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．gydF4y2Ba 2015年7月9日;523(7559):177-82。gydF4y2Ba
doi: 10.1038 / nature14581。gydF4y2Ba Epub 2015年6月24日gydF4y2Ba

Glypican-1识别癌症外泌体并检测早期胰腺癌gydF4y2Ba

索尼娅·A·梅洛gydF4y2Ba1gydF4y2Ba，gydF4y2Ba Linda B LueckegydF4y2Ba1gydF4y2Ba，gydF4y2Ba Christoph KahlertgydF4y2Ba1gydF4y2Ba，gydF4y2Ba Agustin F FernandezgydF4y2Ba2gydF4y2Ba，gydF4y2Ba 赛斯·T·盖蒙gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba 朱迪思凯gydF4y2Ba1gydF4y2Ba，gydF4y2Ba 瓦莱丽·勒布鲁gydF4y2Ba1gydF4y2Ba，gydF4y2Ba 伊丽莎白·A·米滕多夫gydF4y2Ba4gydF4y2Ba，gydF4y2Ba 于尔根·韦茨gydF4y2Ba5gydF4y2Ba，gydF4y2Ba Nuh RahbarigydF4y2Ba5gydF4y2Ba，gydF4y2Ba Christoph ReissfeldergydF4y2Ba5gydF4y2Ba，gydF4y2Ba 基督教PilarskygydF4y2Ba5gydF4y2Ba，gydF4y2Ba 马里奥·F·弗拉加gydF4y2Ba6gydF4y2Ba，gydF4y2Ba 大卫Piwnica-WormsgydF4y2Ba3.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba 拉KallurigydF4y2Ba1gydF4y2Ba
从属关系gydF4y2Ba
免费PMC文章gydF4y2Ba

Glypican-1识别癌症外泌体并检测早期胰腺癌gydF4y2Ba

索尼娅·A·梅洛gydF4y2Baet al。gydF4y2Ba 自然gydF4y2Ba．gydF4y2Ba ．gydF4y2Ba
免费PMC文章gydF4y2Ba

摘要gydF4y2Ba

外泌体是脂质双分子层封闭的细胞外囊泡，含有蛋白质和核酸。它们由所有细胞分泌并在血液中循环。目前缺乏对循环中癌细胞来源的外泌体的特异性检测和分离。利用质谱分析，我们鉴定出一种细胞表面蛋白聚糖，glypican-1 (GPC1)，专门富集在癌细胞来源的外泌体上。利用流式细胞术从癌症患者和小鼠血清中监测和分离GPC1(+)循环外泌体(crExos)。GPC1(+) crExos在胰腺癌患者血清中检测，具有绝对的特异性和敏感性，将健康受试者和良性胰腺疾病患者与胰腺癌早期和晚期患者区分开来。GPC1(+) crExos水平与肿瘤负担及术前和术后患者生存相关。来自自发性胰腺肿瘤患者和小鼠的GPC1(+) crExos携带特异性KRAS突变，尽管磁共振成像呈阴性信号，但仍能可靠地检测小鼠胰腺上皮内病变。GPC1(+) crExos可能作为一种潜在的非侵入性诊断和筛查工具来检测胰腺癌的早期阶段，以促进可能的治愈性手术治疗。gydF4y2Ba

利益冲突声明gydF4y2Ba

作者声明没有相互竞争的经济利益。gydF4y2Ba

数据gydF4y2Ba

扩展数据图1gydF4y2Ba
扩展数据图1。液隔离gydF4y2Ba
一个gydF4y2Ba通过NanoSight®分析NIH/3T3、MCF10A、HDF、MDA-MB-231和E10细胞培养上清液中的外泌体浓度和大小分布。尺寸模式:105纳米(nm;3个技术重复)。gydF4y2BabgydF4y2Ba， mda - mb -231衍生外泌体的透射电镜(TEM)显微照片。右上角的图片显示了一个数字放大的插图。gydF4y2BacgydF4y2BaCD9免疫金标记后mda - mb -231衍生外泌体的透射电镜照片。金颗粒被描绘成黑点。右上角的图片显示了一个数字放大的插图。gydF4y2BadgydF4y2BaE10、NIH/3T3、MDA-MB-231、MCF10A和HDF细胞培养上清中外泌体蛋白flotillin1和CD81的免疫印迹。gydF4y2BaegydF4y2BaRT-qPCR检测HMEL、HDF、HMLE、MCF7、MDA-MB-231、T3M4、Panc-1、MIA Paca2中GPC1 mRNA水平。结果以均数±标准差表示;N =3, 3个生物重复，每个重复3个技术重复。gydF4y2BafgydF4y2Ba， HMEL, HDF, HMLE, MCF7, MDA-MB-231, T3M4, Panc-1和MIA Paca2细胞裂解液中GPC1的免疫印迹(上图)。β-肌动蛋白作为负荷对照(下图)。gydF4y2BaggydF4y2Ba3种非致瘤细胞系(HDF, HMEL, HMLE)和5种致瘤细胞系(MCF7, MDA-MB-231, T3M4, Panc-1, MIA Paca2)培养上清的外泌体蛋白裂解液中GPC1的免疫印迹(上图)。采用flotillin1免疫印迹法作为负载对照(下图)。gydF4y2BahgydF4y2Ba，蔗糖梯度纯化MDA-MB-231和T3M4培养上清外泌体蛋白裂解液中flotillin1的免疫印迹。在列出的每个密度层中检测蛋白质含量。gydF4y2Ba
扩展数据图2gydF4y2Ba
扩展数据图2。NanoSight®人类血清样本分析gydF4y2Ba
一个gydF4y2Ba，肿瘤患者血清源性外泌体透射电镜(TEM)显微图。右上角的图片显示了一个数字放大的插图。gydF4y2BabgydF4y2Ba， CD9免疫金标记后癌症患者血清源性外泌体透射电镜照片。金颗粒被描绘成黑点。右上角的图片显示了一个数字放大的插图。gydF4y2BacgydF4y2Ba，采用蔗糖梯度纯化外泌体后，癌症患者血清外泌体蛋白裂解物flotillin1的免疫印迹。在列出的每个密度层中检测蛋白质含量。gydF4y2BadgydF4y2Ba， NanoSight®分析的外泌体浓度显示，每1毫升血清中来自健康供体(n=100)、乳腺癌患者(n=32)和胰腺导管腺癌患者(PDAC, n=190)的外泌体数量。方差分析，后hoc Tamhane TgydF4y2Ba2gydF4y2Ba， * p <0.05， **** p <0.0001;3个技术重复。gydF4y2BaegydF4y2Ba， NanoSight®分析显示，来自健康捐赠者(n=100)、乳腺癌患者(n=32)和胰腺导管腺癌患者(PDAC, n=190)的1毫升血清中外泌体的模态大小分布。方差分析，事后Tukey-Kramer检验，*** P<0.001;3个技术重复。gydF4y2BafgydF4y2Ba，用GPC1描述珠粒百分比的散点图gydF4y2Ba+gydF4y2Ba从乳腺癌患者血清中纯化的结合外泌体。患者被细分为三种亚型:Luminal A, Luminal B和三阴性乳腺癌。gydF4y2BaggydF4y2BaELISA检测健康供体(n=100)、良性胰腺疾病(BPD, n=26)、胰腺癌前体病变(PCPL, n=5)和胰腺导管腺癌(PDAC, n=190)患者血清CA 19-9浓度(U/mL)的散点图。发现队列，ANOVA，事后Tamhane T2 * P<0.05;* * * * P < 0.0001;3个技术重复。数据以均数±标准差表示。gydF4y2Ba
扩展数据图3gydF4y2Ba
扩展数据图3。肿瘤分期特异性分析gydF4y2Ba
一个,gydF4y2Ba图1f所示的受试者工作特征(ROC)曲线分析相关表。gydF4y2Bab-fgydF4y2Ba， GPC1百分比的ROC曲线分析gydF4y2Ba+gydF4y2Ba原位癌(CIS)或I期胰腺癌(n=5) (a)、IIa期胰腺癌(n=18) (b)、IIb期胰腺癌(n=117) (c)、III期胰腺癌(n=11) (d)和IV期胰腺癌(n=41) (e)患者的crExos(红线)、CA 19-9血清水平(蓝色散列线)、外泌体浓度(黑线)和外泌体大小(散列黑线)，与对照组(健康捐赠者(n=100)和良性胰腺疾病患者(n=26)，共计126例进行比较。gydF4y2BaggydF4y2Ba， ROC曲线分析相关表如图1h所示。AUC:曲线下面积，CI:置信区间。gydF4y2Ba
扩展数据图4gydF4y2Ba
扩展数据图4。纵向人体研究gydF4y2Ba
一个gydF4y2Ba，百分比珠粒与GPC1的散点图gydF4y2Ba+gydF4y2BacrExos在胰腺癌患者流式细胞术中的应用。根据转移性疾病(非转移性病变、淋巴结转移和远处转移)对患者进行分类。方差分析，事后Tukey-Kramer检验，* P<0.05;3个技术重复。gydF4y2BabgydF4y2Ba，在术前第一天和术后第7天，描述良性胰腺疾病(BPD) (n=4)、癌前病变(PCPL) (n=4)和胰腺导管腺癌(PDAC) (n=29)患者血清CA 19-9水平(U/ml)的散点图。成对的双尾学生gydF4y2BatgydF4y2Ba-test， ** P<0.01;3个技术重复。gydF4y2Bac - dgydF4y2Ba，在纵向队列(n=29)中，胰腺癌患者总体(c)和疾病特异性(d)生存的预后参数的多因素分析(Cox比例风险回归模型)。gydF4y2BaegydF4y2Ba，良性胰腺疾病(BPD, n=6)、胰腺导管腺癌(PDAC, n=56)和健康对照组(n=20)血清GPC1 (ng/ml)水平的ELISA散点图。方差分析，事后Tukey-Kramer检验，**** P<0.0001;3个技术重复。gydF4y2BafgydF4y2Ba，胰腺癌患者(n=56)与对照组(健康供体(n=20)和良性胰腺疾病患者(n=26)的循环GPC1蛋白的ROC曲线(红线)，共n=6)。AUC:曲线下面积，CI:置信区间。gydF4y2Ba
扩展数据图5gydF4y2Ba
扩展数据图5。PDAC GEMM纵向研究gydF4y2Ba
一个gydF4y2Ba，描述Ptf1a中胰腺癌自发发展和进展的示意图gydF4y2Bacre / +gydF4y2Ba; LSL-KrasgydF4y2BaG12D / +gydF4y2Ba; Tgfbr2gydF4y2BaL / LgydF4y2Ba(PKT)小鼠和胰腺H&E在指定时间点显示健康胰腺，PanIN病变和PDAC病变。比例尺:100 μm。gydF4y2BacgydF4y2Ba在4、5、6、7和8周龄时，用NanoSight®分析PKT小鼠(E:实验小鼠，红色)和对照小鼠(c:对照小鼠，蓝色)的血清中测定外泌体大小(b)和浓度(c)。方差分析，事后Tukey-Kramer检验，* P<0.05;3个技术重复。gydF4y2BadgydF4y2Ba，描述MRI测量的肿瘤体积随时间进展的图表，以及GPC1百分比珠gydF4y2Ba+gydF4y2Ba在单个PKT小鼠中结合crExos(蓝色:肿瘤体积，红色:% GPC1gydF4y2Ba+gydF4y2BacrExos)。gydF4y2BaegydF4y2Ba，百分比珠与GPC1gydF4y2Ba+gydF4y2BacrExos对对照小鼠(n=3)和天蓝素诱导的急性胰腺炎小鼠(n=4)珠的作用。双尾学生的gydF4y2BatgydF4y2Ba-test, ns:不显著;3个技术重复。gydF4y2BafgydF4y2Ba， GPC1百分比珠粒的ROC曲线结果gydF4y2Ba+gydF4y2Ba4、5、6和7周龄PKT小鼠(n=7)与对照组(包括年龄匹配的同窝健康对照组(n=6)和诱导急性胰腺炎小鼠(n=4)， n=10)的结合crExos，外泌体浓度和外泌体大小。数据以均数±标准差表示。gydF4y2Ba
扩展数据图6gydF4y2Ba
扩展数据图6。PDAC GEMM横断面研究gydF4y2Ba
一个gydF4y2Ba， 16日龄对照小鼠(左图)和PKT小鼠H&E染色胰腺的代表性显微照片，表现为PanIN病变(右图，包围)和无PanIN病变(中图)。比例尺:100 μm。gydF4y2BabgydF4y2Ba， qPCR分析致癌KRAS后的Ct值gydF4y2BaG12DgydF4y2Ba从44-48日龄PKT小鼠血清外泌体中分离出野生型KRAS和18S内对照RNA，使用FACS进行GPC1分离gydF4y2Ba+gydF4y2Ba珠结合外显物(红色)和GPC1gydF4y2Ba−gydF4y2Ba珠绑定外显(蓝色)。数据以均数±标准差表示。gydF4y2Ba
扩展数据图7gydF4y2Ba
扩展数据图7。用GPC1描述流式细胞术分析珠子的原始散点图gydF4y2Ba+gydF4y2Ba绑定液gydF4y2Ba
一个gydF4y2Ba，具有代表性的健康对照组血清珠上外泌体的流式细胞术分析散点图和直方图(左图仅为二抗;右侧面板为GPC1抗体和二抗)。gydF4y2BabgydF4y2Ba，代表性胰腺癌样本珠上血清外泌体的流式细胞术分析散点图和直方图(左图仅为二抗;右侧为GPC1抗体和二抗)。gydF4y2Ba
扩展数据图8gydF4y2Ba
扩展数据图8gydF4y2Ba
未修剪的西方墨迹gydF4y2Ba
图1gydF4y2Ba
图1。GPC1特异性存在于癌症外泌体上gydF4y2Ba
一个gydF4y2BaNIH/3T3(蓝色)、MCF 10A(红色)、HDF(绿色)、E10(黄色)和MDA-MB-231(紫色)细胞外泌体蛋白的维恩图。在MDA-MB-231细胞的外泌体中仅检测到48种蛋白质(n=3个蛋白质样本，技术重复)。gydF4y2BabgydF4y2Ba，透射电子显微镜(TEM;左图)和GPC1的免疫金TEM(右图)。右上:数字放大的插图(n=2个实验)。gydF4y2BacgydF4y2Ba，外泌体与珠粒结合表面GPC1的流式细胞仪检测实验图。gydF4y2BadgydF4y2Ba，珠结合外泌体透射电镜和GPC1免疫金标记(n=2个生物重复)。gydF4y2BaegydF4y2Ba，百分比珠与GPC1gydF4y2Ba+gydF4y2Ba来自癌细胞(红色)和非致瘤细胞(黑色)的外泌体。gydF4y2BafgydF4y2Ba，流式细胞仪分析百分比珠GPC1gydF4y2Ba+gydF4y2Ba来自指示细胞系的外泌体(n=2个生物重复)。阴性对照:仅二抗。gydF4y2Ba
图2gydF4y2Ba
图2。GPC1gydF4y2Ba+gydF4y2BacrExosomes来源于荷瘤小鼠体内的癌细胞gydF4y2Ba
一个gydF4y2Ba纵向采血:原位MDA-MB-231肿瘤裸鼠(n=4只)。gydF4y2BabgydF4y2Ba，含GPC1的珠粒百分比gydF4y2Ba+gydF4y2Ba从体循环中采集的外泌体(crExos)绘制了平均肿瘤体积(n=4只小鼠，每个样本采用GPC1技术三重复分析)。方差分析，后hoc Tamhane TgydF4y2Ba2gydF4y2Ba， ** p <0.01， *** p <0.001。数据以均数±标准差表示。gydF4y2BacgydF4y2Ba，肿瘤体积和珠粒百分比与GPC1的相关性gydF4y2Ba+gydF4y2BacrExos (Pearson相关检验)。gydF4y2BadgydF4y2BaNanoSight®对培养的MDA-MB-231 CD63-GFP细胞的外泌体进行分析。黑色:全部外泌体;格林:CD63-GFPgydF4y2Ba+gydF4y2Ba外泌体(n=3个技术重复)。gydF4y2BaegydF4y2Ba， NanoSight®分析了MDA-MB-231 CD63-GFP原位肿瘤小鼠的crExos。黑色:全部外泌体;格林:CD63-GFPgydF4y2Ba+gydF4y2Ba外泌体(n=3个技术重复)。gydF4y2BafgydF4y2Ba，流式细胞术分析体外培养的MDA-MB-231(左上)和MDA-MB-231 CD63-GFP(中上)细胞和MDA-MB-231 CD63-GFP原位肿瘤小鼠crExos(左下)的珠粒外泌体。CD63-GFP染色gydF4y2Ba+gydF4y2Ba(癌细胞来源)和CD63-GFPgydF4y2Ba−gydF4y2Ba(宿主衍生的)crExos for GPC1 (APCgydF4y2Ba+gydF4y2Ba，右下;N =3个生物重复和3个技术重复)。百分数正珠列出来。阴性对照:仅二抗(右上)。gydF4y2Ba
图3gydF4y2Ba
图3。GPC1gydF4y2Ba+gydF4y2BacrExos是胰腺癌的一种非侵入性生物标志物gydF4y2Ba
一个gydF4y2Ba，百分比珠与GPC1gydF4y2Ba+gydF4y2BacrExos在健康捐赠者(n=100)、乳腺癌患者(n=32)和PDAC患者(n=190;方差分析，后hoc Tamhane TgydF4y2Ba2gydF4y2Ba， **** p <0.0001)。gydF4y2BabgydF4y2Ba、47例肿瘤标本KRAS突变频率及代表性DNA测序图谱。gydF4y2BacgydF4y2Ba流式细胞术分离3例PDAC患者crExos的GPC1免疫金，透射电镜观察GPC1免疫金gydF4y2Ba+gydF4y2Ba(左栏)和GPC1gydF4y2Ba−gydF4y2Ba(右列)crExos (n= 3,3个技术重复)。gydF4y2BadgydF4y2Ba， Ct值为KRAS G12D/G12V, KRAS WT mRNA和18S rRNA在GPC1中的表达gydF4y2Ba+gydF4y2Ba(红色和蓝色)和GPC1gydF4y2Ba−gydF4y2Ba(黑色)crExos(流式细胞术分离后;N =2，各2个生物重复和3个技术重复)gydF4y2BaegydF4y2Ba，百分比珠与GPC1gydF4y2Ba+gydF4y2BacrExos，发现队列(健康捐赠者，n=100;良性胰腺疾病(BPD)患者，n=26;胰腺癌前体病变(PCPL)， n=5;PDAC患者，n=190;方差分析，后hoc Tamhane TgydF4y2Ba2gydF4y2Ba， ** p <0.01， **** p <0.0001;3个技术重复。gydF4y2BafgydF4y2Ba，发现队列的ROC曲线。gydF4y2BaggydF4y2Ba，百分比珠与GPC1gydF4y2Ba+gydF4y2BacrExos，验证队列(健康捐赠者，n=20;桶,n = 6;PDAC n = 56;方差分析，事后Tukey-Kramer检验，**** P<0.0001;3个技术重复)。gydF4y2BahgydF4y2Ba，验证队列的ROC曲线。数据以均数±标准差表示。gydF4y2Ba
图4gydF4y2Ba
图4。循环GPC1水平gydF4y2Ba+gydF4y2Ba外泌体提示胰腺癌切除术结果gydF4y2Ba
一个gydF4y2Ba术前(术前)和术后(第7天)纵向采血。gydF4y2BabgydF4y2Ba，百分比珠与GPC1gydF4y2Ba+gydF4y2Ba来自BPD (n=4)， PCPL (n=4)或PDAC (n=29)患者的crExos(配对双尾学生gydF4y2BatgydF4y2Ba-test， ** P<0.01， **** P<0.0001)。数据以均数±标准差表示。gydF4y2Bac - dgydF4y2Ba， Kaplan-Meier曲线(log-rank检验)显示GPC1患者的总生存率(c)和疾病特异性生存率(d)gydF4y2Ba+gydF4y2BacrExos下降≥中位数(蓝色)和GPC1gydF4y2Ba+gydF4y2Ba术后crExos下降<中位(绿色)下降。gydF4y2Bae-fgydF4y2Ba， Kaplan-Meier曲线(log-rank检验)显示切除后CA 19-9下降≥中位数(蓝色)和CA 19-9下降<中位数(绿色)患者的总生存率(e)和疾病特异性生存率(f)。gydF4y2Ba
图5gydF4y2Ba
图5。GPC1gydF4y2Ba+gydF4y2Ba循环外泌体预测GEMM中胰腺癌gydF4y2Ba
一个gydF4y2Ba对照组和PKT小鼠纵向采血:4周龄(n=6和n=7)， 5周龄(n=6和n=7)， 6周龄(n=6和n=6)， 7周龄(n=6和n=6)， 8周龄(n=2和n=3)。gydF4y2BabgydF4y2Ba，百分比珠与GPC1gydF4y2Ba+gydF4y2Ba来自PKT(红色)和对照(蓝色)小鼠的crExos;方差分析，事后Tukey-Kramer检验，**** P<0.0001;3个技术重复。gydF4y2BacgydF4y2Ba， MRI示肿瘤红圈。gydF4y2BadgydF4y2Ba，肿瘤体积和GPC1百分比gydF4y2Ba+gydF4y2BacrExos在指定年龄PKT小鼠中的作用(ANOVA, post hoc Tamhane TgydF4y2Ba2gydF4y2Ba)， * p <0.05， ** p <0.01， *** p <0.001**** p <0.0001;3个技术重复)gydF4y2BaegydF4y2Ba4周对照小鼠(n=6)和急性胰腺炎小鼠(n=4)与4周PKT小鼠(n=7)的ROC曲线分析。gydF4y2BafgydF4y2Ba横断面研究:采集16或20日龄对照小鼠(n=6)和PKT小鼠(n=7)的血液。gydF4y2BaggydF4y2Ba，百分比珠与GPC1gydF4y2Ba+gydF4y2BacrExos来自对照组和PKT(16 - 20日龄)小鼠(成对双尾学生小鼠)gydF4y2BatgydF4y2Ba以及,P < 0.0001;3个技术重复)。gydF4y2Ba设定hgydF4y2Ba，组织评分(h)或年龄(i)与珠粒百分比与GPC1的相关性gydF4y2Ba+gydF4y2BacrExos (Pearson相关检验)。gydF4y2BajgydF4y2Ba，磷酸化ERK的PanIN病变相对百分比和代表性染色。数据以均数±标准差表示。gydF4y2Ba
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