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。 2014年1月6日,9 (1):e84651。
doi: 10.1371 / journal.pone.0084651。 eCollection 2014。

肠道牙龈myofibroblasts支持肠上皮干细胞的生长

南叶蕾1, Ziyad Jabaji2, Jiafang王3, Vaidehi年代Joshi4, 加勒特J布林克利3, 哈桑·哈利勒2, 蜂巢王上演5, 阿图尔Jaroszewicz6, 马特奥Pellegrini6, Linheng李7, 迈克尔•刘易斯8, 马提亚Stelzner9, James C Y邓恩1, 马丁·G·马丁3
从属关系
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肠道牙龈myofibroblasts支持肠上皮干细胞的生长

南叶蕾et al。 《公共科学图书馆•综合》。 。
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文摘

肠上皮干细胞(isc)最近强烈的研究的重点。目前的体外模型依靠补充与Wnt兴奋剂R-spondin1支持强劲增长,ISC自我更新和分化。肠道牙龈myofibroblasts (ISEMFs)是重要的支持细胞内ISC利基。我们推测,ISEMF培养提高isc体外的生长,并允许他们成功的体内植入和移植。ISC-containing小肠隐窝、FACS-sorted单一isc ISEMFs是从C57BL / 6小鼠获得的。隐窝和单isc种植体外肠状的,在ISEMFs的存在与否。ISEMFs增强肠道上皮细胞在体外的生长在一个proximity-dependent时尚,与培养引起肠状的比单一栽培。共培养的isc支持ISEMFs放弃外生的要求R-spondin1维持长期增长和isc的分化。Mono -和培养在同系的小鼠植入皮下。培养与ISEMFs证明是成功所必需的体内移植肠状的扩散; implants without ISEMFs did not survive. ISEMF whole transcriptome sequencing and qPCR demonstrated high expression of specific R-spondins, well-described Wnt agonists that supports ISC growth. Specific non-supportive ISEMF populations had reduced expression of R-spondins. The addition of ISEMFs in intestinal epithelial culture therefore recapitulates a critical element of the intestinal stem cell niche and allows for its experimental interrogation and biodesign-driven manipulation.

利益冲突声明

利益冲突:作者宣称没有利益冲突存在。

数据

图1
图1所示。对肠道牙龈myofibroblasts (ISEMFs)。
孤立ISEMFs通过immunofluorescent染色和逆转录酶qPCR表征。(A)的细胞被染色α-smooth肌肉肌动蛋白(α-SMA Acta2)、波形蛋白(Vim)和肌间线蛋白(Des)。(B)逆转录酶qPCR进行ISEMFs mRNA溶解产物使用相同的标记和规范化,小肠(n = 4)。200µm比例尺表示。
图2
图2。肠状的形成效率从隐窝在体外有和没有ISEMFs增长。
肠状的形成效率测定与ISEMFs mono -和培养,有或没有外生Rspo1媒体(n = 3)。星号表示指定的组之间p < 0.05。
图3
图3。上皮特征后在体外文化没有ISEMFs,亲密接触。
隐窝和没有ISEMFs生长在培养基中含有Rspo1和评估经过7天的文化。(A)的平均面积的肠状的共培养测定并与单作(n = 5)。(B) eGFP DNA qPCR被用作测量总上皮的扩张,规范化的程度在单一文化的扩张(n = 7)。(C) mRNA的表达和分化上皮标记Lgr5就被qPCR和规范化评估整个小肠(n = 3)。(D, E)代表的肠状的显微图没有ISEMFs (D)和ISEMFs在第七天(E)被抓获。100µm比例尺表示。星号表示相比p < 0.05没有ISEMF。
图4
图4。上皮特征后在体外文化没有ISEMFs, trans-well膜隔开。
隐窝和没有ISEMFs生长在培养基中含有Rspo1和评估经过7天的文化。(一)平均肠状的面积测量半透膜上的培养,有或没有ISEMFs在它下方0.8毫米(n = 5)。(B) eGFP基因与qPCR量化衡量上皮生长(n = 7)。(C) mRNA的表达和分化上皮标记Lgr5就被qPCR和规范化评估整个小肠(n = 3)。(D, E)代表的肠状的显微图没有ISEMFs (D)和ISEMFs (E)低于膜在第七天被捕。100µm比例尺表示。星号表示相比p < 0.05没有ISEMF。
图5
图5。上皮生长后在体外文化和媒体没有ISEMF条件(CM)。
包含Rspo1隐窝是生长在文化媒体,有或没有ISEMF厘米,和评估后7天的文化。(A)平均面积与ISEMF厘米肠状的增长相比,没有条件媒体(n = 4)。(B, C)代表的显微图肠状的种植过程中没有使用CM (B)和(B) ISEMF厘米。酒吧规模µm代表100人。星号表示相比p < 0.05没有一厘米。
图6
图6。组织学的在体外培养7天后ISEMFs之上。
(一)苏木精和伊红())。(B-G)免疫组织化学染色(B)α-SMA, (C)钙(D)尾型同源框2 (Cdx2), (E)溶菌酶,(F) synaptophysin, (G)周期性acid-Schiff (PAS)。酒吧代表50µm规模。
图7
图7。组织学的培养植入在活的有机体内28天。
(A))。(B)免疫组织化学染色(B)α-SMA, (C)钙(D) Cdx2, (E)溶菌酶,(F) synaptophysin, (G)不是。酒吧代表50µm规模。
图8
图8。在体外文化和在活的有机体内组织学肠状的来自单一分类干细胞。
(A)的总横截面积肠状的每口井的测量量化干细胞的生长有或没有ISEMFs (n = 2)。(B)时间流逝的图像增长到第14天。(氟)免疫组织化学染色单ISC-derived肠状的和ISEMFs植入在活的有机体内。(C))、(D)α-SMA Cdx2 (E)和(F)不是。比例尺表示100年B和50µmµm在C f .星号表示相比p < 0.05没有ISEMF。
图9
图9。RNA转录组测序的支持和不支持ISEMFs。
RPKM值的对数转换(A)的所有基因,(B)基因编码的蛋白质分泌,分泌和(C)基因编码蛋白质之间的Wnt通路分析支持和不支持ISEMFs。(D)选择Wnt通路的基因编码的蛋白质分泌与至少两个不同RPKM支持与不支持ISEMFs。
图10
图10。支持与不支持ISEMFs。
(一)Rspo1 Rspo2 mRNA表达是衡量qPCR ISEMFs中支持或不支持地穴增长没有外生Rspo1 (n = 3)。(B)肠状的形成效率测定培养与支持或不支持ISEMFs,有或没有外生Rspo2培养基。星号表示相比p < 0.05支持ISEMF表示组之间的(A)和(B)。
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