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． 2011; 6 (11): e26898。
doi: 10.1371 / journal.pone.0026898。 Epub 2011 11月17日。

肠上皮下肌成纤维细胞支持体外和体内人小肠上皮细胞的生长

尼古拉斯火山泥流1， 南野磊， Jiafang王， Ziyad Jabaji， stephen C Tung， Vaidehi Joshi， 迈克尔•刘易斯， 马提亚Stelzner， Martín G Martín， 詹姆斯·C·Y·邓恩
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肠上皮下肌成纤维细胞支持体外和体内人小肠上皮细胞的生长

尼古拉斯火山泥流et al。 《公共科学图书馆•综合》． 2011．
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摘要

肠道隐窝-生态位的相互作用被认为是必不可少的功能，维持和增殖的祖干细胞发现在肠隐窝基部。这些干细胞不断更新肠上皮细胞，将分化的细胞从Lieberkühn隐窝的基部送到绒毛尖端，在那里它们脱落进入肠腔。肠生态位由多种细胞类型、细胞外基质和生长因子组成，围绕肠祖细胞。最近，在对调节肠上皮行为的相互作用的理解方面取得了进展，并且对分离和扩展活肠上皮的方法有很大的兴趣。然而，目前还没有一种方法可以使原代人小肠上皮细胞在培养过程中保持较长时间。同样，也没有发表过描述人肠上皮在体内模型中的分离和支持的方法。我们描述了一种从手术标本中分离和维持体外人小肠上皮的技术。我们还描述了一种在小鼠模型中维持人肠上皮皮下较长时间的新方法。我们的方法需要各种生长因子以及肠亚上皮肌成纤维细胞(ISEMFs)和肠上皮细胞之间的密切相互作用来支持上皮细胞的体外和体内生长。这些肌成纤维细胞的缺失阻碍了上皮细胞形成和增殖的成功维持，即使在支持生长因子的存在下。 We believe that the methods described here can be used to explore the molecular basis of human intestinal stem cell support, maintenance, and growth.

利益冲突声明

利益冲突:作者宣称不存在竞争利益。

数据

图1
图1。小鼠和人肌成纤维细胞的特征。
(A) C57 BL/6小鼠肌成纤维细胞在塑料培养皿中镀4天。采用免疫荧光技术，对肠肌成纤维细胞进行特征性染色，SMA和波形蛋白染色阳性，desmin染色阴性。蓝色伪色为细胞核DAPI反染。(B)从成人回肠造口手术样本中分离肌成纤维细胞，并在免疫荧光染色前镀4天。与小鼠肌成纤维细胞相似，SMA和波形蛋白染色呈阳性，desmin染色呈阴性。(C)从婴儿回肠造口中分离肌成纤维细胞，并在免疫荧光染色前镀4天。与成人样本一样，SMA呈阳性但微弱。Vimentin染色阳性，desmin染色阴性。(D) C57 BL/6小鼠肌成纤维细胞的PCR结果与SMA和波形蛋白染色阳性、desmin染色阴性的免疫荧光结果一致。
图2
图2。Wnt、FGF生长因子和肌成纤维细胞对人上皮细胞生长的支持作用。
(A)在没有肌成纤维细胞(mf)或生长因子(GFs)的情况下培养的人类小肠隐窝可以存活大约两天，然后死亡。(B)人小肠隐窝在小鼠肌成纤维细胞的存在下培养，但没有生长因子，无限期地保持其囊状形状，但没有明显的生长。(C)在小鼠肌成纤维细胞存在的情况下，用Wnt3a和FGF10生长因子培养的人小肠隐窝开始是简单的囊肿，填充并挤压其内容物，随着时间的推移，形态变得更加复杂。(D)在生长因子存在的成人肌成纤维细胞上生长的人上皮细胞簇组织成简单的囊肿，但不能维持超过3天。(E)婴儿人类肌成纤维细胞能够在移植后9天支持人类肠道上皮细胞生长成复杂的囊性结构。对于A和B，比例尺为200µm。对于C、D和E，比例尺为100µm。
图3
图3。人婴儿肌成纤维细胞上人小肠类肠的长期培养。
在人类婴儿肌成纤维细胞上培养(A) 2天，(B) 8天，(C) 23天，(D) 56天的人类小肠隐窝显微照片。小囊肿随时间增大，有时相互融合形成较大的结构。
图4
图4。在体外在小鼠肌成纤维细胞上生长的人小肠肠样显示特征性肠上皮标记物。
在存在Wnt3a和FGF10的小鼠肌成纤维细胞上培养的人隐窝在18天后处理在体外．(A)培养相衬显微镜。(B)苏木精和伊红染色。注意细胞极性，基底区为上皮细胞核，顶端为杯状细胞。(C) E-cadherin，一种上皮细胞标志物。(D) CDX-2染色肠上皮。值得注意的是，e -钙粘蛋白染色相对均匀，CDX-2染色不均匀，提示隐窝-绒毛结构域交替。(E)平滑肌肌动蛋白，肌成纤维细胞标记物。(F) PAS，杯状细胞染色。注意上皮培养物顶端侧有挤出的粘液物质。 (G) Lysozyme, a Paneth cell marker. (H) Synaptophysin, marker for enteroendocrine cells. For all images, scale bars are 100 µm.
图5
图5。长期在体外在小鼠肌成纤维细胞上生长的人小肠类肠。
在Wnt3a和FGF10存在的情况下，在小鼠肌成纤维细胞上培养的人小肠隐窝在58天后处理在体外．(A)苏木精和伊红染色。(B) CDX-2染色肠上皮。(C) E-cadherin，一种上皮细胞标志物。(D) α平滑肌肌动蛋白，肌成纤维细胞的标志物。
图6
图6。在活的有机体内小鼠ISEMFs可维持人小肠类肠。
在Wnt3a和FGF10的存在下，小鼠肌成纤维细胞上的人小肠隐窝在培养液中培养11天，然后放置在PGA毡支架上，皮下植入免疫缺陷NOD-SCID-IL2Rγ缺失小鼠。28天后，收获植入物并用肠上皮标志物进行评估。(A) H&E显示至少三种细胞形态，囊肿腔内有嗜酸性物质。(B) E-cadherin和(C) CDX-2是肠上皮细胞标志物。再次注意CDX-2染色强度的变化，提示隐窝和绒毛结构域(D) α平滑肌肌动蛋白染色与上皮细胞相邻。(E)粘蛋白和产生粘蛋白的杯状细胞的PAS染色(F)嗜铬粒蛋白A，肠内分泌细胞的标记物。对于所有图像，比例尺为100µm。
图7
图7。在活的有机体内婴儿ISEMFs可维持人类小肠类肠。
人小肠隐窝在人肌成纤维细胞上生长8天，然后放置在PGA毡支架上，皮下植入免疫缺陷NOD-SCID-IL2Rγ缺失小鼠。28天后，收获植入物并用肠上皮标志物进行评估。(A) H&E染色显示上皮组织。(B) E-cadherin和(C) CDX-2是肠上皮细胞标志物。(D)肌成纤维细胞周围上皮细胞的α平滑肌肌动蛋白染色。(E) PAS染色粘蛋白和产生粘蛋白的杯状细胞。(F)溶菌酶，潘氏细胞的标记物。
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参考文献

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