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胃瘦素与食管炎症和化生的关系
  1. F弗朗索瓦1
  2. J罗珀1
  3. J‧古德曼1
  4. Z裴1
  5. M Ghumman1
  6. M Mourad2
  7. Z·奥利瓦雷斯·德·佩雷斯1
  8. 克我Perez-Perez1
  9. 碳氢键曾1
  10. 布莱塞M J1
  1. 1
    纽约大学医学院,纽约,纽约,美国
  2. 2
    加州大学旧金山分校,美国加州旧金山
  1. F Francois博士,弗吉尼亚州纽约港医疗保健系统消化内科(11132N),美国纽约州10010,纽约东23街423号;fritz.francois在}{med.nyu.edu

摘要

背景:胃食管反流病并发症可能反映了保护因素和伤害因素之间的不平衡。瘦素通过影响细胞生长,可能影响食管粘膜稳态。

目的:确定瘦素受体是否存在于食道中,血清或胃瘦素水平是否与食道炎症和化生相关。

方法:从上段内窥镜检查的患者中,从胃和远端食管中获得活检,并收集血清样本。患者被分为正常食管、炎症食管和巴雷特食管。对有代表性切片进行定量免疫组化,用特异性免疫分析法测定血浆和胃活检标本中的瘦素水平。

结果:在269名参与者中,有105人是同性恋幽门螺杆菌消极的。88例完全食管活检的患者中,44例正常,24例炎症,20例巴雷特食管。瘦素受体在食管上皮细胞上高度表达,三种情况下的密度和染色模式相似,血浆和胃窦瘦素水平无显著差异。与正常(126 (78-221)pg/mg)或炎症(114 (76-195)pg/mg)食管相比,Barrett患者食管底瘦素水平(中位数202(四分位范围123-333)显著升高(p = 0.01)。在多变量分析中,眼底瘦素每增加两倍,患巴雷特氏症的几率比正常食管高3.4倍(95% CI 1.5 - 7.6)。

结论:瘦素受体在食管上皮细胞上的表达为瘦素介导的信号转导提供了途径。胃瘦素产生的变化可能有助于食管愈合和化生进展的差异。

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胃食管反流病在西方人群中已成为一种高度流行的疾病。1虽然胃灼热是胃食管反流病的一个标志,但它的存在并不能预测食管粘膜损伤。胃食管反流病相关的并发症(食管炎、巴雷特食管和食管腺癌)是由于暴露于酸、胃蛋白酶和胆汁等有害元素与食管上皮保护机制之间的不平衡所致。2

胃食管反流病患者的食管黏膜损伤与胃酸产生的增加没有直接关系,3.但食管暴露于反流胃内容物的时间长短有助于胃-食管反流疾病后遗症的发展。4尽管食管上皮细胞的增殖和恢复对限制酸性胃蛋白酶暴露后的糜烂至关重要,5增生导致化生上皮细胞增加致癌风险。尽管唾液表皮生长因子(EGF)刺激食道修复,6其他管腔肽在食管上皮内稳态中的作用尚未被研究。

瘦素是一种含有167个氨基酸的激素产物。ob)基因,7主要由脂肪细胞产生,在调节食欲和能量平衡中起作用。8瘦素及其受体(ob-R)均由胃上皮表达。9瘦素可以抑制大鼠胃溃疡的形成,10并刺激食道腺癌细胞生长1112;胃瘦素因此可能有助于粘膜内稳态和异常增生。瘦素与食道病理生理的关系尚未被研究。

我们假设来自胃的瘦素可能参与维持正常(非炎症)的食管粘膜,或更耐酸的巴雷特上皮。这项研究的目的是评估瘦素受体是否存在于健康和病变组织的人食管黏膜中,并确定循环或胃瘦素水平是否与特定的食管病理有关。自从胃定植幽门螺杆菌与胃食管反流病及其后遗症呈负相关,原因是H幽门地位可能会影响胃瘦素的合成,1314我们在H幽门-阴性的人,因为这类人患食道疾病的风险最高。15- - - - - -18

方法

研究人群

我们采用方便的抽样方法,前瞻性地招募了在VA纽约港医疗系统纽约校区的流动内窥镜单元接受常规上消化道内窥镜检查的或未满18岁的成年人。如果参与者有已知的凝血功能障碍,有食管或胃静脉曲张史,之前做过胃手术,或在报名前一个月接受过皮质类固醇或其他免疫调节药物治疗,则被排除在外。避免混淆与H幽门状态,那些登记的个体在H幽门组织学、培养、血清学或快速脲酶检测也排除在进一步分析之外。病人被认为是H幽门如果血清学和组织检测均为阴性则为阴性。机构审查委员会批准了研究方案,并获得了所有参与者的书面知情同意。

临床评价和标本采集

所有患者在夜间禁食12小时后出现症状。在预定的内窥镜检查之前,医生会进行术前评估,包括病史和体格检查。在研究开始时,由训练有素的采访者通过标准化问卷收集人口统计学和临床信息。参与者自我报告的种族名称为非西班牙裔白人、非西班牙裔黑人、西班牙裔或亚裔。记录每位参与者的身高和体重,身体质量指数(BMI)计算为体重(公斤)除以身高(米)2.胃食管反流病被定义为存在胃灼热或反流,19在入学前4周内至少每周举行一次。行静脉切开术,内窥镜检查时取血15ml。

内窥镜检查

在静脉给予哌哌啶和咪达唑仑后,使用Olympus GIF-130或GIF-160视频内窥镜(Olympus America, Melville, NY)以标准方式进行完整的内窥镜评估。内镜下食管炎按LA分级。20.在进入胃后,立即收集约15毫升的胃分泌物到一个吸阱中测量pH值。悉尼-休斯顿系统的内窥镜方面被用来描述胃炎症。21用标准活检钳从胃窦处获得两份活检,用于快速脲酶检测(Hpfast, GI Supply, Camp Hill, PA)。分别从胃窦、胃底和远端食管鳞状柱连接处上方2cm处进行4次活检。

组织学分析

从三个部位(胃窦、眼底和食管)各取一个活检标本,用10%福尔马林固定,石蜡包埋,5 μm连续切片,进行苏木精和其他组织学染色。一位对临床诊断盲目的有经验的胃肠道病理学家(z.p)解释了所有标本。的存在H幽门采用warthin -星空技术和免疫染色技术进行评估。对食管活检组织进行评估,并按0到3+评分(1)基底层增生;(2)乳头伸长;(3)乳头状血管间隙扩张;(4)嗜酸性粒细胞上皮内浸润;(5)中性粒细胞;(6)粘膜糜烂,如前所述。2223通过将6个评估参数的评分相加,每个活检样本的复合组织学评分从可能的18分中确定。如果出现急性多形核或混合多形核和单核细胞浸润,并伴有上皮糜烂或溃疡,则认为存在食管上皮炎症。24Barrett的食管经组织学检查证实为特化肠化生,如前所述。22阿利新蓝/周期酸-希夫(AB-PAS)染色证实肠化生中存在酸性黏液蛋白杯状细胞。

免疫组织化学分析

免疫组化实验分别采用正常、炎症和Barrett食管4例代表性标本。从每个典型的福尔马林固定石蜡包埋标本中获得3个连续的5 μm切片。简单地说,每组样本同时处理,所有实验至少重复两次。用分级酒精逐级脱蜡。去除内源性过氧化物酶活性,用1:300稀释的针对人瘦素受体(R&D Systems, Minneapolis MN)细胞外结构域的小鼠单克隆抗体将切片置于潮湿的室内孵育30分钟,这种单克隆抗体存在于受体的长(信号)和短(非信号)形式。2526切片与与山羊抗小鼠抗体结合的过氧化物酶标记聚合物孵育30分钟,然后与3 ',3 ' -二氨基联苯胺(DAB)显色剂溶液孵育10分钟(DakoCytomation, Carpinteria, CA)。胃底组织作为阳性对照27瘦素受体和瘦素免疫反应性。由于没有信号,一抗的遗漏被用作阴性对照。切片使用尼康ECLIPSE E600显微镜(尼康,日本),使用10×、20×和40×物镜进行观察,图像使用SPOT INSIGHT™数字彩色相机,3.2.0型(Sterling Heights, MI)获取。对保存为tiff文件的数字捕获彩色图像进行免疫反应性定量,并使用ImageJ 1.37 (http:/rsb.info.nih.gov/ij)进行分析。28在减去非白色背景色后,使用颜色反褶积将苏木精组分从DAB组分中分离出来29图1 a - c).使用柯达21步灰度片进行光密度校准,密度范围为0.05-3.05。对于每个样本,从DAB组件中选择的8个人工识别的阳性染色细胞(与原始图像进行目视比较)测量的最低和最高平均光密度(MOD)值用于手动设置整个样本染色密度量化的阈值(图1 d).测量每张图像的染色面积百分比和MOD,并采用单因素方差分析(ANOVA)对三组食管标本进行比较。

图1 用ImageJ定量免疫组化检测瘦素受体。彩色反褶积和阈值的10×数字图像的浅层和基底层标本,从内窥镜和组织学正常的食道。在剥离非白色背景的原始数字图像(A)后,使用颜色反褶积将苏木精成分(B)与3’,3’-二氨基联苯胺(DAB)成分(C)分离。从DAB分析中选取的8个阳性染色细胞的最小和最大平均光密度值用于手动设置阈值(D),用于样品光密度测量。A组和D组的比较表明瘦素受体在食管上皮的浅层和基底层均有表达。

组织和血浆瘦素的测定

活检样本测量8毫米3.在磷酸盐缓冲盐水(PBS)缓冲液中冲洗并均质。使用ELSIA (R&D系统)测量匀浆中的瘦素,并基于活检蛋白(pg/mg蛋白)进行归一化。广泛的描述,30.31同样的方法也用于测定空腹血瘦素水平。根据生产商的说明,该检测方法的井与井之间的差异为3.0-3.2%,最小可检测水平为7.8 pg/ml。所有测试都至少重复进行。

统计分析

内窥镜和组织学检查结果允许将患者分为三类进行进一步分析:无食管病理(正常)、炎症或巴雷特食管。正常上皮定义为内镜检查无可见糜烂或鲑鱼色粘膜,组织学检查无基底细胞增生、拉长乳头或细胞浸润。如前所述,如果存在细胞浸润,根据LA分级,内镜检查有或无可见糜烂,则认为存在炎症上皮。20.Barrett食管被定义为在内镜下食管远端观察到的任意长度的鲑鱼色上皮,组织学检查证实为特化肠上皮。综合胃瘦素通过计算胃窦和胃底平均瘦素浓度测定。在分析临床胃食管反流病时,美国胃肠病学会的标准19被使用。采用方差分析方法、Kruskal-Wallis或Mann-Whitney U检验对连续变量进行比较。数据用平均值(SD)、中位数和四分位区间(IQR;25 th - 75)。分类变量比较采用χ2耶茨校正法或费雪精确法。计算瘦素- bmi和瘦素- mod的Spearman相关系数。对对数转换数据进行多变量回归分析,以控制可能的混杂因素(年龄、种族、BMI、质子泵抑制剂(PPI)的使用和胃pH值)。使用SPSS 11.0.4版本的Macintosh (SPSS Inc., Chicago, IL)进行统计分析,双尾p值<0.05被认为具有统计学意义。

结果

患者人口统计和临床特征

在269名受试者中,164人(61%)检测呈阳性H幽门图2)和活检足以分析133例。剩下的105个H幽门在阴性个体中,17人的食管活检标本不足,本研究剩下88名受试者。其中,44例没有食管病理(正常),24例有炎症上皮,20例有巴雷特上皮。正常食管组也没有胃溃疡或肿块的证据。炎症食管组1例为LA A级,1例为LA D级食管炎。巴雷特上皮的患病率(在269名入选受试者中占13.6%,在88名研究受试者中占22.7%)与其他已发表的报告一致。3233Barrett的平均长度为3.8 (2.8)cm。相比之下,巴雷特的患病率为22.7%H幽门-阴性受试者,只有7.5%H幽门-阳性受试者发生Barrett 's(比值比(OR) = 0.28 (0.12-0.62), p = 0.002)。按计划,H幽门-阳性个体被排除在进一步分析之外。

图2 研究参与者的登记和分类。

内镜检查最常见的指征是正常组的血阳性大便,食管炎症组的缺铁性贫血和Barrett’s组的不典型增生评估。三组患者在年龄、体重指数、胃灼热发生率和胃液pH值上无显著差异(p < 0.05)。表1).与食管正常或炎症的受试者相比,有Barrett上皮的白种人和使用PPIs的患者明显更多。排除所有接受PPI治疗的患者后,正常食管、炎症食管和巴雷特食管的胃中位pH值无显著差异;2.0(1.0 - -5.0), 2.0(1.0 - -2.5)和1.0(1.0 - -2.5),分别,p = 0.24。正如预期的那样,与食管炎症(p = 0.004)和巴雷特食管(p = 0.013)相比,正常受试者的炎症组织学得分中位数明显较低,这与损伤谱(两两方差分析比较)一致。

表1 根据食管粘膜状况,88例研究患者的人口学和临床特征

瘦素和瘦素受体表达

正如所料,9在胃底标本的主要细胞和壁细胞中观察到瘦素受体的表达(图3 b),作为进一步研究的阳性对照。在食管上皮中,瘦素受体在浅层和底层均有免疫反应性(图1),浅层染色强度增强,顶端和基底侧膜均呈弥漫性染色。定量免疫组织化学(图3 d-f)比较正常食管、炎症食管和Barrett食管瘦素受体的表达。根据食道状态(正常,1 486 984 (107 167);发炎,1 377 981 (212 304);巴雷特,1 279 999 (261 594)(p = 0.42))。巴雷特氏上皮样本中显示瘦素受体阳性的平均百分比区域(11%(2%))较正常上皮(5%(2%))和炎症上皮(4%(1%)有较高的趋势(图3 d-f),但差异无统计学意义(p = 0.19)。瘦素受体免疫组化MOD在正常(0.68(0.04))、炎症(0.68(0.08))和巴雷特上皮(0.76(0.08))之间无显著差异(p = 0.67)。总的来说,这些结果表明,在三种评估条件下,瘦素受体表达在食管的所有层,密度相似。在平行研究中,使用产生瘦素的胃组织作为阳性对照(图3),我们检查了食道上皮是否为瘦素的来源。正常、炎症或巴雷特食管中均无瘦素蛋白的免疫反应性。这一结果表明,尽管瘦素受体表达在食道的顶端和基底外侧表面,但它们的配体瘦素却起源于其他地方。

图3 胃(A-C)和食道组织(D-G)中存在瘦素和瘦素受体。组织进行瘦素(A)和瘦素受体(B, D-F)免疫组化染色。C图显示了瘦素或瘦素受体一级抗体缺失的结果。图示食管标本来自正常食管(D)、炎症食管(E)和巴雷特食管(F)。阿利新蓝/周期性酸性希夫(PAS)染色用于确认肠化生中含酸性黏液蛋白杯状细胞的存在(G)。图A、B和D - F与来自ImageJ的光密度结果(红色)叠加。所有样品均用苏木精反染;原放大倍数40× (A-C)和10× (D-G)。

血浆瘦素,胃灼热和食道病理

由于胃食管反流疾病的风险与肥胖有关,34脂肪组织储存的脂肪通过血浆瘦素反映出来,35我们接下来讨论血浆瘦素是否可能与反流疾病的症状或组织学证据相关。正如所料,35在88名研究对象中,血浆瘦素与BMI显著相关(r = 0.59, p<0.0001)。中位瘦素水平(pg/ml)在PPI使用者(5562 (IQR 1921-8467)比未使用PPIs者(2355 (IQR 1195-5770);(p = 0.06)), Mann-Whitney U检验。血浆瘦素水平与胃灼热症状的存在、严重程度或持续时间无关。正常食管(中位数5136 (IQR 1653-7103) pg/ml)、炎症食管(3155 (IQR 1969-7057) pg/ml)和巴雷特食管(3130 (IQR 742-8142) pg/ml之间血浆瘦素的分布也无显著差异;(p = 0.67))图4).从这些结果中,我们得出结论,尽管正如预期的那样,血浆瘦素反映了脂肪的储存,但其水平与胃食管反流疾病的症状或病理无关。

图4 根据正常、发炎或巴雷特食管的存在,比较88名受试者的瘦素水平。受试者的瘦素值显示在血浆(A)、胃窦(B)和胃底(C)中。与血浆和胃窦水平相比,三组间胃底瘦素水平有显著差异(p = 0.01, Kruskal-Wallis检验)。

胃瘦素,胃灼热和食道病理

由于瘦素受体存在于食管远端,但没有内源性瘦素产生,我们研究了胃源性瘦素水平是否与胃食管反流病及其后遗症相关。尽管在胃分泌物中检测到少量瘦素的存在,36我们无法在胃液中重复测定基础瘦素。由于胃中大多数产生瘦素的细胞位于酸咽腺,9我们比较了咽腺区(眼底)的瘦素水平,也检查了幽门腺区(胃窦)作为对照。胃窦瘦素与BMI呈微相关关系(r = 0.23, p = 0.024),而胃底瘦素与BMI呈较强但中度相关(r = 0.38, p<0.001);胃窦和胃底瘦素水平均不因PPI的使用而显著差异(表2).

表2 根据质子泵抑制剂(PPI)的使用情况,88名受试者的血浆、胃窦和眼底瘦素水平

胃灼热症状的存在、严重程度和持续时间与胃底或胃窦瘦素水平无关。然而,整合胃瘦素(眼底和胃窦)与食道瘦素受体表达的平均光密度密切相关(r = 0.66, p = 0.039) (图5).食管正常、炎症或巴雷特氏症患者的胃窦瘦素水平无显著差异(p = 0.46) (图4).然而,与正常组(126 (IQR 78-221))或食管炎症组(114 (IQR 76-195))相比,Barrett食管患者胃底瘦素(pg/mg)水平显著升高(中位数202 (IQR 123-333), p = 0.01 (图4).当数据根据患者年龄、种族、BMI、PPI使用情况和胃pH值(表3).拟合优度检验为可接受模型,χ2= 143.8, p = 0.67。这些数据可以解释为,与正常食管相比,眼底瘦素每增加两倍,患Barrett食管的几率就增加3.4倍(95%可信区间1.5 - 7.6)。表3).从这些结果中,我们得出结论,胃瘦素水平与食道瘦素受体表达相关(图5),并发现基底瘦素水平与巴雷特食道的风险相关。

图5 10名受试者的胃整体瘦素(眼底和胃窦)与食管瘦素受体平均光密度的相关性(r = 0.66, p = 0.039)。
表3 多变量分析中食管粘膜状态与基底瘦素的关系

讨论

胃返流:所有人都会发生的胃内容物返流到食道3738可损害食管上皮细胞,并可能引起症状和长期损伤。然而,食道暴露于酸和胃蛋白酶的后果也取决于粘膜上皮的防御,39包括限制酸扩散到细胞间隙的细胞间紧密连接。40这些连接的破坏会影响上皮组织的细胞间和细胞质缓冲能力以及随之产生的细胞活力。41食管中的上皮修复主要依赖于细胞复制,42在基底细胞受体通过受损的紧密连接进入细胞间隙后,由与基底细胞受体结合的生长因子刺激。43人们认为存在于食道腔内的唾液EGF和其他肽生长因子在食道炎和巴雷特化生的修复中发挥作用,但研究结果相互矛盾。564445

在目前的研究中,我们探讨了远端食管粘膜病理与瘦素水平的关系,瘦素是一种肽激素,参与影响能量稳态和组织修复的多种细胞和代谢功能。846胃粘膜的主要细胞,以及许多其他部位,分泌瘦素。93647在胎儿发育的7 - 9周期间,瘦素受体出现在所有胃肠道器官中,而正常成人食管中仍有粘膜表达,48胃,9小肠49和结肠癌。50

由于瘦素也是胃生长因子,51小肠,52结肠5354和培养的食管上皮细胞,11它可能在体内具有类似的增殖生理作用。内源性和外源性给药的瘦素都能保护大鼠免受非甾体抗炎药(NSAIDs)或酒精引起的粘膜损伤5556支持瘦素可能对胃肠道粘膜起保护作用的假说。尽管有这些细胞保护作用,5556瘦素还能诱导肿瘤细胞增殖1157;这些看似完全不同的发现表明,瘦素的生理作用可能取决于其他宿主或环境因素。

我们现在发现,瘦素受体存在于成人食管远端上皮的所有层中,无论该组织是否正常、炎症或柱状细胞化生。这些发现表明,瘦素受体的差异表达不是与观察到的病理发展相关的主要因素,但提示食道细胞,无论正常或受伤,可能有一个途径转导存在于食道腔内的瘦素分子信号。由于目前的抗体不能区分瘦素受体的长(信号)和短(非信号)形式,未来的研究将需要解决这个问题。

我们认为瘦素的全身作用可能延伸到食管上皮。血浆瘦素水平反映脂肪储存,1335BMI和巴雷特食道之间也有正相关的报道58和食管腺癌。5960我们研究的大多数受试者超重,在三个试验组之间没有显著的BMI差异,也没有显著的血浆瘦素差异。因此,我们的研究结果不支持血浆瘦素水平与食管远端粘膜状况之间的任何联系。由于瘦素是在胃中产生和分泌的,并且在胃回流液中发现了瘦素,36我们接下来研究了胃上皮瘦素水平的差异是否与食管组织状态相关。为了尽量减少偏差,我们进行了排除H幽门在目前的研究中-阳性的受试者,因为我们发现在H幽门阳性的人与阴性的人相比H幽门消极的;58 (25-157) pg/ml vs 94 (58 - 178) pg/ml;p = 0.04。61Barrett食管患者胃底瘦素水平明显高于正常或炎症上皮的患者,提示食管远端暴露于反流酸和高瘦素的结合可能导致粘膜增生。我们观察到胃瘦素的相关性并不反映BMI,因为BMI值在三组中是相似的,而是代表局部影响。瘦素作用于全身和局部的概念与显示胃粘膜和血浆瘦素水平之间分离的数据一致。1314数据表明,瘦素诱导的细胞增殖可能有助于修复食管上皮炎症,或可能导致Barrett食管的进展,这取决于宿主环境62图6).

图6 提出了胃瘦素水平与食管病理发展关系的途径。

另一种可能性是胃酸瘦素水平的升高继发于巴雷特化生的发展,与BMI无关。这种解释需要巴雷特上皮:(1)是瘦素的来源;(2)刺激基底上皮产生更多的瘦素;或(3)巴雷特氏上皮和基底上皮的组织事件都反映了独立的初级过程。虽然我们的横断面研究不是为了解决这些可能性,但在巴雷特氏粘膜中没有检测到瘦素,这为第一种可能性提供了证据。第二种可能性是一氧化氮合酶在巴雷特氏上皮细胞中过度表达63增加一氧化氮,一种主要细胞的已知刺激物,964胃瘦素的主要来源。食管上皮和胃上皮之间的旁分泌通讯应进一步探讨。

我们的研究结果受到了在退伍军人医疗中心的研究安排的限制,在那里,大多数被评估的患者是接受多种药物治疗的老年男性,限制了可泛化性,并使用了横断面研究设计,限制了可以得出的推论。大多数Barrett患者为白种人,与美国的流行病学一致。65这三组患者并不完全匹配,因为接受PPI治疗的巴雷特患者明显更多。此外,炎症组的大多数受试者有显微镜下的炎症,而不是肉眼可见的食管炎。该研究的优势包括从前瞻性登记队列中收集详细的人口统计学和临床数据,确定H幽门状态使用多个标准,提高了灵敏度66减少因假阴性检测、对所有患者进行活检(无论临床或内镜检查结果如何)、使用定量免疫组化技术以及纳入既无炎症也无Barrett食管的组而引起的混淆。

总之,我们的研究表明瘦素受体在食管远端上皮中表达,无论疾病状态如何,这表明瘦素受体对瘦素介导的信号转导有反应。Barrett’s化生和食管炎症与胃瘦素水平存在差异相关,这与食管病理沿着不同的炎症(食管炎)或增生性(Barrett’s)途径发展的模式一致(图6)由Fass和Ofman提出,67而不是沿着炎症到化生的过程发展。其他研究也支持胃酸反流后的分支病理途径。6869无论如何,我们的结果表明胃瘦素的调节可能在巴雷特化生的进展中起作用。

致谢

部分由美国国立卫生研究院的K23CA107123和R01GM63270以及美国胃肠病学学院的临床研究者研究基金支持。我们感谢纽约大学医学院胃肠病学学部的同事和护士们的支持。

参考文献

脚注

  • 利益冲突:一个也没有。

相关的文章

  • 消化
    罗宾史 Emad M El-Omar