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全世界至少有2.5亿人是慢性乙型肝炎病毒感染,一个小hepatotropic DNA通过逆转录病毒复制。慢性感染晚期肝病的风险大大增加。目前的治疗方法很少达到治疗由于细胞内病毒复制的耐火性中间称为共价闭合环状DNA (ccc)。感染后,生成cccDNA plasmid-like游离基因在宿主细胞核蛋白质放松的圆形(RC) DNA基因组在传入的病毒粒子。它的基本作用是对所有病毒rna模板,和由于新的病毒粒子。生物合成的RC-DNA逆转录病毒pregenomic RNA现在理解的更详细的信息,然而RC-DNA转换成cccDNA仍然是模糊的,最重要的是由于缺乏可行的,cccDNA-dependent试验系统。概念和最新实验数据链路cccDNA形成细胞DNA修复,这是越来越欣赏作为一个关键的细胞和病毒之间的接口。加上新的体外乙型肝炎病毒感染系统,基于胆汁酸转运体的识别牛磺胆酸盐钠协同转运受体多肽作为乙肝病毒条目,这提供了小说解读的机会,最终干扰,乙肝病毒的持久性水库的形成。简要概述后cccDNA的HBV感染周期的作用,本文旨在总结当前cccDNA分子生物学知识,强调实验的限制,迄今为止阻碍更快的进步和讨论cccDNA作为新目标,潜在的治疗慢性乙型肝炎的治疗。
- 乙型肝炎
- DNA损伤
- 慢性病毒性肝炎
- 分子机制
来自Altmetric.com的统计
介绍
全世界至少有2.5亿人是慢性乙型肝炎病毒感染1和开发风险大大增加肝纤维化、肝硬化和肝细胞癌,导致每年估计有650 000人死亡。2虽然一个有效的预防性疫苗可用,3目前治疗慢性乙型肝炎仅限于1型干扰素和五个批准干扰素有ide (t)类似物(NAs),目标病毒聚合酶,P蛋白、多功能逆转录酶(见下文)。由于严重的副作用,只有一小部分病人有资格获得干扰素治疗,和< 10%的人表现出持续的病毒学反应,测量损失的乙型肝炎表面抗原(HBsAg;见下文)。4NAs是更好的容忍,最有效的药物,恩替卡韦和替诺福韦,由5 - 6日志,可以减少病毒血症和低利率通常低于检出限,病毒耐药性的发展。5然而,HBsAg清除是非常罕见的(0 - 5%)即使在长时间的治疗,4和频繁的病毒反弹在治疗撤军表示需要终身治疗。6复活甚至可以发生在免疫抑制,在几十年前解决急性乙型肝炎病毒感染的患者,7表明该病毒可以免疫控制但不消除。
病毒学这持久性的关键是细胞内乙型肝炎病毒复制的中间,被称为共价闭合环状DNA (ccc),驻留在感染细胞的游离核(即集成)plasmid-like分子产生子代病毒。慢性乙型肝炎的治疗将因此需要cccDNA的消除。然而,尽管> 30年的研究,对cccDNA的分子机制形成和退化,最重要的是由于缺少合适的实验系统。最近的发现要改变这样的状况,特别是识别的liver-resident胆汁酸,牛磺胆酸盐钠协同转运多肽(NTCP;也称为SLC10A1),作为一个条目为乙肝病毒和δ型肝炎病毒受体(丁肝病毒),它取代了乙肝病毒进入细胞的信封8,9(箱1)。这一发现最近进行的各个方面。10,11
第二个关键HBV持久性是一个有缺陷的免疫反应,通常包括功能衰竭和细胞毒性T细胞耗竭,缺乏足够的CD4 + T细胞的帮助,和失败山中和抗体。而免疫恢复可能会不可或缺的即使发现减少cccDNA的其它方法,12为更多的信息的读者被称为相关评论。13 - 16重点将cccDNA研究简史》及其实验困难,和最近的进展以及他们如何可能转化为新的治疗慢性乙型肝炎的治疗方法。
乙型肝炎病毒感染和复制:一个简短的概述
乙型肝炎病毒是被成员肝病毒科,一个家庭的小包围hepatotropic基因组DNA病毒共享类似的组织和复制策略。哺乳动物动物病毒(orthohepadnaviridae)包括,例如,土拨鼠肝炎病毒(WHV)和地松鼠肝炎病毒,最近发现,乙肝病毒的长毛猴子17和蝙蝠。18鸟类病毒(avihepadnaviridae)包括等,北京鸭子(鸭乙型肝炎病毒(DHBV))和苍鹭乙肝病毒。但是,没有嗜肝病毒被发现在建立实验动物如老鼠,老鼠或鸡肉。
所示图1乙肝病毒粒子,19,20.或“戴恩粒子”21,包括一个外层信封lipid-embedded小(S),中间(M)和大型(L)表面蛋白(HBsAg血清学)和一种内在的核衣壳(核心粒子;乙型肝炎核心抗原的血清学)二十面体壳是由120核心蛋白的二聚体。22日至25日其内部港口的病毒基因组部分双链,圆形而不是共价闭合“放松循环”(RC) DNA的5′端(-)链病毒P蛋白共价相连26;形成这种不同寻常的结构由protein-primed逆转录下面。
基本的乙肝病毒的分子特征。(一)病毒粒子的结构。传染性病毒粒子组成的一个外层信封lipid-embedded表面蛋白(S)小,中间(M)和大型(左),和一个二十面体内部携带病毒基因组的核衣壳作为relaxed-circular DNA共价连接到终端的蛋白质(TP)域的P蛋白。(B)基因组组织。外部线条表示病毒成绩单,箭头转录开始;ε象征RNA衣壳化信号pregenomic (pg)的RNA。两个DNA链表现为出现在放松的圆形(RC) DNA突出RC-DNA-typical特性的相对位置;然而,病毒rna编码中出现的开放阅读框(orf)中心实际上是共价闭合环状DNA转录。注意高度紧凑的组织与重叠子和监管元素(绿色箭头,推动者;掺I / II掺,转录增强剂; direct repeat (DR)1, DR2, direct repeats; wiggly red line, RNA primer on (+)-DNA). (C) Domain structures of HBV structural proteins. Numbers represent amino acid positions, based on genotype D, subtype ayw. The entry inhibitor Myrcludex B is derived from the N terminal part of the PreS1 domain. The middle surface protein M consists of PreS2 plus S. GAG, glycosaminoglycans; NTCP, sodium taurocholate cotransporting polypeptide; P, POL/RT, DNA polymerase/reverse transcriptase; RH, RNase H; L, large surface protein comprising PreS1, PreS2 and S domain; myr, myristoyl.
最引人注目的特征基因(图1B)是它的小尺寸(∼3 kb)和非常紧凑的组织,每个核苷酸(nt)都有编码函数在一个甚至两个(重叠)开放阅读框(orf);通过必要性,对基因表达和众多监管所有元素独联体元素的复制重叠编码信息。值得注意的是,avihepadnaviruses缺乏功能X蛋白在哺乳动物病毒似乎基本建立感染(见下文);此外,他们生产L和S但没有M表面蛋白。乙型肝炎病毒的结构蛋白的域结构中概述图1C。
由所有嗜肝dna病毒共享一个关键特性是他们狭窄的宿主范围,实质上对乙肝病毒包括人类和类人猿。这一限制极大地阻碍了功能性研究和建立了动物的重要性乙肝病毒更容易处理的代理人。WHV土拨鼠是一个相关的临床前模型的新的乙肝病毒的抗病毒药物,27和DHBV不可或缺建立嗜肝病毒感染和复制的基本方面。28
辅以研究采用与人类乙肝病毒转染表达人类肝癌细胞系的向量,例如,HepG2 Huh7,支持复制(但不容易感染),这导致了普遍为乙肝病毒感染周期计划。29日除了几个最近HBV-specific发现(NTCP作为受体,可能HBV X功能蛋白质(HBx)表示图2,基础很可能适用于所有的嗜肝dna病毒。
乙肝病毒感染周期的简化方案。(一)附件和条目。(B)的核衣壳释放到细胞质中。(C) Nucleocapsid-mediated核运输和释放P-linked放松圆形(RC) dna核孔进入细胞核。(D) RC-DNA共价闭合环状DNA (ccc)转换。(E)的转录病毒rna。(F) RNA核出口。(G)的翻译。(H)预防cccDNA的转录沉默的乙肝病毒X蛋白(HBx)。(我)Co-packaging P和pregenomic (pg) RNA到新形成核衣壳。 (J) First-strand DNA synthesis (inhibited by nucleos(t)ide analogue (NAs)), pgRNA degradation and second strand DNA synthesis leading to new RC-DNA. (K) Envelopment of mature RC-DNA containing nucleocapsids. (L) Secretion of new virions assisted by components of the multivesicular body (MVB) machinery. (M) Secretion of hepatitis B e antigen (HBeAg) and excess subviral particles (SVP) constituting the bulk of hepatitis B surface antigen (HBsAg). GAG, glycosaminoglycans; L, large; M, middle; NTCP, sodium taurocholate cotransporting polypeptide; S, small.
总之,乙肝病毒粒子集中在易感细胞通过交互的暴露地区S域重叠与immunodominant的行列式,轴承的大多数乙肝病毒中和抗原表位,和细胞表面粘多糖。30.,31日然后,一个高亲和性myristoylated N之间的交互终端PreS1 NTCP L蛋白区域,并可能进一步的宿主因素,32触发病毒粒子的吸收(可能通过内吞作用)。值得注意的是,核衣壳包络PreS1域也是必不可少的,由其对偶拓扑(占图1),面对病毒粒子内部,另一部分病毒粒子表面。33与NTCP互动,大约50的aa PreS1 N末端和终端脂肪酰化就足够了(图1C),依据条目抑制PreS1-derived lipopeptides (“Myrcludex B”11)。病毒粒子吸收后,RC-DNA含有核衣壳释放到宿主细胞细胞质。过程知之甚少,但可能会产生新的体外感染系统基于NTCP-transfected肝癌细胞。接触Arg-rich C核本地化信号的终端域(ctd)34核心蛋白(图1C),可能受CTD磷酸化和/或完成不完整(+)在RC-DNA链,使运输的核衣壳核衣壳壳分解毛孔,35释放病毒polymerase-bound RC-DNA核浆;转换成cccDNA和形成核minichromosome,可能与HBx和核心蛋白发生。36在细胞DNA,这提供了大量的选项cccDNA转录活动的动态表观遗传控制,高度示意图中概述图3。这些包括DNA甲基化等修饰,专制和激活转录后修饰(天车)组蛋白乙酰化作用等,甲基化,磷酸化和其他人,37核小体间距和可能最近发现机制通过非编码rna38或更换正常组蛋白的特定的变体。39值得注意的是,在缺乏HBx, cccDNA似乎迅速沉默,而HBx促进转录活跃状态40这与一些已知的存在激活组蛋白天车。41,42然而,机制HBx-mediated de-silencing尚不清楚,和潜在的激活和抑制的全部曲目监管在很大程度上是未知的,的问题是是否chromatinisation RC-DNA已经可以启动。接下来,cccDNA发挥其关键作用的模板主机RNA聚合酶II-mediated subgenomic RNA转录(表面蛋白和HBx)和两个greater-than-genome-length RNA,即pregenomic (pg) RNA和precore RNA产生precore蛋白前体的分泌乙型肝炎e抗原(e抗原)。所有的rna 5′封顶和3′腺苷,像细胞信使rna。高效cccDNA转录是由肝脏特异性转录因子43然而,也取决于HBx40这可能抵消cccDNA的转录沉默(见下文)。核出口后,rna是翻译。信封蛋白质定向到内质网在他们进入分泌通路产生大量过剩的空信封完整的病毒粒子。这些subviral粒子构成的大部分HBsAg,乙肝疫苗的基础。翻译的bicistronic pgRNA收益率核心蛋白质+ P, DHBV可能由一个分流机制,似乎并不适用于人类的病毒。44
表观遗传学的共价闭合环状DNA (ccc)。核发现cccDNA mini-chromosome,与周围15 - 16核小体(核心组成的组蛋白H2A、H2B H3, H4加上链接器组蛋白H1)和non-histone蛋白质,可能包括病毒核心蛋白和乙肝病毒X蛋白(HBx)。由此产生的染色质结构,加上潜在的DNA甲基化等修改(“我”),强烈影响监管元素的可访问性DNA转录因子和RNA聚合酶,从而可以控制转录活动。重要的因素是核小体间距,染色质remodellers本身可修改的,和各种翻译后组蛋白修饰(天车),调节DNA压实的程度。细胞DNA,也许在HBV cccDNA,额外的监管(表示为“等在图)可以通过组蛋白变体发生或非编码rna。在缺乏HBx, cccDNA似乎迅速沉默(关闭状态);HBx促进de-silencing(打开状态),要么通过刺激激活修改,或通过阻断压抑的修改(或两个);其他表观遗传控制潜在的贡献仍有待探讨。
建立RC-DNA的不同寻常的特性
接下来的步骤建立的不同寻常的结构RC-DNA后代核衣壳和病毒粒子。P蛋白结合的5′近端茎环结构的pgRNA触发copackagingεRNA和P到新形成核衣壳和protein-primed反转录的起始。29日,45在启动反应,Tyr-residue独特的终端蛋白质域的P蛋白(图1C)替代品核酸引物的3′末端哦组(例如,一个主机tRNA)受雇于传统反转录酶的受体(-)的第一个nt链DNA;结果是一个共价tyrosyl-5′-DNA-phosphodiester连杆RC-DNA保持到最后的形成。第一个3 - 4元的增长(-)链DNA模板的一个凸起区域内ε(图4上),其次是转移到一个匹配的受体主题在3′近端直接重复1 *(根据DR1 *)。扩展从那里来的5′端pgRNA模板(图4(-)完成DNA)产生一个单位长度(-)链的DNA拷贝pgRNA随身携带一个小(∼10元)终端冗余(r)。随着DNA合成的发展,大部分的pgRNA退化P蛋白前体的活动(潜在的新的治疗目标46)。non-degraded 5′残留pgRNA然后作为(+)链DNA合成的引物。在少数的核衣壳,直接(原位)扩展的RNA引物产生一个线性(dsL)双链DNA分子(图4,原位(+)dna合成)。其线性结构不能产生新的pgRNA;然而,除非退化,dsL-DNA可以使成圆形的异源end-joining (NHEJ)成cccDNA-like分子DNA修复途径。NHEJ容易出错,47,48这些分子在功能上是有缺陷的。另外,dsL是整合到宿主染色体的主要底物,49经常出现在HBV-associated肝细胞癌。50不同于逆转录病毒、集成既不是virus-catalysed(缺乏整合酶基因)也不是嗜肝病毒复制的义务;相反,逆转录病毒前病毒整合的功能模拟是cccDNA的形成。复制的需要转移RNA引物序列(携带根据DR1) sequence-identical DR2,和扩展从那里的5′端(-)链DNA (图4,妥善准备(+)dna合成)。“r”在另一端有相同的序列,两端的交换允许(+)链DNA合成,最终产生RC-DNA稍微超长(-)链携带共价连接P蛋白5′末端,和一个不完整的(+)链RNA引物的5′末端构成的。这些结构特点是关键元素被认为是RC-DNA cccDNA的转换。
建立不同寻常的结构特点放松通过蛋白质启动循环(RC) dna。蛋白质启动5′ε生成一个短εbulge-templated DNA低聚糖phosphodiester-linked的终端蛋白(TP)域在P蛋白和转移到直接重复1 *(根据DR1 *)扩展。(-)DNA完成期间,pregenomic (pg) RNA降解除了封顶5′末端,收益率单链DNA (ss)。未经碰撞的RNA低聚糖作为(+)dna引物。直接收益率(原位)扩展线性(dsL) DNA双链。正常启动(+)dna合成DR2收益的转移RNA引物;后的5′端(-)dna模板,小终端冗余使交换对sequence-identical 3′r序列,(+)链合成可以生成RC-DNA。有关详细信息,请参阅文本。
感染周期完成后的包络成熟RC-DNA包含核衣壳(虽然不是不成熟的RNA或ssDNA包含核衣壳51由表面蛋白);不同于subviral粒子,粒子分泌包括宿主因素多泡体的途径。52表面蛋白促进供应不足,相反,回收的新RC-DNA细胞核,放大cccDNA拷贝数。53由于缺乏合适的实验系统的乙肝病毒,大多数现在的知识在这个过程来源于duck-DHBV模型。
范围和当前实验系统研究cccDNA的局限性
富有成效的嗜肝病毒感染取决于cccDNA的形成。因此,控制感染细胞培养系统将提供一个意味着调查cccDNA的形成,然而,由于乙肝病毒的宿主范围狭窄直到最近,只有少数和复杂的体外感染系统。54简而言之,一个合适的系统主要是肝细胞从一个匹配的主人,也就是说,人类乙型肝炎病毒;主要缺点是这些细胞的可用性和高质量参差不齐。另一种是主要从树鼩肝细胞(Tupaia belangeri),55,56然而适当保持这些动物是要求和昂贵的。令人惊讶的是,从大多数猴子出现耐火乙型肝炎病毒感染肝细胞尽管这些动物都比tupaias更与人类密切相关。最近的一个解释是当地的相似性越高tupaia NTCP两个地区的人类蛋白质与HBV PreS1至关重要的交互。57搜索这些序列在NTCP其他猴子可能揭示新的感染模型。原发性肝细胞的一般缺点是他们快速损失的敏感性与NTCP表达式的丧失。8,9长期的乙肝病毒易感性可以通过异种器官移植人类或tupaia肝细胞在免疫缺陷小鼠58,59但在技术上是非常精致的。一个突破是人类的发现liver-derived HepaRG细胞系,60,61年这变得容易乙肝病毒(和丁肝病毒)在漫长的分化过程61年尤其,诱发NTCP表达式,8,9但是没有检测到病毒传播。
表达人类NTCP足以呈现广泛应用HepG2和Huh7细胞系容易感染乙肝病毒和丁肝病毒8,9标志着主要的进一步推进,因此即使高感染率目前需要一个巨大的(104倍)过剩的病毒颗粒细胞。9
相比之下,non-infection-based系统,如乙肝病毒质粒转染到肝癌细胞,或水动力转染小鼠plasmid-borne乙肝病毒基因组62年受到所有从极低或没有cccDNA的形成。而不是cccDNA转染质粒作为主要的转录模板(图2)。同样,病毒转录HBV-transgenic老鼠似乎限制了集成的乙肝病毒序列,尽管长期病毒复制大量的水平。潜在解释小鼠肝细胞生成cccDNA的失败包括缺乏,或与乙肝病毒不相容,RC-DNA cccDNA转换所需的小鼠宿主因素,或者限制因素的存在,从广义上讲,可能包括的因素或条件,影响核运输正常成熟的核衣壳,例如,通过过早细胞质RC-DNA的释放。cccDNA的水平也可能是低由于快速退化。因此,多表达人类NTCP需要产生乙肝病毒感染的小鼠模型。
不同于乙肝病毒,DHBV容易产生可检测水平cccDNA的系统测试,包括禽流感63年和人肝癌细胞系,64年而明确的检测HBV cccDNA仍然具有挑战性的(见下文)。此外,主要对DHBV感染鸭肝细胞53是现成的,鸭子体内实验;为数不多的黑猩猩与人类乙型肝炎病毒的研究有助于阐明乙肝病毒免疫生物学13但现在很大程度上被禁止的。
对理解cccDNA DHBV生物学的重要性
由于它的超螺旋结构,cccDNA施加电泳淌度高于同样大小的线性或钢筋混凝土形式,众所周知的质粒DNA的准备工作。因此,南部印迹提供了一个独特的区别cccDNA的其他形式的hepadnaviral基因组(图5A)。使用这种分析,cccDNA首次观察到感染肝脏的鸭子,65年,66年groundsquirrels67年和人类68年病毒DNA,没有相关的病毒颗粒,专门的核,在慢性感染鸭肝细胞出现在50份每个细胞。据坊间传言,一个早期的黑猩猩的研究结论是,错误地,cccDNA出现在戴恩粒子69年这些代表了真正的传染性病毒粒子。然而,只有提供的DHBV模型实验的方法评估cccDNA的功能。不全面的具有里程碑意义的结果列表包括cccDNA的依赖形成病毒反转录而不是半保留的DNA-to-DNA复制70年;代cccDNA的池,也就是说,多个副本/核,通过细胞内的放大53;监管的拷贝数通过大型包膜蛋白的水平63年;和发展的方法来确定cccDNA复制单个细胞的数量。71年这项工作,证实了土拨鼠的研究模型,建立了关键作用cccDNA的复制周期hepadnaviral持久性水库。
直接和间接检测共价闭合环状DNA (ccc)。(一)南部的印迹。向量为野生型(+ ENV)和envelope-deficient (ENV)鸭乙型肝炎病毒(DHBV)转染到禽流感LMH肝癌细胞系。病毒DNA从细胞质核衣壳(cytopl)和核DNA检测使用32P-labeled DHBV DNA探针;核DNA治疗Dpn我消化细菌派生转染质粒,与Plasmid-Safe核酸酶降解线性但不环状DNA;放松圆形(RC) dna接近完成的(+)链不退化。注意(我)cccDNA的典型独特的流动与所有其他病毒DNA形式和(2)大大增强cccDNA水平产生的envelope-deficient DHBV。(B) cccDNA-specific PCR。引物(紫色和绿色箭头)选择跨区域包含的差距(+)(-)链的链和尼克RC-DNA。cccDNA提供了一个连续的指数扩增的模板。RC-DNA,线性扩展个人的引物生成短但相互重叠的产品,可以退火和随后形成一个从cccDNA相同的扩增子。
最近的研究包括禽流感的一代DStet5等肝癌细胞系,72年携带一个稳定综合envelope-deficient DHBV (DHBVenv−)在四环素(春节)响应启动子。退出春节诱发转录的集成和随后的复制,包括cccDNA的形成。增加春节关闭了整合转录这样cccDNA接管模板函数。73年病毒粒子的竞争途径分泌缺被信封,cccDNA的水平可以达到几百册每个细胞。出乎意料,DHBV维护的能力产生高水平的cccDNA甚至在人类肝癌细胞,64年,74年允许搜索人类宿主因素没有技术问题困扰HBV cccDNA检测。值得注意的是,对HBV信封的提振效果缺乏比DHBV cccDNA积累明显要少得多。64年,75年
明确的挑战人类乙肝病毒cccDNA检测
单细胞分析慢性感染鸭的肝活检显示平均约10份cccDNA的每个细胞,单个细胞之间有一个广泛的分布和时间波动过程中感染。71年复制数字在人类慢性乙型肝炎出现明显低(平均0.1 - -1.0份每个细胞)和类似的数据适用于人类肝嵌合体小鼠,76年限制使用南部印迹检测真实cccDNA作为一个明确的手段。作为一个经验法则,南部的印迹32P-labeled探针可以检测每车道几皮克病毒DNA;2 pg对应大约106分子。假设大约106six-well板每口井的细胞,转染和感染细胞占细胞总数的10%,这转化为检测极限约10 cccDNA副本/感染/转染细胞。需要更敏感cccDNA在早期检测技术解决77年通过PCR技术称为“over-gap”或误导,cccDNA-specific PCR (图5B)。其主要原理是利用引物生成一个连续区域双链cccDNA但带着尼克(-)链和差距的(+)链RC-DNA,最有可能的污染物(除了质粒DNA转染或集成HBV DNA稳定细胞系或转基因动物)。然而,cccDNA的全部序列信息也存在RC-DNA (图5B),可以出席1000张或更多的每个细胞。78年虽然指数放大最初只会发生在cccDNA,线性扩展的引物(+)和(-)链短链DNA产生重叠的产品可以互相退火,然后被放大指数从cccDNA的相同的产品。因此,over-gap PCR提供相对的,不是绝对的歧视cccDNA和RC-DNA之间。周围的最初实现歧视性的几千倍77年可以增加减少的水平RC-DNA在模板准备,例如,预处理与Plasmid-Safe DNase,79年DNA降解免费结束;不过,尤其是RC-DNA接近完成(+)链不是一个衬底(参考64年和图5A)。因此,没有适当的控制似乎cccDNA-specific扩增子可以完全没有cccDNA的生成。
滚动循环放大是一个潜在的替代品,因为它应该是依靠一个圆形模板。80年然而,我们的数据使用纯DHBV RC-DNA表明这种依赖,不是绝对的。non-PCR替代入侵者技术,只使用一个适当链为模板,设计寡核苷酸组装一条琥珀结构structure-specific酶的底物;因此,它可以辨别是否乙肝病毒的序列(+)链有一个免费的5′末端RC-DNA,或者是一个连续的序列在cccDNA的一部分。81年无论如何,最大化cccDNA的选择性这些化验,一个潜在的污染与RC-DNA应该保持最小。一个简单的意味着从核而不是整个细胞DNA,64年也可能结合的核酸外切酶治疗降低RC-DNA但不伤害cccDNA;一个尼克在一个放松成为超螺旋链就足够了,错误地暗示cccDNA的水平低于实际上可能存在。
获得cccDNA复制数字每个细胞,这是同样重要的量化细胞DNA。根据萃取过程,这可能是由确定β-globin等细胞基因的拷贝数76年或β-actin。82年如果小的dna被浓缩在大的dna,在赫特过程,83年线粒体DNA可以用于一个近似,84年,85年虽然变量每个细胞的线粒体基因组数量需要考虑。86年
最重要的是,研究人员应该意识到他们所使用的特定方法的潜在的缺陷,以及任何间接测定应校准使用参考标准的RC-DNA cccDNA的分子性质和浓度独立已经证实了南方的印迹。共同朝着建立一个标准化的高灵敏度的协议将是非常可取的。
读者,另一方面,应该意识到的已经很低水平的进一步减少乙肝病毒cccDNA并不总是必要的数据。
cccDNA的长寿
病毒复制的频繁反弹撤军NA治疗或免疫抑制,尽管虚拟复制中间体损失,表明cccDNA可以持续几十年,7然而可靠数字cccDNA动力学损失很难源自人类患者。研究长期WHV-infected旱獭和DHBV-infected鸭子87年,88年持续发现半衰期33至57天,相似的价值观在原发性肝细胞衍生。89年在清除阶段急性感染的黑猩猩,cccDNA半衰期是减少∼3天,90年尽管cccDNA的痕迹持续多年。这些数据证明cccDNA的长寿池在慢性感染;然而,该池的稳态是由许多参数影响生产新的和失去现有的cccDNA分子反褶积是极其苛刻的。90年,91年因此,目前,我们不知道多久一个人cccDNA分子的生活,尽管这是一个至关重要的问题为新的治疗方法旨在直接目标cccDNA(见下文)。
概念证据的参与宿主DNA修复RC-DNA cccDNA的转换
RC-DNA从传入的病毒粒子,在所有的可能性,直接cccDNA的前兆。因此,RC-DNA的特色,也就是说,共价结合P蛋白DNA和RNA引物5′端和不完备的(+)链和终端的冗余(−)链,必须固定,并结束必须绑定(图6A)。可以想象,这些步骤可能是由病毒P蛋白,最重要的(+)链填补的空白。然而,抑制P蛋白的NAs没有或只有部分,抑制初始cccDNA形成感染模型,表明NA-insensitive宿主DNA聚合酶可以执行这个函数。92年,93年
放松的圆形(RC) DNA模拟细胞DNA受损。(一)RC-DNA结构特点。(-)链包含phosphotyrosyl保税P蛋白,尼克,和单链皮瓣(对应于r);(+)链包含的差距和RNA引物的5′端。在细胞DNA,盈余结构经常是被内切酶(绿色闪电符号),包括从远处病变;phosphotyrosyl-linked加合物可以解决特定tyrosyl-DNA-phosphodiesterases (tdp、红色闪电符号;见B)。Nucleolytically诱导DNA聚合酶需要填写的空白,可能在多核苷酸激酶和磷酸酶end-polishing之后,和nick-sealing DNA连接酶。相同的维修活动是可以预见的是要求在RC-DNA共价闭合环状DNA (ccc)转换。(B)相似的P蛋白和RC-DNA细胞之间的联系被困拓扑异构酶(上)解理复合物。公布的5′与TOP2要么是TDP2 TDP1(或者在某些情况下),或通过nucleolytic修复。 Principally the same holds for 3′ linked TOP1, except TDP1 appears to be the major TDP involved. Recent evidence strongly suggests that TDP2 is able to release P protein from RC-DNA; however, nucleolytic pathways may also occur. (C) Slowed-down RC-DNA to cccDNA conversion in HepG2 cells with reduced TDP2 levels. A vector for envelope-deficient duck HBV (DHBV) was transfected into naive (nai.) cells or cells in which TDP2 levels were reduced by 80–90% by stable expression of an anti-TDP2 shRNA (TDP2 kd). Kinetics of RC-DNA and cccDNA generation were compared by Southern blotting. The ratio of cccDNA:RC-DNA (indicated at the bottom; mean±SD, n=6) was significantly reduced in the TDP2 knock-down cells on day 2 and day 3 post transfection (adapted from Königer等74年)。
同时,一个“催化”释放P蛋白从RC-DNA可以设想,通过这个链接作为tyrosyl-DNA-phosphodiester的本质。拓扑异构酶活动的化学性质相同的债券发生共价中间体(见下文)。DNA拓扑异构酶调节成为超螺旋开一个(TOP1)或两个DNA链(TOP2),以减少扭转应力在复制或转录。94年在这个过程中,TOP1 tyrosyl-phosphodiester成为通过链接3′的DNA断裂,TOP2 5′网站(图6B),释放的能量破坏DNA骨干存储在新成立的tyrosyl-DNA-phosphodiester债券;因此,(酯交换)的反应是可逆的,DNA是封闭和酶被释放。然而,对于backreaction发生两个DNA必须sterically行结束,作为证明,例如,通过大幅增加困共价TOP-DNA加合物(“顶级乳沟复合物”)由药物引起的扭曲乳沟复杂的DNA。94年,95年RC-DNA因此,P蛋白(-)的释放和出伴随的螺旋链需要准确切除3′r冗余副本(−)链,一个活动很难归因于P蛋白。同样,P蛋白似乎不适合实现删除(+)的RNA引物链DNA和/或切断开放在一个或两个链结束。因此,大部分,如果不是全部,RC-DNA cccDNA转换的步骤必须由宿主细胞,而事实上,包含所有必需的活动作为其DNA修复系统的一部分。
基因组完整性是所有生物体维持生存的基础受到不断的威胁。而双链断裂(双边带)显然是有害的,许多其他的修改包括长串了,复制错误,使交联,基本修改或共价DNA加合物可以损害复制和转录和/或介绍致命的突变。一个哺乳动物细胞可能会经历> 104每天伤害事件。96年因此,所有的细胞都配备有先进的DNA修复机制的> 250组件用来检测DNA损伤,阻止细胞周期信号和允许时间修复,并修复受损;在后生动物,失败的修复通常会诱导细胞凋亡(否则可能导致癌细胞)。越来越欣赏的是,病毒核阶段应对这监视系统通过篡夺自己的利益或某些方面作为细胞防御被克服。97 - 100两个例子是乳头状瘤病毒,利用DNA修复和细胞周期控制的互联将宿主细胞为病毒基因组复制到一个适当的阶段,然后阻止细胞凋亡101年;或腺病毒,其线性双链DNA基因组解读为双边带的细胞,诱导修复串联体太大被打包。利用其早期蛋白质,腺病毒抵消这种细胞反应钝化DNA修复机制的关键组件,97年包括DSB-detecting MRN复杂。102年,103年
因此,它并不令人意外的众多不同寻常特性hepadnaviral RC-DNA (图6也叫在DNA损伤反应。然而,这一过程的分子描述只是在它的开始。
新兴实验证据的介入在嗜肝病毒宿主DNA修复cccDNA的形成
最明显的特点hepadnaviral RC-DNA是大(∼90 kDa)共价连接P蛋白。其磷酸二酯键(-)5′末端的DNA链非常类似于在困phosphotyrosyl债券最高乳沟复合物(图6B)。这些蛋白加合物的细胞修复涉及至少两个不同的机制。nucleolytic通路(适用于去除各种化学修改),病变切除加上一块邻近DNA通过structure-specific核酸酶94年,104年;然后填好的结果差距并最终结束的结扎。涉及到的一个因素是MRN复杂,本身包含一个核酸酶,MRE11,然而也可能与相关的核酸酶一致行动。105 - 107第二个机制使用tyrosyl-DNA-phosphodiesterases(计划书95年),专门把phosphotyrosyl-linkage。TDP1行为主要在3′与TOP1加合物,然而部分有争议的结果表明它也可能5′活动,可能依赖于其物种起源。2009年,TDP2第一TDP酶被发现与占主导地位的5′衬底的活动。108 - 110因此,酶是细胞活动的候选人能够释放5′phosphotyrosyl-bonded RC-DNA P蛋白。
正如我们最近显示74年使用重组TDP酶、人类和鸡TDP2,但只有酵母TDP1,施加高乳沟活动合成5′phosphotyrosyl模型底物。同一观察DHBV P蛋白,通过体外短DNA寡核苷酸与protein-priming反应的结合,111年,112年和真正的DHBV和乙肝病毒从细胞而RC-DNA核衣壳。这些生化数据坚定TDP2,但不是TDP1,作为细胞DNA修复因子有适当的酶活性也从RC-DNA裂开P蛋白在病毒复制。
P蛋白释放RC-DNA强制转换成cccDNA,灭活的负责任的因素(如果只有一个)应该切除cccDNA的形成。因此我们生成HepG2细胞稳定表达TDP2-specific小发夹(sh) rna,持久TDP2表达减少了80 - 90%。接下来,这些TDP2降低细胞和幼稚HepG2细胞转染与向量envelope-deficient DHBV基因组启动病毒复制,RC-DNA动力学和cccDNA积累被吸去南部相比。所示图6C, TDP2水平降低与显著相关课程RC-DNA cccDNA转换。最终,然而,同样的DNA水平和比率的形式建立在两个细胞。
一个直截了当的解释延迟的原因,但不是切除cccDNA的积累是残余TDP2提要少P无蛋白RC-DNA每时间转换途径(即P蛋白释放成为病原反应),减缓cccDNA的形成(见图7)。然而,数据也兼容更复杂的解释,解释普遍存在冗余在DNA修复。113年鉴于基因组完整性的基本重要性,失败的一个修复途径维护通常是通过一个或多个。对于顶级乳沟复杂的修复,这是几个nucleolytic通路,以能代替TDP-mediated修复。94年,114年
候选人治疗策略目标HBV共价闭合环状DNA (ccc)。圆圈表示P蛋白质和P无蛋白放松圆形(RC) dna和cccDNA的宿主细胞的细胞核。(一)预防cccDNA积累通过阻断宿主因素参与的多个步骤RC-DNA cccDNA的转换。(B)预防核进口RC-DNA capsid-targeting药物;胞质释放RC-DNA可能,此外,引发DNA传感器像循环GMP-AMP合成酶(注册会计师)和激活刺诱导抗病毒细胞因子。(C)沉默cccDNA的转录活动通过诱导宿主细胞的表观遗传机制,或通过阻断乙肝病毒X的de-silencing活动蛋白质(HBx)。(D)现有cccDNA的免疫介导的降解机制,也许通过APOBEC酶,或(E)直接定位和设计师核酸酶用于基因组编辑。有关详细信息,请参阅文本。
因此,这样的替代路径可能导致P蛋白释放从RC-DNA TDP2压倒一切的细胞,因此在进行中,虽然热爱音乐,cccDNA的形成。
区别应该可能完全废除TDP2表达式。核酸酶的基因编辑使用设计师现在允许在人类细胞中特定基因敲除115年但在HepG2和Huh7细胞复杂的变量hyperploidy (MN和m . Leipoldt人类遗传学研究所,弗莱堡大学;未发表的数据);strand-breaking编辑程序可能会进一步减少遗传稳定性。因此,结果在一个特定的细胞克隆不一定generalisable,做确认实验独立派生细胞克隆为宜。一个特定的问题在我们自己的努力产生TDP2淘汰赛细胞形成一个N晚期截断然而TDP2催化地活跃;它的表达式是独立于上游编辑网站,旨在中断ORF后不久起始密码。74年无论如何,生成特征明显肝癌细胞与宿主因素定义淘汰赛将是一个非常有价值的投资的长期研究乙肝病毒和宿主DNA修复之间的相互作用。
RC-DNA cccDNA转换为新的治疗目标?
上述数据表明TDP2同样其他宿主因素参与RC-DNA cccDNA转换为潜在的新的治疗靶点,其抑制应该防止乙肝病毒形成的持久性水库(图7)。然而,几个问题需要进一步澄清。最重要的是cccDNA的寿命是否涉及到单个分子或通过营业额达到。最终,这将需要监控单分子cccDNA的命运随着时间的推移,技术上一个重要的任务。没有cccDNA营业额,抑制RC-DNA cccDNA转换应该只在建立最初的感染,即预防性。有趣的是,治疗人类肝嵌合体小鼠进入抑制剂Myrcludex B,开始启动低剂量的乙肝病毒感染后,不仅阻止了病毒的传播也似乎损害cccDNA放大的RC-DNA已经感染的细胞。76年虽然这意味着cccDNA的从头合成可以发生,这些结果需要在临床证实。
第二个关键问题是,针对一个DNA修复的因素也可以影响细胞DNA损伤修复,修复的一个矛盾的角色系统的冗余。例如,如果P蛋白释放RC-DNA或者其他的转换步骤可以通过多个机制,阻止只是其中一个不会阻止cccDNA的形成。相反,冗余可能允许确定一个因素是至关重要的病毒,但细胞DNA修复的备用。这将需要一个全面的知识涉及的宿主因素,对于大规模筛选的方法,例如,通过基因失活通过RNA干扰或先进的基因敲除技术和/或筛查小复合抑制剂。最近的一项研究的确表明,小分子干扰cccDNA的形成,虽然机制是未知的。116年等任何有价值的筛选将乙肝病毒记者向量,允许非侵入式的、敏感的和定量检测cccDNA的形成;等其他病毒,包括丙肝病毒reporter-bearing变异仪器。117年然而,操纵微小,紧组织HBV基因组不影响其功能已被证明非常困难;118年,119年因此,进一步的研究是非常必要的。
另外一个策略是块RC-DNA前体进入细胞核(图7B)。核运输取决于衣壳,这可能是通过capsid-targeting药物,120年目前在发展。54除了诱导组装空衣壳或不规则的聚合物,它们也可能破坏现有的核衣壳。121年,122年RC-DNA释放cytoplasmically拆卸衣壳可能会无法到达细胞核,此外,可能成为被细胞质DNA传感器,如循环GMP-AMP合酶,它可以通过刺激诱导1型干扰素干扰素基因的刺痛。123年,124年屏蔽从这个防御系统可能是一个原因,HBV逆转录仅限于衣壳内部,RC-DNA是护送到完整的核衣壳壳。35再一次,然而,现有的cccDNA池如果发生cccDNA营业额,只会受到影响。
沉默cccDNA的转录活动可能一个临时解决方案
越来越多的证据表明,转录活性cccDNA受到表观遗传控制(图3);因此,操纵细胞的表观遗传机制125年可能会利用功能灭活,而不是消除,cccDNA (图7C)。模型研究表明interferon-α治疗作为一种可能性。73年,126年另外,HBx可能代表一个目标为直接的抗病毒药物似乎需要抵消cccDNA的默认沉默在乙肝病毒条目。40的机制是未知的和复杂的庞大的候选人HBx扶少团团员(例如看到参考127年);他们的相关性感染往往是可疑的,因为测试系统使用轻微,如果,HBx (cccDNA)相关的。128年较强的候选人之一是DNA DDB1 damage-binding蛋白质129年与它的合作伙伴DDB2承认UV-induced DNA扭曲和形成一个E3泛素连接酶复杂的多个目标产生退化。130年这些相关的de-silencing活动HBx不知道但可能屈服于新的HBx和cccDNA-dependent感染系统。值得注意的是,然而,阻塞HBx之间的相互作用和细胞的伴侣必须持续只要cccDNA的礼物。此外,细胞转录活性对免疫介导性cccDNA间隙cccDNA显得更加稳定。131年因此,需要更多的研究来验证这一概念。
消除cccDNA的肝脏
稳态cccDNA水平取决于利率形成和损失。只要营业额动力学不解决,积极消除现有cccDNA的出现是最直接的方法。现行的两个主要策略是模仿,在慢性设置,大多数的cccDNA的免疫介导的间隙发生在自限的急性乙型肝炎病毒感染13,132年(图7D)和设计师的就业核酸酶,彻底改变了基因组编辑(图7E)。
先天和适应性免疫反应清除急性乙型肝炎病毒感染的关键。恢复免疫反应不足的全部活动典型慢性乙型肝炎病毒感染将保持高度相关,12可能在细胞水平(清除感染的肝细胞)和体液水平(防止再感染)。给定领域的广度,只有几个将军和简化考虑这里讨论(更多更全面的描述,请参阅参考资料14,15,133年,134年)。
cccDNA的两个极端场景从肝细胞溶细胞间隙消除(“固化”),或破坏(几乎)所有的细胞都窝藏cccDNA的T细胞(“杀死”)和更换未受感染的细胞。132年经常在慢性乙型肝炎肝损伤反对养护作为唯一的解释;相反,从急性感染需要快速复苏,整个肝脏上缴几如此维护功能。因此,可能存在两种机制,但它们的相对贡献仍争论不休,由于多个,很难评估参数。90年,91年,135年例子包括cccDNA的命运在细胞分裂过程中,136年特别是如果cccDNA如何重新改革核;cccDNA-free与cccDNA轴承细胞的周转时间,对于后者,cccDNA转录活性的影响;或起源,分数和难治性感染细胞的增殖特征,或耐火免疫介导的间隙。不管这些困难,干扰素等细胞因子及其下游效应器似乎发挥重要作用,但具体机制并不坚定。虽然复制周期的各个步骤可能受到影响,132年最近的一项研究137年显示很大的剂量interferon-α,或者更有说服力地lymphotoxin-β受体的激活,可以直接目标通过APOBEC3A cccDNA的完整性和3 b-mediated去氨基(-)链和随后的退化。虽然有些方面是有争议的,138年,139年激活先天反应的价值承诺,凸显了临床结果与7 toll样受体激动剂gs - 9620。140年
值得注意的是,在各种设置的免疫介导cccDNA下降,cccDNA池出现的一小部分耐火材料进一步减少。88年,84年,131年,137年,141年这可能反映出的属性cccDNA窝藏细胞,或cccDNA可能本身存在不同形式的不同,例如,在甲基化,chromatinisation或一些未知的属性(图3)。可能,非天然的方法来诱导cccDNA退化也可以目标这个弹性水库。
关键作用的HBV DNA共价闭合环状(ccc)和慢性乙型肝炎的病毒持续感染
慢性乙型肝炎,造成持续感染乙肝病毒,将> 2.5亿人置于危险境地,开发终端肝脏疾病。
乙肝病毒持久性是由一个在细胞核内的游离形式称为cccDNA的病毒基因组。
cccDNA的模板是病毒rna和随后的一代的子代病毒。
几份cccDNA /肝可以(重新)发起全面的感染。
cccDNA不是当前的目标治疗慢性乙型肝炎的治疗将需要cccDNA的消除。
最新进展,包括肝脏特异性的识别乙肝病毒HBV受体和证据与细胞DNA损伤修复的互动,承诺大大扩大cccDNA生物学的知识有限。
未解决的问题主要在HBV DNA共价闭合环状(ccc)生物学
cccDNA的长寿与单个分子,或有cccDNA营业额吗?如果营业额出现,路线(细胞内?细胞间吗?一个细胞外的阶段?)和动力学?
如何cccDNA‘清除’在急性自限性乙肝吗?
如果可以免疫细胞治愈从cccDNA的机制(s) ?
cccDNA存活细胞分裂和如何?
什么限制乙肝病毒cccDNA的形成/积累在大多数人类肝癌细胞株,尤其是在小鼠肝细胞?
为什么这对鸭乙肝病毒限制更明显,甚至在人类细胞?
机制(s)防止无限cccDNA放大甚至在鸭乙肝病毒模型系统?这样的机制可以用来减少cccDNA拷贝数?
先进的基因组编辑使用设计师核酸酶115年促使研究利用这些新的针对cccDNA的工具,例如,通过锌指核酸酶,142年,143年转录activator-like内切酶144年定期或RNA-guided集群空间短回文的重复序列(CRISPR) / Cas系统。85年然而,许多问题没有解决,最重要的是有效的访问所有cccDNA的核酸酶分子。具体可以有针对性的,除非cccDNA-bearing细胞核酸酶必须交付给所有肝细胞。脱靶效应,包括染色体整合使直线化病毒DNA,可能影响肝细胞的功能,尤其是长期效应核酸酶的存在是必要的。同时,NHEJ-mediated修复nuclease-induced双边带容易出错,47一小部分维修事件将导致完整cccDNA的改革。不是,至少目前还不清楚RC-DNA过剩在同一个细胞如何影响cccDNA的定位效率。再次,需要更多的研究和有足够的空间供其他策略包括治疗性疫苗接种或反义和RNA-interference-based方法。54
结论和观点
cccDNA的重要性的持久性水库乙肝病毒是牢固确立,所以是意识到,任何战略对慢性乙型肝炎的治疗将必须应对这种长寿的分子。当前知识cccDNA形成和退化仍非常有限,然而尤其是新兴感染细胞培养系统,和小动物感染的可能发展模型,承诺极大地改变这种情况。不过,当前的知识差距是如此之大,许多cccDNA生物学方面是开放的新发现(框2)。,一个神奇的子弹似乎不太可能出现导致cccDNA完全消失;然而,新知识的结合cccDNA生物化学、分子了解人体的免疫系统如何处理cccDNA的间隙期间急性乙型肝炎病毒感染,和新技术对目标DNA操纵承诺实现这一目标。不可或缺的前提是适当的对基本的乙肝病毒研究的资助。新的机会可能来自制药行业的新一轮利益在乙肝病毒。希望尽可能公平、开放的学术界和产业界之间的相互作用将使寻求治疗的慢性乙型肝炎相似的成功对于慢性丙型肝炎。145年
确认
我道歉众多同事的原始的贡献不能或只能部分被引用为空间的局限性。
引用
脚注
调整通知本文已经被修正,因为它第一次在网上发布。本文不再开放。
资金在作者的实验室工作得到了德意志Forschungsgemeinschaft (DFG)通过合作研究单位内的格兰特NA154/12-2 FOR1202(持久性hepatotropic病毒)和由欧盟通过FP7 Infect-ERA计划(项目ID hepBccc)之下。
相互竞争的利益没有宣布。
出处和同行评议委托;外部同行评议。