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．gydF4y2Ba 2013年2月14日;494(7436):247-50。gydF4y2Ba
doi: 10.1038 / nature11826。gydF4y2Ba Epub 2013 1月27日。gydF4y2Ba

wnt驱动再生诱导Lgr5+肝干细胞体外扩增gydF4y2Ba

Meritxell HuchgydF4y2Ba1gydF4y2Ba，gydF4y2Ba 克雷格•雷尔gydF4y2Ba，gydF4y2Ba 西尔维亚·F·日银gydF4y2Ba，gydF4y2Ba Johan H van EsgydF4y2Ba，gydF4y2Ba 李思玮gydF4y2Ba，gydF4y2Ba Marc van de WeteringgydF4y2Ba，gydF4y2Ba Toshiro佐藤gydF4y2Ba，gydF4y2Ba Karien哈默尔gydF4y2Ba，gydF4y2Ba 田中伸男(Nobuo佐佐木gydF4y2Ba，gydF4y2Ba 米尔顿·J·费金gydF4y2Ba，gydF4y2Ba Annelise安顿下来gydF4y2Ba，gydF4y2Ba 罗伯特·G·弗里斯gydF4y2Ba，gydF4y2Ba 马库斯GrompegydF4y2Ba，gydF4y2Ba 汉斯聪明gydF4y2Ba
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wnt驱动再生诱导Lgr5+肝干细胞体外扩增gydF4y2Ba

Meritxell HuchgydF4y2Baet al。gydF4y2Ba 自然gydF4y2Ba．gydF4y2Ba ．gydF4y2Ba
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摘要gydF4y2Ba

Wnt靶基因Lgr5(含富白氨酸重复蛋白的g蛋白偶联受体5)在Wnt驱动的自我更新组织中标记积极分裂的干细胞，如小肠和结肠，胃和毛囊。三维培养系统允许单个Lgr5(+)干细胞长期克隆扩增成可移植类器官(芽殖囊肿)，保留原始上皮结构的许多特征。培养基的一个关键成分是Wnt激动剂RSPO1，最近发现的LGR5配体。在这里，我们发现Lgr5-lacZ在健康成人肝脏中不表达，然而，小的Lgr5-lacZ(+)细胞在损伤时出现在胆管附近，与Wnt信号的强烈激活相一致。使用新的Lgr5- ires - creert2敲入等位基因的小鼠谱系追踪显示，损伤诱导的Lgr5(+)细胞在体内生成肝细胞和胆管。单个来自受损小鼠肝脏的Lgr5(+)细胞可在以rspo1为基础的培养基中克隆扩增为类器官数月。这种克隆类器官可以在体外诱导分化，并在移植到Fah(-/-)小鼠后产生功能性肝细胞。这些发现表明，先前对主动自我更新组织中的Lgr5(+)干细胞的观察也可以扩展到自发增殖率低的组织中的损伤诱导干细胞。gydF4y2Ba

利益冲突声明gydF4y2Ba

经济利益的竞争gydF4y2Ba

MH和HC是与这项工作相关的专利申请的发明人。gydF4y2Ba

数据gydF4y2Ba

图1gydF4y2Ba
图1。肝损伤诱导Lgr5gydF4y2Ba+gydF4y2Ba双潜能肝祖细胞gydF4y2Ba
a - bgydF4y2Ba，gydF4y2BaLgr5-LacZgydF4y2Ba小鼠腹腔注射玉米油(n=6)gydF4y2Ba(一)gydF4y2Ba或单剂量玉米油CCl4 (1ml/kg) (n=6)gydF4y2Ba(b)gydF4y2Ba．6天后处死小鼠，采集肝脏进行β-gal染色。gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba，未受损肝脏不表达gydF4y2BaLgr5-LacZ。gydF4y2Ba bgydF4y2Ba ，gydF4y2Ba在CCl4上，强gydF4y2BaLgr5-LacZgydF4y2Ba在导管附近的小细胞中检测到表达。比较Lgr5-LacZgydF4y2Ba+gydF4y2Ba细胞(箭头)与相邻的肝细胞(星号，*)。比例尺:200 μm(上面板)和30 μm(下面板)。gydF4y2BacgydF4y2Ba，gydF4y2BaLgr5-ires-CreERT2gydF4y2Ba将小鼠与gydF4y2BaRosa26R-LacZgydF4y2BaCre报告小鼠。后代接受CCl4单次IP注射，2天后用他莫西芬(3mg/只小鼠)诱导CreERT2活性。典型图片显示lgr5细胞在CCl4损伤时的谱系追踪(n=8)。比较LacZ之间的大小差异gydF4y2Ba+gydF4y2Ba他莫昔芬诱导后第2天和第4天的细胞(箭头)和肝细胞(星号，*)。每天的放大倍数都是一样的。比例尺:500 μm(上面板)和50 μm(下面板)。gydF4y2BadgydF4y2Ba，gydF4y2BaLgr5-ires-CreERT2gydF4y2BaxgydF4y2BaRosa26-LacZgydF4y2Ba用DDC喂养后代(n=3)， 4、6天后按方案用他莫西芬诱导CreERT2活性。显示阳性肝细胞的代表性图片(gydF4y2BadgydF4y2Ba’)和阳性导管细胞(gydF4y2BadgydF4y2Ba”)。三,它莫西芬。比例尺，200 μm (gydF4y2BadgydF4y2Ba)， 25 μm (gydF4y2BadgydF4y2Ba’)和50 μm (gydF4y2BadgydF4y2Ba”)。gydF4y2Ba
图2gydF4y2Ba
图2。gydF4y2Ba在体外gydF4y2Ba从成人肝组织中扩增单个Lgr5细胞gydF4y2Ba
得了,gydF4y2Ba Lgr5-LacZgydF4y2Ba小鼠分别注射玉米油或CCl4 (IP)，如图1所示。6天后，将肝组织分离成单细胞，加载荧光CMFDG β-半乳糖苷酶底物，并通过流式细胞仪进行分析。分离的Lgr5-LacZ+细胞按1- 1的比例培养gydF4y2BaLgr5-LacZgydF4y2Ba+gydF4y2Ba阳性细胞/孔(克隆)如补充方法所述。gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba，表示所使用的协议。gydF4y2BabgydF4y2Ba，来自CCl4处理(CCl4+)和未处理(无CCl4)肝脏的分离单细胞的代表性FACS图。按细胞大小(FSC vs SSC)和PI排除顺序选择细胞进行门控。可行的CMFDGgydF4y2Ba+gydF4y2BaπgydF4y2Ba−gydF4y2Ba选择细胞并进行排序。如图所示为代表单元。gydF4y2BacgydF4y2Ba，显示单个生长的连续DIC图像gydF4y2BaLgr5-LacZgydF4y2Ba+gydF4y2Ba细胞。原始放大倍数:40倍(0-5天)，20倍(7-11天)，10倍(19天)和4倍(1个月后)。P通道。gydF4y2Ba
图3gydF4y2Ba
图3。单细胞来源的肝类器官获得肝细胞命运并显示肝细胞功能gydF4y2Ba体外。gydF4y2Ba
-ⅰgydF4y2Ba克隆lgr5衍生培养物在扩增培养基(EM)中培养，转移到分化培养基(DM)中培养8-14天，然后进行分析。分析了两个独立的克隆培养物。gydF4y2Ba模拟gydF4y2Ba，肝细胞特异性标志物的共聚焦图像(z-堆栈投影)。gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba、HNF4α(红色)、白蛋白(ALB)(绿色)和EpCAM(灰色)。gydF4y2BabgydF4y2Ba， MRP4(绿色)。gydF4y2BacgydF4y2Ba， ZO-1(洋红色)。gydF4y2BadgydF4y2Ba、ALB(红色)KRT19(品红)和肝细胞表面标记物OC2-2F8(绿色，补充图8中OC2-2F8标记物的完整描述)。gydF4y2Bae-f,gydF4y2Ba在EM培养物中使用Dil-ac-LDL荧光底物(红色)分析LDL摄取(gydF4y2BaegydF4y2Ba)或DM (gydF4y2BafgydF4y2Ba) 14天。只有DM培养物吸收了底物(红色)。用DRAQ5反染细胞核。比例尺，50 μm。gydF4y2BaggydF4y2Ba，在EM或DM中培养10天的类器官中，通过PAS染色测定糖原积累。图示为PAS弱阳性或强阳性细胞百分比。结果显示为10个EM或10个DM独立类器官的10个独立切片的平均值±SEM。gydF4y2BahgydF4y2Ba，在EM、DM保存8天(DM-8d)或DM保存13天(DM-13d)的24小时克隆培养物上清液中测定白蛋白(Alb.)的分泌。结果以每细胞白蛋白pg表示。gydF4y2Ba我,gydF4y2Ba在DM中培养13天，测定Cyp3a活性。结果以每毫升每百万细胞的RLU表示。gydF4y2Ba设定hgydF4y2Ba分别以MEFs、肝细胞(Hep.)和HepG2细胞为阴性和阳性对照。对每种条件进行三次重复分析。结果以3个独立实验的均值±SEM表示。* * *, p < 0.0001。gydF4y2Ba
图4gydF4y2Ba
图4。克隆肝类器官移植后的肝细胞岛gydF4y2Ba华氏温标gydF4y2Ba−−/gydF4y2Ba突变小鼠gydF4y2Ba
在EM下扩增3个独立克隆的单细胞肝类器官，并在移植前分化9天gydF4y2Ba华氏温标gydF4y2Ba−−/gydF4y2Ba/ Rag2gydF4y2Ba−−/gydF4y2Ba/ Il2RγgydF4y2Ba−−/gydF4y2Ba（gydF4y2Ba德意志联邦共和国gydF4y2Ba老鼠)。克隆I (n=8)，克隆II (n=6)，克隆III (n=5)。gydF4y2Ba一个,gydF4y2Ba显示移植方案的方案。gydF4y2Ba罪犯,gydF4y2Ba肝实质内代表性阳性移植物。gydF4y2BabgydF4y2Ba,华氏温标gydF4y2Ba+gydF4y2Ba区(克隆III)。移植细胞Krt19阴性(gydF4y2Bac,gydF4y2Ba导管标记物)，HNF4α阳性(gydF4y2Bad,gydF4y2Ba肝细胞标记)。比例尺，400μm (gydF4y2BabgydF4y2Ba)和100μm (gydF4y2BabgydF4y2Ba”- - -gydF4y2BadgydF4y2Ba）.gydF4y2Bae,gydF4y2Ba移植物阳性的移植小鼠(棕色曲线，移植物+，n=5)、无移植物证据的移植小鼠(蓝色曲线，移植物-，n=9)和未移植对照小鼠(黑色曲线，未移植)的Kaplan-Meier生存曲线。, n = 4)。图示以线性尺度显示累计生存期。Kaplan-Meier生存分析比较两组的总生存率。对数秩检验用于比较生存差异。*， log-rank=0.02 (graft+gydF4y2BavsgydF4y2BaGraft -)， log-rank= 0.007 (Graft +gydF4y2BavsgydF4y2Ba不透明)。gydF4y2Ba
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