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。 2014;10 (12):2333 - 45。
doi: 10.4161 / 15548627.2014.984275。

HIF1A调节xenophagic退化粘附和侵袭性大肠杆菌(AIEC)

散打Mimouna1, 玛丽Bazin, Baharia Mograbi, Arlette Darfeuille-Michaud, 帕特里克·布雷斯特, 保罗·霍夫曼, 瓦莱丽Vouret-Craviari
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HIF1A调节xenophagic退化粘附和侵袭性大肠杆菌(AIEC)

散打Mimounaet al。 自噬。 2014年。
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文摘

缺氧诱导转录因子HIF1激活自噬,普遍异化的途径参与维持细胞内稳态。功能障碍在自噬和HIF1已经涉及到越来越多的人类疾病,包括炎症性肠病(IBD),如克罗恩病(CD)。粘附侵袭性大肠杆菌(AIEC)殖民回肠黏膜的CD患者和强烈促进胃肠道炎性疾病HIF-dependent反应的激活。在这里,我们的目标是描述在xenophagy HIF1的贡献,自噬的一个特殊形式,参与细胞内细菌的降解。我们的研究结果表明,内生HIF1A击倒AIEC生存增加肠道上皮细胞。我们证明增加存活率与戏剧性的损伤的自噬流量autolysosomal成熟的一步。此外,我们表明,AIEC仍在single-membrane LC3-II-positive囊泡,他们无法诱导ULK1的磷酸化。这些结果表明,在缺乏HIF1A, AIEC LC3-associated内被发现的时间。使用阻塞抗体TLR5 CEACAM6, 2知名AIEC-bound受体,我们表明受体下游信号调解ULK1磷酸化是必要的。最后,我们提供的证据表明,HIF1介导CEACAM6表达式,CEACAM6需要招募ULK1 bacteria-containing信号中心。 Collectively, these results identify a new function for HIF1 in AIEC-dedicated xenophagy, and suggest that coactivation of autophagy and HIF1A expression may be a potential new therapy to resolve AIEC infection in CD patients.

关键词:AIEC附着侵袭性大肠杆菌;AMPK活化蛋白激酶;ATG16L1, autophagy-related 16-like 1;ATG5 autophagy-related 5;BECN1 Beclin 1 autophagy-related;BNIP3L BCL2 /腺病毒E1B 19 kda蛋白质存在正交互;CD,克罗恩病;CEACAM6,癌胚antigen-related细胞粘附分子6(非特异性交叉反应抗原);CRTC1 / TORC1分子调控转录辅激活1;克罗恩病; EEA1, early endosome antigen 1; GFP, green fluorescent protein; HBSS, Hank's balanced salt solution; HIF1A, hypoxia inducible factor 1, α subunit (basic helix-loop-helix transcription factor); IBD, inflammatory bowel disease; IRGM, immunity-related GTPase family, M; LAP; LAP, LC3-associated phagocytosis; MAP1LC3-II (LC3-II), microtubule-associated protein 1 light chain 3-II; MOI, multiplicity of infection; SQSTM1/p62 (SQSTM1), sequestosome 1; TEM, transmission electron microscopy; TLR5, toll-like receptor 5; ULK1, unc-51 like autophagy activating kinase 1; VAV2, vav 2 guanine nucleotide exchange factor; autophagy; bacteria; hypoxia inducible factor.

数据

图1所示。
图1所示。
生存AIEC增加细胞中沉默HIF1A。(一个细菌的生存是衡量庆大霉素保护试验。感染后2 h莫伊(10),肠道上皮T84-ShCTR,上海HIF1A,上海SQSTM1和上海ATG5细胞被孵化与庆大霉素(100μg /毫升)1和5 h。细胞用PBS和细胞溶解PBS Triton x - 100年的1%。集落形成单位磅平皿上测定和AIEC生存在材料和方法部分表示为表示。数据代表4个独立的实验。*P< 0.05 T84-Sh相比CTR细胞。(B)代表T84-Sh的电子显微图CTR,T84-ShHIF1A,T84-ShATG5和T84-ShSQSTM1细胞感染AIEC LF82(10)的莫伊16 h庆大霉素的存在。箭头表示降解细菌的自溶酶体(1),健康的细菌在囊泡含有胞质材料(2)、免费健康的细菌胞质(3)和健康的细菌在single-membrane泡(4)。
图2。
图2。
抑制细胞自噬流量的沉默HIF1A。控制和HIF1A沉默T84细胞感染AIEC LF82 10 2 h的莫伊庆大霉素(100μg /毫升)添加4 h。细胞免疫印迹(处理一个),ultra-structural TEM分析(B)和免疫荧光(C)。(一个)分析了自噬流量与LC3-II抗体免疫印迹分析细胞感染6 h (2 + 4) AIEC LF82细菌(MOI 10)没有或E64d和抑肽素a ACTB被用作加载控制。从4个独立实验结果量化描述在材料与方法;T84-Sh未经治疗的价值CTR和上海HIF1A细胞样本然后设置为1,褶皱增加计算。*P< 0.05比未感染的条件。(B)代表T84-Sh的电子显微图CTR和T84-ShHIF1A细胞感染AIEC LF82(10)的莫伊16 h庆大霉素的存在。箭头表示降解细菌特点是细菌膜和普通圆形的损失(1),囊泡含有部分退化的粗面内质网(2),完整的健康的细菌(3)和完整的细胞质(4)。CSh)代表共焦显微镜检查GFP-LF82感染CTR和上海HIF1A细胞染色anti-LC3-II(红、自噬囊泡的标志)和anti-LAMP1(蓝色,成熟的溶酶体标记)抗体表明LF82 LC3-II-positive泡在细胞内细菌仍然无效HIF1A。量化了在材料和方法部分描述。结果显示三个独立的实验。*P< 0.05 T84-Sh相比CTR细胞在相同的条件。
图3。
图3。
通过囊泡LC3阳性和EEA1 AIEC过境。控制和HIF1A沉默T84细胞感染AIEC LF82-GFP细菌的莫伊10 2 h接着庆大霉素(100μg /毫升)添加4 h和细胞免疫荧光材料和所述方法进行处理。(一个GFP-LF82-infected Sh)代表共焦显微镜检查CTR和上海HIF1A细胞染色anti-LC3-II(红、自噬囊泡的标志)和anti-EEA1(早期内体的蓝色标记)抗体表明LF82 EEA1-positive囊泡内细菌不是保留两个细胞系。结果显示三个独立的实验。*P< 0.05 T84-Sh相比CTR细胞在相同的条件。(B)时间的colocalization LF82-GFP细菌在早期的内吞作用小泡。(完全平方)和控制HIF1A沉默(空方)细胞被感染2 h 10莫伊GFP-tagged LF82细菌和庆大霉素处理指定的时间了。感染后细胞被固定和染色和EEA1 LC3-II抗体。为每个条件30到50细菌数,以调查他们的定位。的数据是代表两个独立的实验。
图4。
图4。
Pangenomic微阵列分析HIF1A-induced xenophagic基因。(一个)基因微阵列分析揭示了低氧诱导因子和吞噬作用和溶酶体GSEA投影转录HIF1A的目标。控制和HIF1A使细胞感染AIEC LF82细菌4 h-period和提取的总RNA。样本然后cohybridized pangenomic微阵列。VAV2,CTSV,ATP6V1H和ATP6V1E表达下调表达被微阵列检测。杂交过程中进行复制。(B)量化选择基因的mRNA水平测量通过rt - pcr AIEC LF82-infected T84-ShCTR和上海HIF1A细胞。的抑制所有选定的基因mRNA水平确认。结果显示2代表独立重复实验。
图5。
图5。
HIF1A并不损害自噬。(一个)营养压力诱导自噬通过免疫印迹分析T84-Sh LC3-II抗体的细胞溶解产物CTR和T84-ShHIF1A孵化为0,哈佛商学院30和60分钟,然后细胞溶解和受到声波降解法。时间进程的分析表明,自噬流量功能在两个细胞系。的数据是代表三个独立的实验。(B)Mitophagy T84-Sh评估CTR和T84-ShHIF1A使用MitoTracker红色细胞。代表显微镜图像显示几乎没有在控制细胞线粒体在缺氧。相比之下,作为HIF1A-dependent预期反应,线粒体被MitoTracker红色染色HIF1A沉默在normoxia和缺氧细胞。
图6。
图6。
缺乏HIF1A有利于LC3-associated吞噬作用。(一个)控制和HIF1A沉默T84细胞感染AIEC LF82 MOI表示的10倍。细胞免疫印迹使用抗磷的处理或全部ULK1抗体。时间进程表明,细菌诱导ULK1 (Ser555)只在T84-Sh磷酸化CTR细胞。从3独立实验结果量化描述在材料与方法;信号对应于p-ULK / ULK规范化ACTB计算为每个条件。T84-Sh的值CTR感染4 h和细菌细胞样本设置为1和褶皱的变化进行了计算。*P< 0.05相比T84-Sh无毒性CTR细胞。(B)在感染细胞孵化与阻塞TLR5 (Pab-hTLR5)和CEACAM6(克隆9 a6)抗体或抗CEACAM6和反TLR5分别和进一步加工中描述(一个)。(C)控制,HIF1A沉默T84细胞或控制细胞preincubated反TLR5和反CEACAM6抗体阻断感染了AIEC LF82莫伊的10 2 h。细胞免疫荧光分析以分析处理的colocalization LF82-GFP ATG16L1和ULK1。的数据是代表两个独立的实验。*P< 0.05的数量相比noncolocalized LF82-GFP细菌。
图7。
图7。
假设机制诱导xenophagy AIEC-LF82细菌。绑定CEACAM6 LF82 1型菌毛,一种蛋白质的表达由HIF1A转录调节,提高了激活的TLR5 LF82鞭毛。激活受体参与招聘ATG16L1 ULK1信号中心,在那里ULK1 Ser555磷酸化。激活ULK1启动自噬机制,最终降解细胞内LF82细菌。相反,在HIF1A-depleted细胞,缺乏CEACAM6可能减少的能力TLR5被LF82激活和进一步招募ATG16L1 ULK1信号中心。因此,ULK1不是磷酸化,自噬过程不是诱导和细菌保持在LC3-positive时间。
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