠胆囊细胞的流式细胞术分析表明，LA7培养系统中只有上皮细胞扩增。D0:原代细胞;P0:初次扩张的细胞。喂养细胞(EpCAM- gfp−)已从EpCAM vs. CD45/TER119图中筛选出用于首次扩增的细胞。(B)扩张胆囊细胞(p0)的流式细胞分析显示，所有EpCAM+细胞都是CD49f+。中间图中为EpCAM-GFP−细胞。(C)在EpCAM+CD49f上进行极限稀释分析嗨和EpCAM + CD49罗原代胆囊细胞。菌落形成单位(CFU)频率±SE (L-Calc®)表明CD49f富集干细胞。皮尔森的χ2在49f上进行统计计算嗨f和49罗由ELDA组织。实验1:χ2: 17.8;假定值:2.43 e-5。实验2:χ2: 42.9;假定值:5.79 e-11。图A到C的流程图上的十字准星指示了左下角的控制人群。(D)从原发性胆囊分类。将单个EpCAM+细胞分成3个96孔板的每孔。(i) 3个有代表性的生长孔的数据显示CD49f表达和随后的菌落形态。索引排序结果表。11/12(91.7%)的生长井起源于CD49f嗨细胞。比例尺:100 μm。
(A)第一段(p0)在体外，胆囊细胞呈现两种不同的形态。观察到扁平菌落(红色箭头)和腺状菌落(箭头)。在后期传代(p1, p6, p17)只观察到平坦的菌落。(B和C)光镜和电子显微照片显示扁平的菌落和腺状菌落。扁平集落由顶端到底侧极性明确的立方细胞组成，显示假定的液体运输(箭头)，并具有典型的胆囊上皮细胞的连接装置。腺集落由围绕中心腔组织的柱状细胞组成。在腔内观察到分泌产物(*)。(D)为了确定腺菌落是否可以通过第一次传代，菌落从第一次扩张(p0)培养中挑选。只有平坦的菌落才会扩张到p0以上。MV:微绒毛，RER:粗面内质网，LY:溶酶体，M:线粒体，S:分泌颗粒，N:细胞核，BM:基底膜。 Arrowheads: Tight Junctions. * Glycocalyceal substance. Unless specified otherwise, scale bars: 100 μm.
(A)在体外分化试验。将EpCAM+CD49f+胆囊细胞(>p1)镀于无血清培养基组织培养的培养皿上，并在其上分层。观察到两种不同形式的形态发生:导管结构(红色箭头)和囊肿(白色箭头)。在塑料上(白色箭头)还观察到细胞的菌落生长。(B)导管结构是管状的，由单层或双层细胞衬里的长而相互连接的导管组成。(i)显示相互连接的管道的光学显微照片。*腔。(ii)活导管结构共聚焦显微照片原位在母体中。(C)囊肿类似地由单层或双层细胞围绕中空腔组成。(i)活囊肿的光和共聚焦显微照片原位基质中，可见由细胞排列的中空腔。(ii)从基质中分离囊肿，用甲苯胺蓝染色。(D)包囊(电镀后21天)和初代胆囊的电子显微照片显示相似的超微结构。两者均由柱状上皮细胞组成，具有顶端至基底外侧极性、基底核、微绒毛和连接器官。(E)用100 μM罗丹明123 (Rh 123)±10 μM维拉帕米孵育囊肿。共聚焦显微照片显示在指定时间的光学切片的延时图像。Rh 123在腔内累积超过1小时。维拉帕米阻碍了运输。MV:微绒毛，M:线粒体，N:细胞核。除非另有说明，比例尺:100 μm。
(A)单细胞克隆试验示意图。第1代EpCAM+CD49f+胆囊细胞(p0)按1个细胞/孔分成384孔板。通过这种方式，产生了8个克隆。描述了CloneB21和CloneN12的代表性图像。(B)进一步扩大无性胆囊培养，并进行分化试验。与亲本培养相比，无性系表现出相似的形态发生。*流明，比例尺:100 μm。
将亲本或克隆性胆囊培养物与基质混合并注射到Rag2的皮下(subq)空间−−/γC−−/老鼠。分别于注射后1周和2周观察囊肿。(A)(左图)注射亲本EpCAM+CD49f+细胞小鼠1周时分离的基质宏观视图(右图)同一基质的EpCAM和GFP染色切片，可见囊肿中空，EpCAM+。7/7和2/3小鼠分别注射亲本培养物和克隆培养物1周后出现囊肿。分别有1/5和1/3的小鼠在2周时出现植入。(B)胆囊克隆细胞保持EpCAM+CD49f+在活的有机体内．克隆b21扩增胆囊细胞注射subq。2周时，去除基质，重新分离细胞。流式细胞分析显示，重新分离的细胞为EpCAM+CD49f+。这些细胞扩张了在体外在喂食细胞上。p1(第二传代)的流式细胞分析显示，它们仍然是EpCAM+CD49f+。图A到C的流程图上的十字准星指示了左下角的控制人群。每个小区的碎片和细胞聚集物都被门控出来。在中间的区域，gfp细胞也被排除在外。*:流明。除非另有说明，比例尺:100 μm。
(A)来自原代胆囊和原代肝脏的EpCAM+(上皮细胞)的流式细胞术分析(见方法)．D0:原代细胞。选择细胞表面标记的表型差异表明胆囊和肝内胆管(IHBD)细胞是不同的。图A到C的流程图上的十字准星指示了左下角的控制人群。(B) IHBD细胞在LA7饲料上扩张，并表现出与扩张胆囊细胞相似的形态。(上图)扩增IHBD细胞的流式细胞术分析(p2)表明所有GFP+细胞都是EpCAM+。(下图)扩张后的IHBD细胞呈扁平集落外观。(C)已知注释和IHBD与胆囊细胞差异表达的折叠变化(≥2)的53个基因的热图(补充表3)。数据在Cluster中导入，用TreeView生成热图(
http://rana.lbl.gov/EisenSoftware.htm )．黑色表示表达强度为平均水平的基因;红色表示强度大于平均值;绿色表示强度小于平均值。除非另有说明，比例尺:100μm。
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