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临床试验
． 2014年5月,44(5):1467 - 79。
doi: 10.1002 / eji.201344063。 2014年2月20日。

Follistatin-like protein 1增强单核细胞和巨噬细胞中NLRP3炎性体介导的IL-1β的分泌

尤里·查1， 于福， 安东尼Marinov， 布鲁斯人质， 魏严， 布莱恩Campfield， 约翰·A·凯勒姆， 丹尼尔·布什内尔， 渔洞王， 杰瑞Vockley， 拉斐尔赫希
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临床试验

Follistatin-like protein 1增强单核细胞和巨噬细胞中NLRP3炎性体介导的IL-1β的分泌

尤里·查et al。 免疫l． 2014年5月．
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摘要

Follistatin-like protein 1 (FSTL-1)在一些以IL-1β升高为特征的炎症条件下过表达。我们发现，在细菌性败血症患者中，FSTL-1血清浓度增加了3倍，而在LPS给药后，FSTL-1血清浓度增加了4倍。为了检测FSTL-1对IL-1β分泌的贡献，我们分别给小白鼠和FSTL-1缺陷小鼠注射LPS。LPS诱导WT小鼠血清中IL-1β的表达，而fstl -1缺陷小鼠血清中IL-1β含量较低或未检测到。单核/巨噬细胞是IL-1β的关键来源，不正常表达FSTL-1。然而，小鼠脚垫注射LPS后，在组织巨噬细胞中发现了FSTL-1，说明巨噬细胞能够在炎症部位吸收FSTL-1。体外，细胞内FSTL-1定位于线粒体。FSTL-1激活线粒体电子传递链，增加ATP(一个节点样受体家族的关键激活因子，pyrin结构域含有3 (NLRP3)炎症小体)和IL-1β的分泌。FSTL-1还增强了NLRP3和原aspase 1基因的转录，这是NLRP3炎症小体的两个组成部分。腺病毒介导的小鼠足部FSTL-1过表达激活炎症小体复合体，局部分泌IL-1β和IL-1β相关的促炎细胞因子。 These results suggest that FSTL-1 may act on the NLRP3 inflammasome to promote IL-1β secretion from monocytes/macrophages.

关键词:细胞因子;Follistatin-like protein 1;Inflammasome;巨噬细胞;单核细胞。

利益冲突陈述书

利益冲突:

匹兹堡大学已经将a . Marinov和R. Hirsch列为发明人，提交了一份使用FSTL-1作为疾病靶点的专利申请。

数据

图1
图1。FSTL-1参与体内炎症反应的调节
(A) DBA/1小鼠腹腔注射LPS 50µg，采用FSTL-1 ELISA法检测血清。结果用平均值+扫描电镜表示，每组n=4只小鼠，代表三次实验。*p < 0.05 vs PBS, Mann-Whitney检验。(B) DBA/1小鼠后脚垫注射2.5µg LPS，治疗后第3天安乐死。用QRT-PCR法检测足组织中FSTL-1的RNA。图中显示了与对照组相比mRNA水平的翻倍变化。结果用平均值+扫描电镜表示，每组n=4只小鼠，代表三次实验。*p < 0.01与对照组比较，Mann-Whitney检验。(C)健康志愿者和脓毒症患者的血清样本采用ELISA法检测FSTL-1。每个圆代表一个单独的主题。Mann-Whitney检验有统计学意义。(D)基因敲除策略示意图。 (E) Wild type (WT) and FSTL-1 null (KO) mice were injected i.p. with 200 µg of LPS for 3 h and sera were analyzed by ELISA. Each circle represents an individual mouse. The data shown are from one representative experiment of two performed. *IL-1β level was below the 150 pg/mL detection limit. IL-1β in the sera of unstimulated mice was below the level of detection (data not shown). Statistical significance determined by Mann-Whitney test.
图2
图2。FSTL-1在BMDM和小鼠爪子中的免疫定位
(A)小鼠BMDM与AF488-FSTL-1或af488卵白蛋白(绿色)孵育7小时，有或没有LPS。核(蓝色)与Hoechst共染。(B)小鼠后脚垫注射2.5µg LPS，治疗后第3天安乐死。将对照组和lps注射小鼠的爪子冷冻切片(4µm)进行免疫组化。Anti-FSTL-1(绿色);anti-CD11b(红色);双标记细胞(黄色)用箭头表示。用赫斯特荧光(蓝色)显示细胞核。(A, B)用63×油浸物镜对载玻片成像。比例尺10µm。 The data shown are from one representative experiment of three performed.
图3
图3。FSTL-1促进单核细胞和巨噬细胞分泌IL-1β
(A)稳定转染FSTL-1质粒或对照质粒的人U937细胞用LPS (200 ng/mL)处理或用PMA (0.5 mM)分化为U937-MΦ。(B) FSTL-1转染的小鼠巨噬细胞RAW264.7细胞被1µg/mL LPS刺激24 h。(C) U937单核细胞被FSTL-1蛋白或卵白蛋白转染。PMA (10 ng/mL)和LPS (200 ng/mL)刺激细胞。(D)转染FSTL-1蛋白(或卵清蛋白)的BMDM用LPS (1 ng/mL)刺激6小时，最后加入ATP (0.5 mM) 30分钟。ELISA法检测人(A, C)或小鼠(B, D) IL-1β上清。(A, B, C, D)结果表示为代表三次实验的三次重复样品的平均值+扫描电镜。*与对照组相比P <0.05，双尾学生检验。
图4
图4。FSTL-1定位于线粒体，增加线粒体呼吸复合体活性和ATP合成，诱导IL-1β分泌
(A)小鼠BMDM转染AF488-FSTL-1或af488卵白蛋白(绿色)，孵育7 h。(B)细胞用PFA固定，Triton X100通透，并用af488标记的蛋白染色。(A, B)用63×油浸物镜对载玻片成像。线粒体(红色)和细胞核(蓝色)分别用Mitotracker red和Hoechst 33342共染。FSTL-1和线粒体的共定位用黄色表示(合并)。比例尺10µm。所显示的数据来自一个代表性的三个实验。(C) ST2敲除(KD)细胞线粒体提取物中复合物I和III酶活性降低:凝胶内测定法(上图)，分光光度法(下图)。(D)转染人FSTL-1质粒或对照质粒的完整U937细胞的ATP水平。(E)转染FSTL-1蛋白的U937细胞ATP水平。卵白蛋白作为对照蛋白。 (F) PMA-differentiated U937 transfectants were pre-treated with rotenone (Rot) for 2 h and incubated for an additional 24 h with or without LPS. Supernatants were assayed for IL-1β by ELISA. (C, D, E, F) The results are expressed as the mean+SEM of triplicate samples from one experiment representative of three performed. *P<0.05 versus the controls, **P<0.05 versus cells without rotenone treatment, two-tailed Student’s test.
图5
图5。FSTL-1促进单核细胞和巨噬细胞中caspase-1的激活
稳定转染FSTL1质粒或对照质粒的人U937细胞用LPS (200 ng/mL)处理或用PMA (0.5 mM)分化为U937-MΦ细胞。fstl1转染的小鼠巨噬细胞RAW264.7细胞分别被1µg/mL LPS刺激。在6小时后收集细胞，进行caspase-1 Western blot分析(A, B)或caspase-1活性测定(C, D)。(A, B)所示数据来自三个实验中的一个代表性实验。(C, D)结果表示为代表三次实验的三份重复样本的平均值+ SD， *P<0.05与对照细胞，双尾学生检验。
图6
图6。FSTL-1增加单核细胞和巨噬细胞NLRP3炎症小体的表达
按照图例到图5所示的方式刺激细胞，在6小时收集细胞，处理NLRP3炎症小体成分的实时PCR (A, B)或Western blot分析(C, D)。(A, B)结果表示为代表三次实验的三份重复样本的平均值+扫描电镜，*P<0.05与对照细胞，双尾学生检验。(C, D)所显示的数据来自三个进行的一个代表性实验。
图7
图7。FSTL-1促进小鼠足部IL-1β、MCP-1、IL-6的分泌，增加NLRP3炎性小体成分的表达
用Ad-mFSTL-1或对照病毒Ad-BglII注射健康雄性DBA/1小鼠的爪子。第8天处死小鼠。(A)用相应的ELISA法检测Paw匀浆中IL-1β、MCP-1和IL-6的含量。(B)从脚爪中分离总RNA，用real - time PCR分析基因表达。特定基因的表达水平归一化为18S rRNA。(A, B)结果以平均值+SEM表示，n=4只小鼠/组，代表两次实验。*p < 0.05与对照组比较，Mann-Whitney检验。(C) Western blotting法检测pro-caspase-1、cleaved caspase-1 (p20)、NLRP3和FSTL-1的总蛋白。所显示的数据来自两个执行的一个代表性实验。
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