条文本

下载PDF

巴雷特化生腺是无性系的,包含多个干细胞,并共享一个共同的鳞状祖细胞
  1. 安娜·M·尼科尔森12
  2. 特雷弗的格雷厄姆3.
  3. 阿什利·辛普森3.
  4. 亚当·汉弗莱斯2
  5. 尼古拉·伯奇4
  6. Manuel Rodriguez-Justo5
  7. 马可Novelli5
  8. 丽贝卡·哈里森4
  9. 尼古拉斯·赖特一个3.
  10. 斯图尔特·麦当劳2
  11. Janusz一个养家糊口124
  1. 1英国牛津大学肿瘤系
  2. 2消化疾病中心,巴茨暴雪研究所和伦敦玛丽女王大学伦敦医学院,伦敦,伦敦
  3. 3.组织病理学实验室,癌症研究,伦敦研究所,林肯客栈Fields,英国伦敦
  4. 4消化疾病中心莱斯特大学医院,莱斯特,英国
  5. 5英国伦敦大学学院组织病理学系
  1. 对应到Janusz A Jankowski教授,消化疾病中心,英国白教堂E1 2AT纽瓦克街4号,暴风雪细胞和分子科学研究所;j.a.jankowski在{}qmul.ac.uk斯图尔特·AC·麦克唐纳博士,消化疾病中心,暴雪细胞和分子科学研究所,英国白教堂E1 2AT纽瓦克街4号;s.a.mcdonald在{}qmul.ac.uk

摘要

背景对正常食管或巴雷特化生食管的干细胞组织知之甚少。作者利用非致病性线粒体DNA突变作为克隆标记,揭示了人类鳞状食管和巴雷特化生的干细胞组织,并确定了突变的克隆扩展机制。

方法用酶组织化学法检测细胞色素活性,鉴定突变细胞c氧化酶(CCO)。cco缺陷细胞被激光捕获,PCR测序证实突变。用免疫组化法鉴定细胞谱系。

结果正常的鳞状食管中含有cco缺陷斑块,大小从30 μm左右到1 mm左右不等。这些斑块是克隆的,因为在cco缺陷斑块中的每个区域都包含相同的线粒体DNA突变。在巴雷特化生中,部分缺乏cco的腺体表明腺体由多个干细胞维持。完全突变的巴雷特化生腺体包含所有预期分化的细胞谱系,显示巴雷特化生干细胞克隆群体的多谱系分化。观察到克隆突变的巴雷特化生腺体斑块,表明腺体可以分裂形成斑块。在一名患者中,再生的鳞状上皮和底层腺组织都有克隆突变,表明它们来自共同的祖细胞。

结论在正常的食管鳞状上皮中,单个干细胞克隆可以填充上皮的大片区域。巴雷特化生腺体是克隆单位,包含多个多能干细胞,最有可能通过裂变分裂。此外,单个细胞来源可产生鳞状上皮和腺上皮,提示食管可塑性。

  • 食管
  • 巴雷特的化生
  • 单克隆
  • 线粒体DNA
  • 干细胞
  • 巴雷特食管
  • 结直肠腺瘤
  • 数学建模
  • 巴雷特的癌
  • 微卫星不稳定
  • 致癌作用
  • 结肠肿瘤
  • 结肠息肉
  • 结肠直肠癌
  • 组织病理学
  • 胃肠道
  • 分子致癌作用
  • 胃腺癌
  • 上皮分化
  • 胃肠道病理
  • 胃癌

来自Altmetric.com的统计

请求的权限

如果您希望重用这篇文章的任何部分或全部,请使用下面的链接,它将带您访问版权清除中心的RightsLink服务。您将能够快速获得价格和以多种不同方式重用内容的即时许可。

本研究的意义

关于这个问题,我们已经知道了什么?

  • 通过对肠道上皮细胞罕见突变的鉴定,可以推断人类肠道生物学。

  • 具体地说,干细胞中罕见的体细胞改变的鉴定允许在人类中进行隐窝谱系追踪实验。

  • 已知巴雷特化生是寡克隆的,但引起这种异质性的确切机制尚不清楚。

新的发现是什么?

  • 巴雷特化生腺体的克隆性。

  • 巴雷特化生中存在多个干细胞。

  • 巴雷特氏化生和鳞状组织有一个共同的前体细胞。

在可预见的未来,它会对临床实践产生怎样的影响?

  • 巴雷特化生腺交替克隆斑块的鉴定意味着当前活检取样的有效性将被仔细检查。

  • 巴雷特化生中的多个干细胞的存在意味着可以寻求新的疗法来调节它们的作用。

  • 事实上,巴雷特化生和鳞状组织有一个共同的前身,这意味着治疗可以用来促进鳞状组织的生长。

简介

人的食道由一种非角化的、分层的鳞状上皮排列,其表面层被脱鳞并被一种尚未确定的干细胞所取代。1食管有由分泌腺泡的粘液组成的粘膜下腺泡,这些腺泡进入发育的导管,通向表面上皮。2近三分之二的导管内衬柱状上皮,远三分之一的导管内衬鳞状上皮。巴雷特氏化生是正常的鳞状上皮被柱状排列的,通常分泌粘液的上皮所取代。巴雷特化生与慢性胃食管反流有关3.并且是食道腺癌的主要危险因素,最近的数据显示转换率为每年0.2-0.4%。45

巴雷特氏化生干细胞尚未被鉴定,在体内巴雷特氏化生腺体内分化细胞类型的种群维持也未得到解决,这反过来又严重阻碍了我们对食道柱状细胞起源的理解。一些理论试图解释巴雷特化生的细胞起源:回流介导的居住鳞状干细胞的重编程,干细胞从胃贲门迁移,以重新填充受损的食管粘膜或粘膜下导管或腺体内的干细胞再生表面上皮。67最近的一项研究表明,巴雷特化生起源于鳞状柱状连接(SCJ)的细胞。8;在本研究中,p63基因敲除小鼠在鳞状前胃中出现巴雷特氏样化生,位于SCJ的car4表达细胞的逆行生长被认为是化生的起源,尽管没有进行谱系追踪。然而,对人类巴雷特化生的观察为化生的其他假设起源提供了依据。值得注意的是,酸抑制和其他有效的治疗导致巴雷特化生病变内和远离SCJ的明显正常的新鳞状上皮的再生。保尔森的基因分析9结果显示,19/20例患者的新鳞状上皮与周围的巴雷特化生不具有相同的突变,表明巴雷特化生中的干细胞来源与负责化生病变常规自我更新的干细胞群不同。Coad提供的证据表明,这种干细胞群可以位于食管导管或下层腺体内Who注意到15例新鳞状细胞岛与粘膜下腺和导管相关。2Leedham提供了导管可能是巴雷特化生来源的遗传证据10他发现了一个正常的鳞状管,其中包含了与相邻化生上皮相同的体细胞突变。

整个巴雷特化生的克隆进展已经通过一系列全活检的流动纯化分析和评估相关基因的突变谱进行了研究,包括CDKN2AP16),TP53.使用这些方法,可以克隆出一个完整的巴雷特片段,1112突变在上皮细胞中迅速扩散。然而,利德汉姆的研究10在一个隐窝一个隐窝的水平上显示,巴雷特的化生实际上是基因异质性的,包含许多明显独立的克隆。这两种观察结果之间的差异突出表明,我们对正常食管的克隆结构或单个巴雷特化生腺体的克隆结构或突变积累和扩散的机制知之甚少。

根据定义,干细胞可以在很长一段时间内保持它们的谱系,并产生它们所在组织的所有分化细胞类型。13这意味着,干细胞,而不是它们的后代,可能是唯一一种活得足够长、能够积累突变的细胞类型。虽然发育不良或肿瘤黏膜可能包含肿瘤抑制基因或癌基因的体细胞突变,但这些突变在正常组织中是罕见的。因此,为了研究正常和化生食管,我们使用了线粒体DNA (mtDNA)中自然发生的、非致病性的体细胞突变。mtDNA很容易发生突变,因为它的修复机制很差,没有保护组蛋白,并且处于高度氧化的环境中。14缺乏细胞色素c氧化酶(CCO)是一种线粒体编码酶,是呼吸链的一部分,通常与mtDNA突变有关。15我们的团队和同事之前的工作,观察胃肠道的其他区域,已经表明,cco缺乏的mtDNA突变细胞的数量随着年龄的增长而增加,很少在40岁以下的患者中发现,16这表明突变只会在长寿的干细胞中发生。17日克隆扩展可以通过发现具有相同mtDNA突变的相邻cco缺陷细胞或腺体的斑块来可视化。

本研究的目的是利用mtDNA突变作为克隆扩展的标记来研究Barrett化生中正常食管和腺体的干细胞结构。我们还提出了巴雷特氏腺是如何在上皮内扩散的,并在这种腺体内建立了细胞谱系的起源。此外,我们还研究了巴雷特化生的新鳞状岛和柱状上皮之间的关系。

材料和方法

病人

牛津大学约翰拉德克利夫医院(n=2)、伦敦大学学院医院(n=3)和莱斯特皇家医院(n=6)因腺癌或不典型增生而接受食管切除术或内镜黏膜切除术的患者纳入本研究(n=11)。组织来自化生或不典型增生区域以及形态正常的上皮。平均年龄为66.7岁(55-75岁)。所有的食管区域都由具有诊断Barrett食管经验的合格病理学家(NAW, MR-J和RH)进行组织学描述。

将组织标本的上皮表面向下冷冻在液氮冷却的异戊烷显微镜载玻片上(Sigma Aldrich, Poole, UK)。所有组织标本均按照英国内政部规定在多中心伦理批准下采集(07/Q1604/17)。

酶组织化学

冷冻切片按8 μm厚度进行常规分析,20 μm厚度进行激光捕获显微解剖。双CCO和琥珀酸脱氢酶(SDH,一种核编码的线粒体活性酶)组织化学进行了先前发表的。171820.简单地说,风干的切片在细胞色素中孵育c含100 mmol/l细胞色素的培养基c, 20 μg/ml过氧化氢酶和4 mmol/l四盐酸二氨基联苯胺在0.2 mol/l磷酸盐缓冲液中,pH 7.0,所有来源Sigma Aldrich,在37°C下最大50分钟。然后,切片在pH值为7.4的磷酸盐缓冲盐水(PBS)缓冲液中洗涤3×5分钟,然后在SDH培养基(130 mmol/l琥珀酸钠,200 mmol/l甲氧硫酸非那嗪,1 mmol/l叠氮化钠和1.5 mmol/l硝基蓝四唑,0.2 mol/l磷酸盐缓冲液,pH值为7.0)中孵育,在37℃下孵育45分钟,或直到出现强烈的蓝色染色。切片再次在PBS中洗涤3×5分钟,并在分级乙醇系列中脱水(70%,90%,100%,100%),在Histoclear (Lamb Laboratory Supplies, Eastbourne, UK)中清除,用Permount (Fisher Scientific, Fair-Lawn, New Jersey, USA)安装,并允许一夜干燥。在7/11例人类食道中发现了coco缺陷斑块。从这7名患者中的4名患者的DNA进行了筛选,并在每个患者中确定了mtDNA突变。

免疫组织化学

福尔马林固定石蜡包埋切片厚度为4 μm。通过降低酒精浓度对切片进行脱蜡和复水,并在3%甲醇/H中封闭内源性过氧化物酶2O2.切片在柠檬酸钠缓冲液(pH 6.0)中微波10分钟,室温冷却30分钟。

辣根过氧化物酶检测

切片用PBS (Invitrogen, Paisley, UK)中10%的兔血清阻塞10分钟,然后在室温下涂抹主抗体60分钟。所用抗体为:小鼠抗人CCO (Anti-Oxphos complex IV亚基I) (2.5 μg/ml;Invitrogen, UK),小鼠抗人嗜色粒素A (0.42 μg/ml;Dako, Ely, UK)、小鼠抗人muc2 (0.66 μg/μl, Novacasta, Milton Keynes, UK)、小鼠抗人Muc5AC (1.4 μg/μl, Novacasta, UK)和小鼠抗人细胞角蛋白7 (9.2 μg/ml, Dako, UK)。所有抗体用10%兔血清的PBS稀释,所有实验均采用阴性免疫球蛋白G匹配对照。切片在PBS中洗涤3×5分钟,然后与兔抗鼠二抗体结合生物素孵育40分钟。切片用链霉亲和素过氧化物酶孵育40分钟,在4 mmol/l二氨基联苯胺和0.2%过氧化氢中洗涤和显影。切片经酒精脱水,清除,DPX固定。

检测由immunoflouresence

切片在10%山羊血清中阻塞10分钟,然后在室温下涂抹主抗体60分钟。一抗为小鼠抗人CCO亚单位IV (2.5 μg/ml)和兔抗人Porin (8.55 μg/ml, Abcam, Cambridge, UK)。一抗用10%的山羊血清PBS稀释。切片在PBS中洗涤3×5分钟,然后与氟色素偶联的二抗孵育40分钟。第二抗体为山羊抗鼠555 (Alexafluro, Invitrogen, UK)和山羊抗兔488 (Alexafluro)。最后,将切片安装在hardset DAPI (Vector, UK)中。

从细胞中分离DNA

冷冻切片(20 μm厚)被切到紫外线照射过的P.A.L.M.膜载玻片上(P.A.L.M. Microlaser Biotechnologies, Bernried, Germany)。使用P.A.L.M.激光系统将细胞切成无菌的、经紫外线照射的、带胶粘帽的0.5 ml试管。对cco缺陷区和正常区进行激光捕获显微解剖,可以很容易地分辨出cco缺陷区和正常区细胞的颜色边界。在2000 rpm离心2分钟后,细胞在14 μl紫外线照射的裂解缓冲液(Picopure;Arcturus, California, USA)在65℃下过夜,然后在95℃变性10分钟。

单个食管上皮细胞mtDNA测序

在每个微解剖细胞中对整个线粒体基因组进行测序。如Greaves先前所述,使用一系列m13尾寡核苷酸引物对在重叠片段中对基因组进行pcr扩增17PCR产物在ABI Prism 3100基因分析仪(Applied Biosystems, Foster City, California, USA)上使用BigDye 3.1版终止子循环测序化学方法进行测序,并使用sequence ANALYSIS和SEQSCAPE软件(Applied Biosystems)与修订后的剑桥参考序列进行直接比较,如前所述。20.用正向引物和反向引物对样品进行测序,并重复至少两次。利用MITOMAP数据库(http://www.mitomap.org)报道的多态性并与远端CCO正常细胞进行基因型比较来识别多态性。从模板DNA样本中重复PCR和测序确认任何mtDNA突变。此外,在组织的多个不同区域观察到突变,这些区域都是独立测序的。

结果

分层的鳞状上皮和粘膜下食管腺体和导管包含形成克隆斑块的干细胞或祖细胞

对新鲜冷冻食管切除材料进行CCO/SDH酶组织化学处理,在每个被研究患者的鳞状上皮内均可见CCO/SDH缺陷细胞斑块(图1一个).在食管鳞状上皮中,cco缺陷斑块的大小不等,从大约3个细胞(30 μm)到直径约1 mm。激光从一块贴片上捕获cco缺陷细胞(图1B,左侧面板)表明斑块内的细胞含有一个共同的mtDNA突变,2421G→aMT-RNR2基因,该基因在邻近的野生型组织中不存在(图1B,右面板)表明该贴片是细胞的克隆增殖。

Cytochrome c oxidase (CCO)-deficient patches are seen in normal human oesophagus including submucosal oesophageal glands and ducts. (A) Patches of CCO-deficient cells exist in the normal squamous epithelium; a variation of staining is seen which is reflective of the intensity of mitochondria within the section (left panel) (×200). CCO-deficient patches spread from the base to the surface in the epithelium (middle panel) (×100). A CCO-deficient patch pre-laser capture microdissection (LCM) shows cells across the basal layers and covering associated papilli (right panel) (×200). (B) Post-LCM, samples from the CCO-deficient patch as well as areas of normal CCO activity were captured, and two samples (un-numbered) failed PCR (×200). Sequencing showed that CCO-normal cells contain wild-type mtDNA, whereas cells in the CCO-deficient patch contained a 2421G→A mutation within the MT-RNR2 gene. (C) CCO-deficient patches were seen within acini, patches were small and all oesophageal glands seen were partially deficient; a small tear is seen within the section (left panel) (×200). CCO-deficient patches were identified within the gland ducts and ducts were partially CCO-deficient (middle panel) (×200). CCO-deficient acini within a gland, shown here pre-LCM, form a small patch (right panel) (×200). (D) Post-LCM, samples from CCO-deficient areas were captured as well as from areas of normal CCO activity. One un-numbered sample failed PCR. Sequencing showed that CCO-normal cells contained wild-type mitochondrial DNA, whereas CCO-deficient cells all contain a 2635G→A mutation within the MT-RNR2 gene.
" data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图1
图1

细胞色素c氧化酶(CCO)缺乏斑块可见于正常人食管,包括食管粘膜下腺和导管。(A)正常鳞状上皮中存在斑块状的cco缺陷细胞;染色的变化反映了切片(左图)内线粒体的强度(×200)。cco缺陷斑块从基底向上皮表面扩散(中板)(×100)。cco缺陷斑块激光捕获前显微解剖(LCM)显示细胞跨越基底层并覆盖相关的乳头(右图)(×200)。(B) lcm后,从CCO缺陷斑块和正常CCO活性区域捕获样本,两个样本(未编号)PCR失败(×200)。测序结果显示,cco正常细胞含有野生型mtDNA,而cco缺失斑块的细胞含有2421G→a突变MT-RNR2基因。(C)腺泡内可见cco缺损斑块,斑块较小,食管腺腺均部分缺损;在部分(左面板)(×200)中可以看到一个小的撕裂。在腺管中发现了cco缺陷斑块,导管部分存在cco缺陷(中图)(×200)。图示lcm前的腺内cco缺陷腺泡,形成一个小斑块(右图)(×200)。(D) lcm后,从CCO缺乏区域和正常CCO活性区域捕获样本。一个没有编号的样本PCR失败。测序结果显示,cco正常细胞含有野生型线粒体DNA,而cco缺陷细胞均含有2635G→a突变MT-RNR2基因。

观察到的食管腺泡内也含有cco缺陷细胞;然而,这些特定的食道腺体是部分缺乏的,也含有一群cco正常细胞(图1C,左右面板).单个食管腺管中也可见cco正常细胞和cco缺陷细胞(图1C,中间面板).对缺陷腺泡进行激光捕获(图1D,左侧面板),并对mtDNA进行分析。该腺泡的缺陷细胞含有克隆突变,2635G→a在MT-RNR2基因,该基因在cco正常细胞中没有发现(图1D,右面板).这表明粘膜下腺体内的腺泡含有克隆单位,代表单个原始(干细胞)的增殖;由于所有腺体都发生了部分突变,它们可能含有多个干细胞。食管导管内也发现了cco缺陷细胞,但不包含与附近粘膜下腺体的克隆突变。

巴雷特化生腺是克隆单位,由多个干细胞维持

观察到完全缺乏钴的巴雷特化生腺体,从表面到基底均可见。中显示了两个单独的例子图2一个.从细胞表面用激光捕获细胞(图2 b,左面板)向底座(图2 b显示该腺体内的所有细胞都含有相同的mtDNA突变,7588G→a突变CCOII基因(图2 c).我们还观察到部分cco缺乏的Barrett化生(图2D,左右面板),表明巴雷特化生可以包含多个干细胞,分别产生cco正常和cco缺陷的细胞群。

图2

巴雷特化生腺可见全部和部分细胞色素c氧化酶(CCO)不足。(A) Barrett食管可见cco缺陷腺;缺陷细胞跨越从隐窝基部到管腔,如两个连续切片(左面板)所示(×100)。在Barrett化生的另一个切片中,完全缺乏的腺体表面的cco缺乏区域通过组织(中板)被移到第38切片上(×100)。连续切片(编号49)显示腺体基部(右图)有cco缺陷细胞的腺体(×100)。(B)激光捕获显微解剖(LCM)后的连续切片(编号36)。细胞从缺陷腺体内和正常CCO活性区域捕获(左图)(×200)。腺基lcm后的连续切片(编号48)。细胞从CCO缺乏的腺体和正常的CCO活性区域捕获(右图)(×200)。(C)测序显示cco正常细胞含有野生型线粒体DNA,而所有从基部到腺体表面的cco缺陷细胞包含7588G→a突变CCOII基因。(D)在巴雷特化生中可以看到部分突变的腺体,这表明巴雷特化生腺体由多个干细胞维持。

所有具有巴雷特氏化生腺的上皮细胞系都来自一个单一的干细胞

所有分化系均显示在单个cco缺乏的巴雷特化生腺体内。免疫组化显示缺乏CCO表达(CCO亚基-1)的腺体(图3A,左侧面板)含有表达嗜色粒蛋白A (图3B,中间面板) Muc5AC (图3B,右面板)表达凹泡细胞和Muc2表达杯状细胞(图3B,左侧面板).为H&E染色的一个连续切片的例子显示在图3一(中图)以及阴性同型对照(图3A,右面板).杯状细胞和小凹细胞同时存在于同一腺体,提示腺癌混合表型,一个相对常见的观察,在胃和肠道血统都存在。21CCO(亚基1)的双重免疫组化(图3 c(左图)和Porin(一种在线粒体膜上表达的蛋白质)证实CCO表达的缺失不是细胞内线粒体缺乏或不活跃的结果(图3C,中间面板).

图3

细胞色素c氧化酶(CCO)缺乏的巴雷特化生腺体包含所有完全分化的细胞类型和正常水平的活性线粒体。(A) Barrett化生中两个相邻的cco缺陷腺体(左图)(×100)。连续切片的H&E显示有缺陷的腺体(中图)(×200)。负同型控件显示在右边面板(×100)。(B) muc2染色的连续切片显示杯状细胞的存在(×400)。中间的面板显示色粒蛋白a染色的连续切片,显示高倍数插入(×600)的神经内分泌细胞(×400)的存在。右边的面板显示了一系列的mucc - 5ac染色切片,显示腺体内存在小凹细胞(×400)。(C)在不同的组织样本中,用Cy3(红色)荧光显示的CCO表达显示巴雷特化生中CCO缺乏的腺体(左图)。用Fitz(绿色)荧光显示的孔蛋白表达显示了含有正常活性线粒体的缺陷腺体(中图)和腺体的DAPI合并图像(右图)(×200)。

巴雷特氏化生包含大片的克隆相关腺体

3例患者出现邻近的cco缺陷腺体斑块(图4一):在这里,一个斑块被定义为至少两个相邻的缺乏cco的腺体。从一个小斑块(三个腺体)中的每个腺体进行激光捕获(图4B,左侧面板)和mtDNA测序结果显示,它们含有相同的mtDNA突变,9601T→C突变CCOIII基因,该基因在野生型腺体中未发现(图4B中、右面板),表明该斑块是克隆的。还观察到包含约10个缺乏cco的巴雷特化生腺体的大片斑块(图4C,左侧面板).在这个大斑块内的每个腺体都包含有相同mtDNA突变的细胞,内部是9715G→a突变CCOIII,同样在野生型腺体中未见(图4C,右面板),表明该贴片是克隆增殖。

图4

补丁的细胞色素c氧化酶(CCO)缺乏的巴雷特氏腺含有克隆突变。(A) Barrett化生内约6个cco缺陷腺体的小斑块(左图)(×200)。图中显示Barrett化生中约14个cco缺陷腺体的大斑块(×200)。图示激光捕获显微解剖(LCM)前的一小块cco缺陷巴雷特化生腺体(×200)。(B) lcm后,从所有CCO缺陷腺体和邻近的CCO正常腺体中捕获细胞。捕获两个样本(未编号PCR失败)。测序显示邻近斑块的cco正常细胞含有野生型线粒体DNA (mtDNA),而斑块内所有的cco缺陷腺体含有相同的9601T→C突变CCOIII基因。(C)一大片>10 cco缺陷腺体,伴有Barrett食管lcm前病变。lcm后,从cco缺陷腺体和邻近的cco正常腺体捕获细胞,并在PCR前消化DNA。测序显示邻近斑块的cco正常细胞含有野生型mtDNA,而斑块内所有的cco缺陷腺体含有相同的9715G→A突变CCOIII基因。

新鳞状岛的鳞状上皮和巴雷特化生的腺上皮有共同的细胞来源

一名接受消融治疗的病人的食道标本含有腺上皮,上面有一个新鳞状上皮岛(图5一个).该标本的连续切片显示腺组织和鳞状上皮中存在cco缺陷的区域(图5 b).Alcian blue PAS染色证实杯状细胞的存在(图5 c).从每个cco缺乏的区域显微解剖细胞样区域(图5 d).mtDNA的分析显示,在该切片的鳞状和腺状区域发生了相同的突变,在该切片中有一个6768G→a的突变CCOI基因(图5 d).因此,腺组织和上面的鳞状上皮来源于相同的前体细胞。细胞角蛋白7免疫组化在接近序列的切片上进行(图5 e),显示预期的下层腺体中CK7的高水平和鳞状上皮中的低表达。22

Squamous epithelium and underlying glandular epithelium share a clonal mutation suggesting that both cell types contain a common progenitor cell. (A) A sample of Barrett's metaplasia having undergone ablative therapy is stained using H&E. Squamous epithelium (dashed arrow) is seen overlying glandular epithelium (solid arrow) (×100). (B) A serial section stained for cytochrome c oxidase (CCO)/succinate dehydrogenase enzyme histochemistry (×200). CCO-deficient cells are seen with the squamous epithelium (dashed arrow) as well as in the underlying glandular epithelium (solid arrow). (C) Subsequent serial section stained for alcian blue PAS diastase to show presence of mucins from goblet cells (×100). (D) A serial section pre-laser capture microdissection (LCM) shows CCO-deficient cells in both glandular and overlying squamous epithelium (left panel). Post-LCM, cells from CCO-deficient areas as well as CCO normal glands and CCO normal epithelium are captured for analysis (middle panel) (×100). Sequencing shows CCO-normal cells from both glandular and normal squamous epithelium contain wild-type mitochondrial DNA whereas all CCO-deficient cells contain the same 6768G→A mutation within the CCOI gene. (E) Shows CK7 staining of a serial section using alkaline phosphatase substrate. Expression of the cytokeratin is weaker in the overlying squamous epithelium (dashed arrow) than within glands below (solid arrow) (×100). The middle panel shows a further section showing the difference between weak or absent CK7 expression in squamous and stronger in neighbouring glandular tissue (×200). Expression of CK7 in the underlying glandular tissue is shown in the right panel (×600).
" data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图5
图5

鳞状上皮和底层腺上皮共享克隆突变,提示这两种细胞类型包含一个共同的祖细胞。(A)经过消融治疗的Barrett化生样本用H&E染色。鳞状上皮(虚线箭头)覆盖腺上皮(实箭头)(×100)。(B)细胞色素染色的连续切片c氧化酶(CCO)/琥珀酸脱氢酶组织化学(×200)。cco缺陷细胞可见于鳞状上皮(虚线箭头)和下层腺上皮(实箭头)。(C)阿利新蓝PAS diastase染色后的连续切片显示杯状细胞中粘蛋白的存在(×100)。(D)连续切片预激光捕获显微解剖(LCM)显示腺上皮和上覆鳞状上皮中均有cco缺陷细胞(左图)。lcm后,从CCO缺陷区域以及CCO正常腺体和CCO正常上皮细胞中捕获细胞进行分析(中图)(×100)。测序显示,来自腺上皮和正常鳞状上皮的cco正常细胞都含有野生型线粒体DNA,而所有cco缺陷细胞都含有相同的6768G→A突变CCOI基因。(E)显示使用碱性磷酸酶底物的连续切片的CK7染色。细胞角蛋白在上覆鳞状上皮(虚线箭头)中的表达较下图(实箭头)中的表达弱(×100)。中间的部分显示了鳞状组织中CK7表达弱或不表达与邻近腺组织中表达强之间的差异(×200)。右图显示下层腺组织中CK7的表达(×600)。

讨论

我们的发现具有根本性的重要性。我们认为对我们的发现最好的解释是巴雷特化生腺体克隆种群.我们已经证明,单个巴雷特腺含有cco缺陷细胞的克隆群体(图2),其中包含巴雷特化生中的所有分化细胞系(图3),表明该腺体含有多功能干细胞。部分cco缺陷腺体的鉴定表明每个腺体中存在多个干细胞。我们认为这些部分突变的腺体正处于克隆的转换,因此cco缺陷克隆正在替换非突变细胞的过程中,就像我们在结肠隐窝中展示的一样。23根据这种观点,缺乏cco的腺体可能是由于利基继承在这种情况下,一个缺乏CCO活性的干细胞克隆能够取代所有其他的克隆,从而形成单克隆转化的腺体。这一过程之前在人类胃肠道中已经被描述过。171820.

当然,也有可能发生突变,即发生在承诺祖细胞水平上的mtDNA可能是导致腺体部分突变的原因。我们认为这是不可能的。在结肠中,已有研究表明,部分缺陷隐窝中的cco缺陷细胞具有同质突变:23线粒体有多个基因组,细胞有数百个线粒体;我们认为,在这种承诺前体的有限寿命内,通过公认的中性或随机漂移机制,突变不太可能在线粒体内变成克隆,然后在细胞内变成克隆。1424

然而,相邻的腺体可能不是来自同一个克隆体。这解释了之前的一个悖论,即:尽管研究显示在巴雷特化生过程中独特基因的扩张,为什么病变仍然保持基因异质性?1011此外,我们还显示了相邻鳞状组织和巴雷特氏组织之间共享的克隆关系,表明有共同的祖细胞。这再次为观察到Barrett化生中出现新鳞状上皮以及鳞状食管中Barrett化生岛的出现提供了一个令人信服的解释。

我们还发现巴雷特氏腺可以形成多个腺体的大型克隆斑块,这表明巴雷特氏化生腺可以分裂裂变.相邻腺体包含相同突变的几率以前被计算为2.48×109: 1、17所以这些斑块肯定代表了克隆增殖;腺裂变是克隆生长的可能机制。裂变已被确立为肠道内克隆扩散的典型机制。1720.对这些补丁产生的其他解释是自顶向下扩散,我们在非发育不良组织中没有看到证据,或者细胞在腺体之间的迁移,这可能无法解释连贯斑块的形成,在文献中也没有可信度。泰勒15和油渣17已经表明,cco缺陷隐窝的数量和平均斑块大小分别随着患者年龄的增长而增加,这表明裂变在肠道中以基础速率发生,尽管我们的数据不足以证明食道中的这一现象。

似乎参与巴雷特氏腺癌发展的突变克隆也通过腺体裂变进行克隆扩张。基因组DNA突变等基因TP53CDKN2A(P16)与没有突变的邻近腺体相比,可能使腺体具有生长优势。25一些突变克隆似乎生长速度很快,在几个月内扩散到整个化生病变12说明肿瘤基因突变的生长优势可能是相当大的。在此观察到的大型cco缺陷斑块的存在,为Reid组观察到的突变腺体的快速扩张提供了支持。12这一点有一个有趣的推论:由于巴雷特化生,即使是那些包含肿瘤前突变克隆,长度似乎也没有增加,那么腺体消失,无论是由于种群压力还是由于与那些具有选择性优势的腺体的积极竞争,将是这一过程的一个重要组成部分。由Leedham观察到克隆遗传异质性10可能是由许多不同的前腺的多轮裂变所造成的。值得注意的是,鉴于巴雷特病变中广泛生长的癌前克隆,我们不能忽视这里研究的非发育不良组织可能隐藏着潜在的致瘤突变。

考虑到mtDNA突变克隆相对于Barrett化生发展的时间是很有趣的:这很可能发生在大多数情况下化生腺体的形成。在结肠中建立一个完全缺乏cco的隐窝需要长达40年的时间,这很难判断需要多长时间。26巴雷特氏腺比结肠隐窝大,所以这个克隆稳定时间甚至可能更长。当然,虽然我们不知道这样的事件发生的频率有多高图5当mtDNA突变的双潜能祖细胞产生腺状上皮和鳞状上皮时,这种mtDNA突变的巴雷特腺有可能从这种细胞中重新衍生出来。

我们也考虑了组织学正常的食管鳞状上皮的克隆结构。其中,克隆mtDNA突变cco缺陷斑块从基底层延伸到管腔表面。鉴于鳞状上皮内的组织周转被认为在11天左右(J Jankowski,未发表的数据),mtDNA突变发生在短期,推定非干细胞,群体将迅速丢失到上皮。单势干细胞或祖细胞被认为位于基底层,127当细胞从这里迁移并最终脱落到腔内。

鳞状表皮在某些方面被认为类似于鳞状食道。在表皮上,克莱顿28克隆体的大小会随着时间的推移而增加。如果每个食管干细胞都负责维持特定数量的上皮细胞,那么在鳞状食管中发现大小不一的克隆斑块,提示干细胞池沿基底层发生了横向替换,并且在正常食管中发生了类似龛继承的过程。食管鳞状癌的发展涉及到几种肿瘤抑制基因的突变,包括TP53而且P16,而cyclin D1和EGFR则频繁扩增。2930.克隆细胞的港湾TP53在慢性食管炎患者中已经观察到突变,我们认为突变起源于祖细胞,并以我们在这里建议的方式传播。

以前曾有人提出在食管腺体或导管内存在干细胞群2我们对腺泡和腺管中存在的cco缺陷斑块的观察为这个有趣的概念增加了新的数据。在同一腺体或导管中存在cco缺陷细胞和cco正常细胞表明至少有两个相同结构的干细胞群。虽然我们无法在这些数据中确定这些结构之间的克隆突变,但先前的数据表明,存在于导管或腺体中的干细胞群能够产生柱状上皮和鳞状上皮。10

人类巴雷特化生的细胞起源仍有争议。这里我们展示了一个例子,Barrett化生食管的新鳞状岛和腺上皮共享一个共同的前体细胞。对于这一独特观测结果的来源有几种解释。首先,一个原始的鳞状干细胞克隆存在,然后这个克隆的一部分变成了化生,留下两组干细胞——分别产生鳞状上皮和腺状上皮——这两组干细胞具有相同的克隆起源。这与所谓的“经典假设”是一致的,即巴雷特化生的起源来自分层的食管鳞状上皮。其次,由于酸抑制治疗,一个mtDNA突变巴雷特化生干细胞克隆恢复到产生鳞状上皮。然而,这是非常不可能的,因为新鳞状上皮通常与周围的巴雷特皮化生(Barrett’s化生)有明显的遗传差异9表明绝大多数的新鳞状细胞岛是野生型的,并没有分享周围巴雷特化生的明确的突变负担,野生型的鳞状细胞再生长可以在发育不良的巴雷特岛上看到TP53变异(Simon Leedham博士,牛津大学,个人沟通)。第三种可能是治疗后,突变mtDNA的新鳞状干细胞的克隆转化为突变的多潜能柱状干细胞的克隆。这可能表明,随着病变年龄的增长,新的柱状上皮继续发育。最后,值得注意的是,一个食管腺管可能在柱状和鳞状mtDNA突变区域的下方,因此可以想象,这个腺可能是两个谱系的来源。

最近一项使用小鼠模型的巴雷特化生组织发生的研究推测巴雷特化生是从SCJ的一个胃源克隆发展而来的。8虽然我们的数据表明,潜在的全新巴雷特化生克隆源近于SCJ,但我们对混合型化生的观察也为巴雷特化生起源于胃的争论提供了一个有趣的方面。混合型化生是指在一个腺体中同时存在胃和肠两种表型的细胞。21本文提供的数据显示了一个完全缺乏cco的腺体,它包含了胃系和肠道系的混合物。这表明胃和肠细胞来源于一个普通的干细胞,尽管应该注意的是,基因克隆分析不能在这个腺体上进行。有趣的是,推测这种混合腺体正在从胃表型转变为肠表型的过程中。因此,转化为肠化生可以从胃起源预告。

这项研究包括了一系列被选择的患者,他们表现出mtDNA突变,通过酶组织化学和DNA测序可以证明:可能会有人质疑这是否会以任何方式对我们得到的结果产生偏差。自然,要观察一个系统而不以某种方式干扰它是不可能的,31但已有研究表明,这种类型的克隆突变对隐窝种群的影响很小。32此外,对一些结肠隐窝细胞的整个线粒体基因组进行测序,发现这些细胞中有各种各样的点突变,影响着许多不同的蛋白质编码和RNA编码基因,26因此,这些年龄在55岁到75岁之间的个体,很可能与许多发生巴雷特化生的人相似,也有多个mtDNA突变。因此,我们没有理由得出这些结果不具有代表性的结论,即使本研究的固有局限性是,材料来自标本中其他地方也有不典型增生或癌的个体。事实上,在干细胞克隆中出现的罕见点突变可以前所未有地洞察谱系关系。33

总之,我们已经证明:(1)正常的食管鳞状上皮含有克隆斑块,来源于基位祖细胞或干细胞的局部扩展,邻近干细胞群的横向替换是可能的,这强烈提示这是突变克隆扩散的机制;(2)粘膜下食管腺管由多个干细胞维持;(3)巴雷特化生腺体含有多个干细胞,经历生态位继承和单克隆转化过程;(4)巴雷特化生可能是通过裂变在巴雷特化生内部进行无性系扩展;(5)新鳞状上皮和底层腺上皮可以共享一个共同的细胞来源,能够分化成两种细胞类型。

致谢

我们非常感谢英国格洛斯特郡皇家医院的休·巴尔教授协助本手稿的初步工作。

参考文献

脚注

  • SACM和JAJ对这份手稿贡献相同。

  • 资金C548/ a5675 - chopin化学预防恶性前肠肿瘤。

  • 相互竞争的利益一个也没有。

  • 病人的同意获得的。

  • 伦理批准07/Q1604/17牛津郡道德委员会。

  • 来源和同行评审不是委托;外部同行评议。

  • 数据共享报表我们很乐意应要求与任何有兴趣的团体分享任何数据。