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． 2013 8月14日;14(2):195-206。
doi: 10.1016 / j.chom.2013.07.012。

有核梭杆菌通过其FadA粘连蛋白调节E-cadherin/β-catenin信号通路促进结直肠癌的发生

玛拉罗克珊娜鲁宾斯坦＃1， 晓伟王＃1， 温迪刘2， Yujun郝3.4， 闺房蔡5， 韩艺萍W126
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有核梭杆菌通过其FadA粘连蛋白调节E-cadherin/β-catenin信号通路促进结直肠癌的发生

玛拉罗克珊娜鲁宾斯坦et al。 细胞宿主微生物． ．
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摘要

有核梭杆菌(Fusobacterium nucleatum, Fn)与结直肠癌(colorectal cancer, CRC)有关，但其因果关系和潜在机制尚不清楚。我们证明Fn通过其独特的FadA粘连蛋白粘附、侵入并诱导致癌和炎症反应来刺激CRC细胞的生长。FadA与E-cadherin结合，激活β-catenin信号通路，差异调节炎症和致癌反应。E-cadherin上的fada结合位点被映射到一个11-氨基酸区域。来自e -钙粘蛋白区域的合成肽可以消除fada诱导的CRC细胞生长和致癌和炎症反应。腺瘤和腺癌患者结肠组织中的fadA基因水平比正常人高>10-100倍。结直肠癌中FadA表达升高与癌基因和炎症基因表达升高相关。本研究揭示了Fn驱动CRC的机制，并确定FadA作为CRC的潜在诊断和治疗靶点。

数据

图1
图1所示。FnFadA通过e -钙粘蛋白刺激人结肠癌细胞增殖
A.野生型Fn（Fn)及fadA-配合USF81 (fadA +)刺激人CRC细胞HCT116, DLD1, SW480和HT29的增殖，与未处理的细胞或与之孵育的细胞相比大肠杆菌．US1 (fadA −)只能微弱地刺激它们的生长。FnUSF81和US1对CRC细胞RKO的生长均有微弱的刺激作用，对非CRC细胞HEK293无明显刺激作用。B.纯化的FadAc以剂量依赖的方式刺激HCT116细胞的生长，而mFadA则没有。FadAc和mFadA均不刺激RKO细胞生长。C.抑制Fn-通过抑制e -钙粘蛋白刺激细胞生长。FnHCT116的生长被CDH1特异性siRNA、GST- ec5融合蛋白和抑制肽(IP)抑制，而非特异性siRNA、GST或控制肽(CP)不抑制。D。Fn刺激了CDH1转染的RKO细胞的生长，但对模拟转染的RKO细胞没有影响。GST- ec5和抑制肽抑制了cdh1转染的RKO细胞的生长，而GST和对照肽均无抑制作用。结果以均数±标准差表示。＊＊＊p< 0.001。参见图S1。
图2
图2。E-cadherin是FadA受体
A. e -钙粘蛋白(CDH1)结构示意图。E-cadherin有5个细胞外cadherin (ECs)重复序列，从n端开始编号为EC1-5。TM，跨膜结构域;C，细胞质畴。B. E-cadherin在上皮细胞HEK293和大多数CRC细胞中表达。Western blot检测HEK293和人结直肠癌细胞株HCT116、RKO、HT29、SW480和DLD1的E-cadherin表达。阴性对照为人脐静脉内皮细胞(HUVEC)。内源性GAPDH被用作负荷控制。C. e -钙粘蛋白与FadAc共免疫沉淀。表达E-cadherin的HEK293细胞裂解液与大肠杆菌然后用小鼠抗cdh1单克隆抗体(mAb)孵育，并用琼脂糖A/G珠捕获。Western blot检测珠状洗脱液中的E-cadherin和FadA。D. FadA与EC5结合。纯化的GST或GST融合蛋白携带EC1-3, EC4或EC5孵育大肠杆菌表达FadAc的裂解液，然后用GST树脂捕获。将洗脱后的成分进行SDS-PAGE，然后进行孔马氏蓝染色(上)和Western blot (WB)，使用anti-FadA mAb 5G11-3G8(下)。参见图S2。
图3
图3。Fn粘附并侵入表达e -钙粘蛋白的CRC细胞
一个。Fn通过FadA和E-cadherin粘附并侵入表达E-cadherin的HCT116。的fadA-缺失突变体US1 (fadA −)与野生型相比，在附着和入侵方面存在缺陷Fn和fadA-互补克隆USF81 (fadA +)．转染siRNA抑制E-cadherin表达(siCDH1)可以减少附着和侵袭，而非特异性siRNA (siNS)则没有。b .野生型FnUS1和USF81在不表达e -cadherin的RKO细胞的附着和侵袭方面存在缺陷。全长CDH1转染RKO增强了野生型的附着和侵袭Fn及USF81 (fadA +)，但US1 (fadA −)．C.网格蛋白抑制剂Pitstop2抑制Fn及USF81 (fadA +)侵入HCT116，而不影响它们的附着。D.野生型Fn在HCT116中刺激NF-kappaB和促炎细胞因子IL-6、8和18的表达，这被网格蛋白抑制剂抑制。未处理HCT116的表达水平为“1”。对于A、B和D，附着和入侵水平以相对于初始接种量从宿主细胞中回收的细菌百分比表示。野生型Fn，这些水平反映了每孔(96孔板)从附着试验中回收约9000 CFU，从入侵试验中回收约2000 CFU。入侵程度大肠杆菌DH5a注入HCT116的浓度<0.01%，即每口井回收率< 20 CFU(数据未显示)。对于C，将未受抑制的原始附着(4.4±0.8%)和侵入(1.3±0.1%)水平指定为“100%”，并显示相对抑制值。结果以均数±标准差表示。＊＊＊p< 0.001。参见图S3。
图4
图4。鉴定合成肽抑制FnHCT116细胞的粘附和侵袭
A. EC5结构域部分氨基酸序列。区域和相应的肽(pep)显示在序列上方。抑制肽(IP，见下图)对应的序列下划线。肽4为所有研究的对照肽(CP)。B.纯化的GST-EC5融合蛋白抑制野生型FnHCT116以剂量依赖的方式附着和侵入。C。FnHCT116细胞的粘附和侵袭被EC5结构域3区(pep 3)对应的合成肽抑制，而不是1、2和4区对应的肽。D.从3区N端和c端连续缺失的合成寡肽的抑制作用Fn依恋和入侵。去除3个n端残基和1个c端残基不影响抑制功能。11-aa肽(ASANWTIQYND)被发现是抑制该病毒所需的最小序列Fn依恋和入侵。所有的值都是相对于那些没有抑制的值表示的，这些值被指定为“100%”。B组的实际附着和侵袭水平分别为6.3±1.4%和1.6±0.1%，c组的实际附着和侵袭水平分别为5.9±0.7%和1.4±0.1%。结果以平均值±标准差表示。＊＊＊p< 0.001。
图5
图5。FadAc激活e -cadherin介导的细胞信号
A. FadAc，而不是mFadA，与HCT116的膜结合，并伴随着膜上E-cadherin的磷酸化;E-cadherin和FadA内化，β-catenin磷酸化减少，β-catenin在胞浆中积累;β-catenin的易位和转录因子淋巴样增强因子(LEF)/ t细胞因子(TCF)、NF kappaB、癌基因Myc和Cyclin D1的激活;均经Western blot检测。蛋白酪氨酸激酶(PTK)抑制剂Genistein抑制fadac激活的所有功能。HCT116 β-catenin未检测到基因激活−−/尽管FadA和E-cadherin结合和内化。网格蛋白抑制剂Pitstop2可阻止E-cadherin和FadA的内化和NF kappaB的激活，但不影响β-catenin的核易位或LEF/TCF、Myc或Cyclin D1的表达。表皮生长因子受体(EGFR)、甘油醛3-磷酸脱氢酶(GAPDH)和增殖细胞核抗原(PCNA)分别被用作膜、细胞质和细胞核的负载对照，并用于检查亚细胞组分之间的交叉污染。抵扣。qPCR检测，FadAc激活野生型或β-catenin敲除HCT116细胞孵育2小时后Wnt信号基因7a、7b、9a (B)、致癌基因Myc和Cyclin D1 (C)、格网蛋白(cltb)和蛋白酪氨酸激酶基因(ptk6)、NF-kappaB和促炎细胞因子IL-6、8和18 (E)的表达，而mFadA或BSA则不激活。siRNA抑制β-catenin可抑制所有基因的表达，而网格蛋白抑制剂可抑制炎症基因的表达。未处理HCT116的表达水平为“1”。F.野生型Fn（Fn)，但US1 (fadA −)，共聚焦显微镜观察，诱导β-catenin在2hrs孵育后核易位。β-catenin用Alex 634染色(红色)，细胞核用4′，6-二氨基氨基-2-苯基吲哚(DAPI)染色(蓝色)。合并图像中的紫色表示β-catenin转位进入细胞核。G.用TOPFlash(被β-catenin激活)或FOPFlash(对β-catenin激活不敏感)转染HCT116后荧光素酶报告基因的表达。Fn与转染细胞在MOI为1000:1的条件下孵育2小时，然后测定荧光素酶活性。用FOPFlash得到的值指定为“1”，用TOPFlash得到的值表示为折叠变化。数据以两个独立实验的平均折叠变化±SD表示，每个实验重复三次。＊＊＊p< 0.001。
图6
图6。FadA促进e -cadherin介导的CRC肿瘤生长和促炎细胞因子在异种移植小鼠中的诱导
雌性裸鼠皮下双侧注射HCT116或RKO，随机分为每组5只接受治疗。得了。FadAc刺激HCT116而不刺激RKO异种移植物生长。纯化的FadAc、mFadA或BSA单独注射到HCT116的异种移植体中(A)，或与抑制肽(IP)或对照肽(CP)一起注射(B)，或单独注射RKO (C)。单独将IP注射到HCT116中作为阴性对照(B)。D. a和B中的代表性肿瘤显示。蛋白质注射的第一天被定为“第一天”。所有肿瘤在第一天看起来都一样。注意在第21天，FadAc和FadAc+CP治疗的肿瘤与当天的其他肿瘤相比，肿瘤的大小有所增加。E.野生型感染异种移植物的免疫组化染色Fn（Fn)，单独和与抑制或控制肽，和fadA-缺失突变体US1 (fadA −)使用兔子反Fn多克隆抗体。对照为感染野生型的异种移植物Fn用前血清染色，异种移植物感染大肠杆菌DH5α抗染色Fn抗体(数据未显示)。f .野生型Fn诱导NF-kappaB和促炎细胞因子IL-6、8和18的表达;Wnt 7a, 7b, 9a;qPCR检测HCT116异种移植中Myc和Cyclin D1的表达。IP对诱导有抑制作用，CP无抑制作用。大肠杆菌只有弱诱导IL-6。结果以均数±标准差表示。＊＊＊p< 0.001。参见图S4。
图7
图7。量化的fadAFadA、Wnt7b和NFkB2在健康、癌前腺瘤和癌中的表达
从以下5组全层结肠标本中提取DNA和RNA:(1)正常对照组(N;n = 14);(2)癌前腺瘤患者正常组织[N(ade);n = 16);(3)癌前腺瘤;n = 16);(4)肿瘤患者正常组织[N(crc);n = 19];(5)癌症(crc;n = 19)。 Gene copy numbers offadA(A)用DNA测定，用标准曲线测定。FadA mRNA水平Fn被归一化为Fn16 rRNA (B)、Wnt7b (C)和NFkb2 (D) mRNA水平均归一化至内源性GAPDH。取第1组(N)的平均值为“1”，其他组的折数变化通过与第1组的比较来确定。a中的横条表示中值。对于B-D，方框表示25/75百分位数，方框内的线表示中位数。胡须表示10/90百分位数。＊p< 0.05, * *p<0.01和***p< 0.001。
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评论

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