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． 2016年3月17日,11 (3):e0151824。
doi: 10.1371 / journal.pone.0151824。 eCollection 2016。

益生菌肠道菌群分离物通过糖基化异三聚体菌毛与树突状细胞相互作用

汉娜L P Tytgat123.， Nienke H van Teijlingen4， 鲁比·梅·A·苏兰5， 弗朗索瓦•P Douillard6， Pia Rasinkangas6， 马塞尔扰乱7， 贾斯特斯Reunanen6， Reetta Satokari6， 乔斯Vanderleyden1， 伊夫·F Dufrene3.， Teunis B H Geijtenbeek4， 威廉·M·德沃斯3.67， 莎拉Lebeer12
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益生菌肠道菌群分离物通过糖基化异三聚体菌毛与树突状细胞相互作用

汉娜L P Tytgatet al。 《公共科学图书馆•综合》． ．
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摘要

绘制微生物-宿主相互作用下的微生物分子图谱是了解微生物群如何保持黏膜内稳态的关键。这种细菌分子的一个关键家族是菌毛。菌毛是蛋白质质的细胞壁附属物，在粘附中有良好的文献记录，但在与宿主的免疫相互作用中作用尚不明确。革兰氏阳性菌毛通常通过sortase特异性裂解反应和分子内肽键的形成进行翻译后修饰。在这里，我们报道了糖基化作为一种有益菌群中sortase依赖菌毛翻译后修饰的新水平及其在免疫调节中的作用。我们重点研究了模型益生菌和有益人类肠道菌群分离的鼠李糖乳杆菌GG的SpaCBA菌毛。分子技术、纳米级机械和免疫方法的独特组合导致了甘露糖的鉴定和聚焦在SpaCBA菌毛上的残基。人类树突状细胞通过c型凝集素受体DC-SIGN来识别这些菌毛上的聚糖，DC-SIGN是一种关键的碳水化合物依赖性免疫裁剪模式识别受体。这种凝集素-糖的相互作用具有重要的功能作用，调节树突状细胞的细胞因子反应。这为细菌糖蛋白在宿主免疫调节中发挥的直接作用提供了见解。用甘露糖和焦点修饰模型益生菌和菌群的复杂异源三聚体菌毛对与人树突状细胞上宿主免疫凝集素受体DC-SIGN的功能相互作用具有重要意义。 Our findings shed light on the yet underappreciated role of glycoconjugates in bacteria-host interactions.

利益冲突陈述书

利益冲突:作者宣称不存在竞争利益。

数据

图1
图1所示。检测焦点和甘露糖残留l．喂食使用AFM的GG菌毛。
图1A和1C描述了黏附力，图1B和1D从两者的相互作用得到了缓冲液中破裂长度直方图(n = 1024)l．喂食GG野生型和焦点-和甘露糖结合凝集素探针(AAL和HHA)。在图1E和1F中，缺少柱体Δ的相互作用力数据spaCBA:: TcR有两个凝集素探针的突变体CMPG5357。插图显示有代表性的缩回力曲线。
图2
图2所示。免疫金标记显示SpaA共定位，并集中在SpaCBA菌毛。
免疫电镜双标记l．喂食GG细胞(A和B)和ΔspaCBA:: TcR突变体(CMPG5357) (C)与SpaA抗血清和焦点特异性Aleuria橘黄色的植物血凝素(AAL)。SpaA和AAL分别使用5 nm(白色箭头)和10 nm金颗粒(黑色箭头)进行检测。比例尺代表500纳米。原整体图片以A和B的插图形式显示。
图3
图3所示。SpaCBA菌毛与甘露糖和焦糖糖基化。
(A) SpaCBA菌毛被糖基化l．喂食GG细胞——细胞壁相关蛋白l．喂食GG野生型(1)，缺毛ΔspaCBA:: TcRCMPG5357, 2)和ΔwelE:: TcR用甘露糖凝集素和聚焦特异性凝集素(HHA和AAL resp.)检测毛毛过度暴露的突变体(CMPG5351, 3)。用SpaC抗血清(SpaC、黑色箭头和高分子量菌毛)检测菌毛含量。排除了Msp1糖蛋白的干扰(开箭头)。印迹法和凝胶法一式三份。(LK = Precision Plus Protein™万花筒™标准,Bio-Rad)(B)纯化菌毛糖基化-SDS-PAGE分离的菌毛(池A)用PAS糖蛋白酶和Sypro染色®来可视化它们的蛋白质含量。用SpaC抗血清(高分子量菌毛)检测Western印迹样品的菌毛含量。纯化的Msp1(开箭头)作为阳性对照。得到具有代表性的凝胶，实验采用三次重复。(LK = Precision Plus Protein™万花筒™标准,Bio-Rad)(C) SpaCBA菌毛结合甘露糖特异性凝集素-纯化的菌毛部分(PRM和菌毛池B)进行PAS糖化和Sypro®和银染色来可视化蛋白质含量。PAS上缺少75 kDa信号和凝集素印迹排除了Msp1干扰(见打开的箭头)。用SpaC抗血清(HMW:高分子量菌毛)和甘露糖特异性凝集素HHA和GNA检测Western blotting样品，分别观察样品的菌毛含量和甘露糖的存在。三次重复实验中的代表性凝胶和印迹。(LK = Precision Plus Protein™万花筒™标准,Bio-Rad)(D&E)甘露糖-和焦点特异性凝集素结合SpaCBA菌毛用ELISA法测定凝集素与板包菌毛的结合。涂有涂层缓冲液的孔作为阴性对照。甘露糖特异性HHA的阳性对照是甘露糖和Lewis X (Hippeastrum混合，D)和焦点特异性AAL (Aleuria橘黄色的E)凝集素，分别。误差条表示三次独立实验的标准差(配对t检验，p < 0.05)
图4
图4
糖化的SpaCBA菌毛l．喂食GG通过DC-SIGN与dc相互作用(A) DC-SIGN- fc专门与SpaCBA桩相互作用用ELISA法检测DC-SIGN与板包毛的结合。涂有涂层缓冲液和甘露聚糖(数据未显示)的孔分别作为阴性对照和阳性对照。DC-SIGN- fc分别预先暴露于TSM缓冲液、DC-SIGN特异性抗体(D1)、甘露聚糖(M)或EGTA，然后在涂有绒毛的孔上孵育。误差条表示三次独立实验的标准差(配对t检验，p < 0.05)。(B) Piliatedl．喂食GG株与Raji-DC-SIGN细胞系相互作用-未转染和表达DC-SIGN的Raji细胞与fitc标记的野生型孵育l．喂食GG,ΔspaCBA:: TcR和ΔwelE:: TcR．采用流式细胞术检测结合。采用DC-SIGN特异性抗体(D1)、Lewis X碳酸盐结构(LeX)和EGTA来检测DC-SIGN结合的特异性l．喂食GG变体。结合的表达相对于fitc标记的细菌与未转染的Raji细胞的结合。误差条表示三次独立实验的标准差(配对t检验，p < 0.05)。(C)纯化菌毛通过DC-SIGN -结合dc单核细胞衍生的树突状细胞(mocs)与包被小球孵育，用流式细胞术检测结合。使用DC-SIGN特异性抗体(D1)、Lewis X碳酸盐结构和EGTA评估DC-SIGN结合特异性。结合相对于珠粒与moDCs的未阻断结合(N = 3，配对t检验，p < 0.05)。(D)l．喂食GG与过度暴露的菌毛被DCs识别Δ的代表性FACS图welE:: TcR与与TSA缓冲液(无阻滞)、DC-SIGN特异性抗体(D1)、Lewis X碳酸盐结构(LeX)和EGTA预孵卵的modc结合。x轴:在FACS的FL1通道中测定的fitc标记细菌与moDCs的结合。在y轴上，向前散射。
图5
图5所示。纯化的菌毛诱导树突状细胞表达细胞因子。
用纯化菌毛(样品B)刺激单核细胞来源的dc 6小时后，用RT-PCR检测IL-6、IL-10、IL-12p40和IL-12p35 mRNA的表达。采用DC-SIGN特异性抗体(D1)评估DC-SIGN对细胞因子诱导的特异性。细胞因子表达值代表与菌毛孵育的moDCs的相对细胞因子表达(N = 4)。
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参考文献

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