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． 2014年7月14日;5:4436。
doi: 10.1038 / ncomms5436。

PKM2调节Warburg效应，促进脓毒症中HMGB1的释放

Liangchun杨1， 敏谢1， 明华杨1， 严于1， 山朱1， 温侯2， 瑞康2， 迈克尔·T·洛兹2， 蒂莫西·R·比利亚2， Haichao王3.， 荔枝曹1， 道林唐2
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PKM2调节Warburg效应，促进脓毒症中HMGB1的释放

Liangchun杨et al。 Nat Commun． ．
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摘要

越来越多的证据表明代谢重编程在先天炎症反应的调节中起着重要作用，但其潜在机制尚不清楚。在这里，我们提供证据支持丙酮酸激酶M2 (PKM2)介导的Warburg效应，即有氧糖酵解，在调节高迁移率组盒1 (HMGB1)释放中的新作用。PKM2与缺氧诱导因子1α (HIF1α)相互作用，激活巨噬细胞需氧糖酵解酶依赖的hif -1α的转录。PKM2、HIF1α和糖酵解相关基因的敲除均可降低乳酸产量和HMGB1的释放。同样，一种潜在的PKM2抑制剂紫草素可以降低血清乳酸和HMGB1水平，保护小鼠免于致命的内毒素血症和败血症。总的来说，这些发现揭示了通过调节HMGB1释放代谢控制炎症的新机制，并强调了靶向好氧糖酵解在脓毒症和其他炎症性疾病治疗中的重要性。

利益冲突陈述书

利益冲突

作者声明没有竞争的经济利益。

数据

图1
图1。糖酵解抑制剂2DG减弱激活巨噬细胞释放HMGB1
(a-c)小鼠RAW 264.7巨噬细胞系和原发性腹膜巨噬细胞用2DG预处理3小时，然后用脂多糖(LPS) (100 ng ml)刺激−1)，为期两至二十四小时。用海马生物科学细胞外通量分析仪(a)监测24小时的耗氧率(OCR，指示氧化磷酸化)和细胞外酸化率(ECAR，指示糖酵解)。用ELISA法测定细胞培养基中2小时分泌的IL-1β (b)和24小时分泌的HMGB1 (c)水平(n=3，均值±SEM， *)P方差分析< 0.05迷幻药测试)。(d) 2DG (2mm)抑制TNF-α (5ng ml)−1)和IFN-γ (10 ng ml−1)诱导的HMGB1在24小时释放(n=3，表示±SEM， *P方差分析< 0.05迷幻药测试)。(e) LPS (100ng/ml)处理RAW 264.7巨噬细胞2小时(含或不含2DG (2mm)) (n=3，为±SEM， *P方差分析< 0.05迷幻药测试)。(f) LPS处理后RAW264.7巨噬细胞中的HMGB1 mRNA (100 ng ml)−1)， TNF-α (5 ng ml−1)和IFN-γ (10 ng ml−1(n=3，表示±SEM， * .P方差分析< 0.05迷幻药测试)。AU=任意单位。
图2
图2。PKM2的上调促进了活化巨噬细胞的有氧糖酵解和HMGB1的释放
(a-d) RAW 264.7细胞转染或不转染指示shRNA 48小时，然后用LPS (100 ng ml)刺激−1)，为期六至二十四小时。指示蛋白(a)、mRNA (b)、ECAR (c)和HMGB1释放量(d)按方法测定(n=3，均值±SEM， *P方差分析< 0.05迷幻药测试)。AU=任意单位。(e)用紫草素(5µM)预处理RAW 264.7细胞3小时，然后用脂多糖(LPS) (100 ng ml)刺激−1)， TNF-α (5 ng ml−1)和IFN-γ (10 ng ml−1)，为期24小时。采用ELISA法测定HMGB1的释放(n=3，均值±SEM， *P方差分析< 0.05迷幻药测试)。(f, g)转染或不转染指示shRNA的骨髓巨噬细胞(BMMs) 48小时，然后用LPS (100 ng ml)刺激−1)， TNF-α (5 ng ml−1)和IFN-γ (10 ng ml−1)，为期24小时。测定PKM2 (f)和HMGB1释放(g) mRNA水平(n=3，均值±SEM， *)P方差分析< 0.05迷幻药测试)。AU=任意单位。
图3
图3。激活的巨噬细胞释放HMGB1需要pkm2介导的HIF1α激活
(a)用脂多糖(LPS) (100 ng ml)刺激RAW 264.7细胞(RAW)和骨髓巨噬细胞(BMMs)−1)，为期24小时。采用免疫沉淀法(IP)和免疫印迹法(IB)检测PKM2与HIF1α的相互作用。(b-f)用对照shRNA或PKM2 shRNA转染RAW 264.7细胞和BMMs 48小时，然后用LPS (100 ng ml)刺激−1)，为期六至二十四小时。用real - time PCR法检测指示基因(b-e)的mRNA水平(n=3，均值±SEM， *)P方差分析< 0.05迷幻药测试)。AU=任意单位。Western blot检测HIF1α蛋白水平(f)。(g-j) RAW 264.7细胞转染指示shRNA 48小时，然后用LPS (100 ng ml)刺激−1)，为期24小时。用实时荧光定量PCR法检测指示基因的mRNA水平。同时，采用ELISA法测定细胞外HMGB1水平(n=3，均值±SEM， *)P方差分析< 0.05迷幻药测试)。AU=任意单位。
图4
图4。乳酸是有氧糖酵解的产物，促进HMGB1的乙酰化和释放
(a)用指示的shRNA转染RAW 264.7细胞48小时，然后用脂多糖(LPS) (100 ng ml)刺激−1)，为期六至二十四小时。测定培养基中乳酸水平(n=3，±SEM， *)P经方差分析，shRNA组与对照组比较< 0.05迷幻药测试)。(b-c)用GRP81 shRNA和对照shRNA转染RAW 264.7细胞48小时，然后用乳酸(5mm)刺激6小时。测定GRP81表达(b)、细胞活力(c)和HMGB1释放量(c) (n=3，均值为±SEM， *P方差分析< 0.05迷幻药测试)。(d)用3-磷酸甘油酸(3PG, 2mm)、2-磷酸甘油酸(2PG, 2mm)、磷酸烯醇式丙酮酸(PEP, 2mm)刺激RAW 264.7细胞6小时，测定乳酸和HMGB1释放水平(n=3，均值±SEM， *)P方差分析与未治疗组比较< 0.05迷幻药测试)。(e)用乳酸(5mm)刺激RAW 264.7细胞6小时，测定乙酰化HMGB1的水平。(f) LPS (100 ng ml)刺激RAW 264.7细胞−1) 24小时，测定乙酰化HMGB1水平。(g) LPS (100 ng ml)刺激RAW 264.7细胞−1)，乳酸(5毫米)和PEP(2毫米)24小时。组蛋白去乙酰化酶(HDAC)活性测定(n=3，均值±SEM， *)P方差分析与未治疗组比较< 0.05迷幻药测试)。(h-j) RAW 264.7细胞被曲hostatin A (TSA)(2µM)和/或LPS (100 ng ml)刺激−1)，为期24小时。测定HDAC活性(h)、乙酰化HMGB1 (i)和HMGB1释放量(j) (n=3，均值±SEM， *P方差分析< 0.05迷幻药测试)。(k)用含或不含抗hmgb1中和抗体(2µg ml)的乳酸刺激RAW 264.7细胞(5mm, 6小时)−1)和TNF-α释放水平测定(n=3，均值±SEM， *P方差分析< 0.05迷幻药测试)。
图5
图5。一种潜在的PKM2抑制剂紫草素保护小鼠免受致命的内毒素血症和败血症
(a)小鼠(n=20组)−1)注射单剂量紫草素(8 mg kg)−1)， 30分钟后注射内毒素(LPS, 5 mg kg)−1(腹腔注射)，12、24小时后再用紫草素治疗。Kaplan-Meyer方法比较组间生存率差异(*，P< 0.05)。(b - e)在平行实验中，测量腹膜巨噬细胞中PKM2活性(b)和指定时间点的血清乳酸(c)、IL-1β (d)和HMGB1 (e)水平(n= 3-5只动物组)−1，取值为均值±SEM， *，P方差分析<0.05迷幻药测试)。(f)采用盲肠结扎穿刺(CLP)技术诱导小鼠腹腔内败血症(n=20组)−1)．反复给药紫草素(8 mg kg)−1)在CLP后24、48和72小时，与对照组相比，存活率显著增加(*，P<0.05)，采用Kaplan-Meyer检验。(g - i)同时，测量腹膜巨噬细胞中PKM2活性(g)和指定时间点的血清乳酸(h)和HMGB1水平(i) (n= 3-5只动物组)−1，取值为均值±SEM， *，P方差分析<0.05迷幻药测试)。
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参考文献

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