跳转到主页内容
访问键 NCBI主页 MyNCBI主页 主要内容 主导航
． 2014年11月12日;12:87。
doi: 10.1186 / s12915 - 014 - 0087 - z。

试剂和实验室污染会严重影响基于序列的微生物组分析

苏珊娜J索尔特1， 迈克尔·J·考克斯， 埃琳娜·M·图雷克， Szymon T Calus， 威廉·库克森， 米里亚姆·F·莫法特， 保罗特纳， 朱利安Parkhill， 尼古拉斯·J·罗曼， 艾伦·沃克
从属关系
免费PMC文章

试剂和实验室污染会严重影响基于序列的微生物组分析

苏珊娜J索尔特et al。 BMC医学杂志． ．
免费PMC文章

摘要

背景:近年来，由于广泛采用16S rRNA基因测序和宏基因组学等非培养分析技术，微生物群落的研究发生了革命性的变化。这些基于序列的方法的一个潜在混淆因素是DNA提取试剂盒和其他实验室试剂中存在污染。

结果:在这项研究中，我们证明了在常用的DNA提取试剂盒和其他实验室试剂中，污染DNA是普遍存在的，不同试剂盒和试剂盒批次之间的成分差异很大，并且这种污染严重影响从含有低微生物量的样品中获得的结果。污染既影响基于pcr的16S rRNA基因调查，也影响鸟枪宏基因组学。我们提供了一个广泛的潜在污染属的清单，以及如何减轻污染的影响的指导方针。

结论:这些结果表明，在应用基于序列的技术研究低生物量环境中存在的微生物群时应谨慎。强烈建议阴性对照样品同时测序。

数据

图1
图1
来自10倍稀释纯培养物和对照的16S rRNA基因测序分类分配的总结。未稀释的DNA提取液中含有大约108细胞和对照(图中标注“con”)为无模板pcr。在ICL, UB和WTSI实验室提取DNA，并进行40个PCR循环扩增。每一列代表一个样本;部分(一)而且(b)在不同的分类水平上描述相同的样本。一)的比例美国bongori序列以黑色显示。非的比例丰度沙门氏菌类别级别的读数由其他颜色表示。随着样品变得更稀，来自培养微生物的测序细菌扩增子的比例减少，污染物变得更加主要。b)占至少一个实验室结果>0.5%的属的丰度，不包括美国bongori．非配置文件沙门氏菌每个实验室/试剂盒批次内的读数是一致的，但在不同站点之间有所不同。
图2
图2
在稀释序列中存在的16S rRNA基因拷贝数 美国bongori 文化。以10倍稀释后的细菌DNA美国bongori培养物采用qPCR定量。虽然拷贝数最初随着稀释的增加而减少，但在四次稀释后趋于稳定，表明污染DNA的背景水平一致。误差条表示三次反应的标准偏差。红色折线表示45份16S rRNA基因的检出限。qPCR反应的无模板内部控制(蓝色所示)低于用于解释荧光值的周期阈值(即小于0)，表明污染不是来自qPCR试剂本身。
图3
图3
宏基因组数据摘要 美国bongori 10倍稀释系列(初始未稀释样品包含约10 8 细胞)，用四种不同的试剂盒提取。每一列代表一个样本。未提取DNA的超纯水样本也被测序(标记为“水”)。一)随着起始材料变得更加稀释，已排序读的比例映射到美国bongori所有试剂盒的参考基因组都减少，污染变得更加突出。b)非的概况沙门氏菌reads(按Family分组，只显示至少一个试剂盒中包含>1%的reads)在四个试剂盒中各不相同。
图4
图4
泰国鼻咽样品污染物含量综述。一)PCoA图显示与年龄相关的聚类;然而,b)提取工具的批次能更好地解释图案。c)当按年龄着色时，该图显示了从排序中排除污染物OTUs后初始聚类模式的损失。d)每个样品中归因于污染物OTUs的读数比例，表明前两个试剂盒污染最严重。e)所使用的每个试剂盒的污染物OTUs属级概况。
在PMC中查看此图像和版权信息

类似的文章

查看所有类似文章

引用的

参见所有“引用”文章

参考文献

    1. Kunin V, Engelbrektson A, Ochman H, Hugenholtz P.稀有生物圈中的皱纹:焦磷酸测序误差可能导致人为膨胀的多样性估计。环境科学。2010;12:18 - 123。doi: 10.1111 / j.1462-2920.2009.02051.x。-DOI-PubMed
    1. Fv W, Göbel UB, Stackebrandt E.环境样品中微生物多样性的测定:基于pcr的rRNA分析的缺陷。FEMS微生物学，1997;21:213-229。doi: 10.1111 / j.1574-6976.1997.tb00351.x。-DOI-PubMed
    1. Kulakov LA, McAlister MB, Ogden KL, Larkin MJ, O 'Hanlon JF。工业系统超纯水细菌污染分析。应用环境微生物学。2002;68:1548-1555doi: 10.1128 / aem.68.4.1548 - 1555.2002。-DOI-PMC-PubMed
    1. McAlister MB, Kulakov LA, O’hanlon JF, Larkin MJ, Ogden KL.从超纯水中分离的三种细菌的生存和营养需求。中国生物医学工程学报。2002;29:75-82。doi: 10.1038 / sj.jim.7000273。-DOI-PubMed
    1. Kéki Z, Grébner K, Bohus V, Márialigeti K, Tóth EM.特殊寡营养培养基在超纯水源细菌群落培养中的应用。微生物免疫学报。2013;60:345-357。doi: 10.1556 / AMicr.60.2013.3.9。-DOI-PubMed

物质