条文本
PDF
摘要
背景:Barrett食管是一种与食管腺癌(ADCA)发展风险增加相关的恶性前病变。先前的研究表明，氧化损伤有助于ADCA的发展。
摘要目的:验证反流液的两种成分胆汁酸和胃酸可诱导氧化应激和氧化性DNA损伤的假说。
方法:用8-羟基脱氧鸟苷(8-OH-dG)抗体染色不同程度发育不良的Barrett食管组织，评估氧化应激。在对照培养基和酸化至pH值为4并添加0.5 mM胆汁酸鸡尾酒的培养基中孵育10 min的Barrett食管组织中测定8-OH-dG的水平。此外，将三种食道细胞系(Seg-1细胞、Barrett食管细胞和ht - 1a细胞)暴露于对照培养基、含有0.1 mM胆汁酸鸡尾酒的培养基、酸化至pH值4的培养基以及pH值4添加0.1 mM胆汁酸鸡尾酒的培养基，并评估其对活性氧(ROS)的诱导作用。
结果:免疫组化分析显示8-OH-dG主要在发育不良Barrett食管上皮细胞中形成。重要的是，巴雷特食管组织与胆汁酸鸡尾酒和酸的结合孵育导致8-OH-dG的形成增加。暴露于ph4和胆汁酸鸡尾酒后，食道细胞中ROS增加。
结论:短时间暴露于胆汁酸和低ph值可在食道组织和细胞中诱导氧化应激和氧化DNA损伤。这些改变可能是巴雷特食管和肿瘤进展的基础。
- CMXRos, Chloromethyl-X-Rosamine
- DCA,脱氧胆酸
- 胃食管反流病
- 他,hydroethidine
- HGD,高档发育不良
- 乐金显示器,低度发育不良
- 8-OH-dG, 8-hydroxy-deoxyguanosine
- MMP，线粒体膜电位
- ND, non-dysplastic
- PBS,磷酸盐
- ROS，活性氧
来自Altmetric.com的统计
- CMXRos, Chloromethyl-X-Rosamine
- DCA,脱氧胆酸
- 胃食管反流病
- 他,hydroethidine
- HGD,高档发育不良
- 乐金显示器,低度发育不良
- 8-OH-dG, 8-hydroxy-deoxyguanosine
- MMP，线粒体膜电位
- ND, non-dysplastic
- PBS,磷酸盐
- ROS，活性氧
Barrett食管是一种与胃食管反流病(gold)相关的恶性前病变，正常的鳞状上皮被含有杯状细胞的柱状肠样上皮所取代。重要的是，Barrett食管与食管腺癌的发生密切相关。1 -3.这种癌症患者预后较差，中位生存时间<1年。4然而，Barrett食管和食管腺癌发生发展的机制尚不清楚。
据推测，化生柱状上皮是对回流液诱导的应激反应而形成的。胃酸和胆汁酸似乎是巴雷特食管发展的两个主要危险因素。5，6临床研究已确定糖胆酸、牛磺胆酸、糖脱氧胆酸和糖鹅脱氧胆酸是出现在GORD患者食道中的主要胆汁酸。7 -9毒性更大的非结合胆汁酸，如脱氧胆酸(DCA)，通常是由结肠细菌作用于初级胆汁酸而形成的。有趣的是，DCA也出现在Barrett食管患者的返流中。5服用质子泵抑制剂的患者胃细菌过度生长的发生率明显更高，因此，增加非结合胆汁酸的浓度，包括DCA。10胆汁酸诱导线粒体改变，11 -13氧化应激11，12，14，15和DNA损伤。14 -16我们还发现，线粒体的扰动可导致细胞凋亡抗性。13此外，胃酸和胆汁酸可能改变信号通路。低pH值和/或胆汁酸诱导环加氧酶2和前列腺素E的表达2激活细胞外信号调节激酶、p38丝裂原激活蛋白激酶和核因子-κB通路，这些通路与食管细胞增殖增加和凋亡减少有关。17 -21
先前的研究表明氧化损伤有助于食道腺癌的发展，22摄入更多的抗氧化剂，如维生素C、β-胡萝卜素和α-生育酚，与降低食道腺癌的风险有关。23日,24尽管反流在巴雷特食管发病机制中的重要性，但尚无研究评估低pH值和胆汁酸对食管细胞或人类活检标本中活性氧(ROS)产生的直接影响。
由于反流疾病是巴雷特食管发展的主要危险因素，我们测试了暴露在低pH值环境下，结合胆汁酸，诱导氧化应激的假设。我们使用来自不同级别的Barrett食管不典型增生和食管细胞的人食管活检标本来验证这一假设。活检标本也在酸化至pH值为4的培养基中培养，并添加胆汁酸鸡尾酒。我们发现Barrett食管组织，特别是发育不良组织，处于氧化应激增加的状态下，胃酸与胆汁酸结合可诱导氧化性DNA损伤。我们的结果表明胃酸和胆汁酸在巴雷特食管的发病机制中起着中心作用。
材料和方法
来自患者的组织活检标本和体外培养
本研究共纳入45例不同程度发育不良的Barrett食管患者。内镜活检标本、食管鳞状黏膜和十二指肠均取自正在接受监护的Barrett食管患者。患者为41-83岁男性。经美国亚利桑那州图森市亚利桑那大学人体实验机构委员会批准，患者给予书面知情同意。活检标本立即固定在10%缓冲福尔马林。经H&E和阿利新蓝(pH 2.5)染色确定杯状细胞后，Barrett食管组织学定义为含有杯状细胞的肠样上皮。由两名病理学家独立评估异型增生的等级。
在pH值为4和胆汁酸鸡尾酒体外培养后，对10例患者的额外活检标本进行了氧化DNA损伤诱导的评估。在本系列中，我们有10例非发育不良(ND) Barrett食管患者。每个患者的两个活检标本立即在添加10% (vol/vol)热灭活胎牛血清的最低必要培养基中洗涤(Omega Scientific, Tarzana, California, USA)， pH 7.4, 2mml-谷氨酰胺，5 mM HEPES (N ' -2-羟乙基哌嗪-N ' -乙磺酸)，1 mM非必需氨基酸(Sigma Chemical Co, St Louis, Missouri, USA)，青霉素(100 U/ml)和链霉素(100 μg/ml)。然后，活检标本在对照培养基或酸化至pH值为4并添加0.5 mM胆汁酸鸡尾酒的培养基中，在37°C和5% CO中体外培养10分钟2．2510分钟后，用培养液清洗组织，然后在培养液中再孵育170分钟。之前，我们用不同的时间点进行了几次实验，发现在孵育3 h后，组织在组织学上保持相对正常(数据未显示)。然而，较长的潜伏期诱导上皮细胞脱落和死亡。因此，3 h时间点被选为本试验的最佳条件。孵育后，活检标本固定并包埋于石蜡中进行组织学评估和免疫组化研究。此外，每个患者的一个活检标本立即固定在10%缓冲福尔马林中。
细胞系和化学物质
人食管腺癌Seg-1细胞系由David Beer博士(密歇根大学，安娜堡，密歇根，美国)提供。Seg-1细胞常被用作研究暴露于低pH值和胆汁酸后Barrett食管和Barrett食管相关信号通路的模型细胞系。Seg-1细胞在D-MEM培养基(Gibco, Carlsbad, California, USA)中培养，添加10% (vol/vol)热灭活牛血清(Hyclone Laboratories, Logan, Utah, Logan)， 2mml-谷氨酰胺、青霉素(100 U/ml)和链霉素(100 μg/ml)。ht - 1a细胞由Curtis C Harris博士(美国马里兰州贝塞斯达国家癌症研究所)提供。ht - 1a是一种通过转染猴病毒40t抗原早期区基因而获得永生的人食管上皮细胞系。这些细胞保持上皮形态，细胞角蛋白13染色阳性，在无腺裸鼠中>12个月保持非致瘤性。26细胞在无血清的BRFF-EPM2培养基中(美国马里兰州巴尔的摩Athena环境科学公司)，添加50 μg/ml庆大霉素和0.25 μg/ml两性霉素B. Barrett食管cpd细胞通过hTERT(人类端粒酶逆转录酶催化亚基)转染，由Peter Rabinovitch博士(美国西雅图华盛顿大学Fred Hutchinson癌症研究中心)提供。细胞培养在MCDB 153培养基中，添加5%胎牛血清(Hyclone Laboratories)， 20 ng/ml表皮生长因子(R&D Systems, Minneapolis, Minnesota, USA)， 140µg/ml牛垂体提取物(Sigma)， 10 mM霍乱毒素(Sigma)， 0.4 μg/ml氢化可提松(Sigma)， 20 μg/ml腺嘌呤(Sigma)， 5µg/ml胰岛素，5µg/ml转铁蛋白和5 ng/ml硒(Sigma)， 4 mMl-谷氨酰胺，100 U/ml青霉素(Gibco)， 100 μg/ml链霉素(Gibco)， 7.5% wt/vol碳酸氢钠(Gibco)和0.25 μg/ml两性霉素B (Gibco)，如上所述。27所有细胞株在37℃、5% CO中生长2纤维连蛋白-胶原蛋白底物(BRFF, Ijamsville, Maryland, USA)。
制备胆汁酸鸡尾酒，由糖胆酸、牛磺胆酸、糖脱氧胆酸、糖鹅脱氧胆酸和DCA等摩尔混合钠盐组成。根据Kauer的研究，这种鸡尾酒反应了胃食管反流过程中通常暴露在食管远端的胆汁酸混合物等，8Nehra等5和Theisen等．10五种胆盐的浓度均为0.02 mM，总胆汁酸浓度为0.1 mM。该鸡尾酒在pH值为4或pH值为7.4的培养基中完全溶解，不形成沉淀物。
MitoSOX Red, MitoTracker Red, hydroethidine (HE)， YOYO-1和Hoechst 3222是从分子探针(Eugene, Oregon, USA)中获得的。除特别注明外，所有其他化学品均具有最高纯度，并从西格玛化学公司获得。
免疫组织化学染色
需要一种专门的免疫组化技术来检测8-羟基脱氧鸟苷(8-OH-dG)的特异性核染色。石蜡切片脱蜡、复水，置于3%过氧化氢中30分钟，用去离子水冲洗。为打开染色质，将载玻片在4 N HCl中浸泡20 min，用水冲洗，然后放入0.1 M硼砂中冲洗5 min，然后在水中冲洗两次。玻片在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中浸泡5分钟，然后在2%的马血清中孵育1小时。加入2%牛血清白蛋白/PBS制备的8-OH-dG单克隆抗体(2 μg/ml, QED Bioscience, San Diego, California, USA)，冷冻过夜。PBS冲洗三次后，二次生物素化抗小鼠IgG抗体(1:400,Dako, Carpenteria, California, USA)应用30分钟。PBS冲洗后，应用维他汀ABC试剂和二氨基联苯胺。切片用苏木精反染色。小鼠免疫球蛋白2每次实验均例行进行免疫控制。
我们实验室常规使用一种简单的分级系统(0 - 3)，基于上皮细胞核的染色强度，用于对Barrett食管腺中8-OH-dG的表达水平进行分级(0,0 - 5%细胞染色;1.5 - 30%细胞染色;2、30-60%细胞染色;3、>60%细胞染色)。染色由三位有经验的研究者独立评估。在我们的孵化研究中，我们使用数字图像分析系统来量化Barrett食管腺的阳性和阴性染色核。使用尼康E400明场显微镜观察Barrett食管腺的图像，并使用索尼DXC-390彩色摄像机捕捉图像。每张幻灯片上的Barrett食管腺体(平均8(2)个腺体，范围5-13个腺体)使用Media Cybernetics Image Pro V.4.5.1软件(Media Cybernetics, Silver Spring, Maryland, USA)进行分析。条件、亮度、滤光片和曝光量最初都进行了调整，以优化图像的亮度和对比度。一旦建立，设置保持不变，以比较活检标本。
荧光显微镜下，细胞在载玻片上生长，用4%甲醛固定，100%甲醇渗透，用一抗孵育，如上所述。接下来，Alexa Fluor594二抗(1:100;分子探针(Molecular Probes)作用60 min。然后用50 μg/ml RNase处理1 h，以消化RNA。细胞核用YOYO-1(分子探针)反染色，载片用VectaShield HardSet安装介质覆盖(Vector Laboratories, Burlingame, California, USA)。使用适当的过滤器评估8-OH-dG的表达。
氧化应激的测定
用线粒体超氧化物指示剂MitoSOX红染色评价食道细胞的氧化应激。将细胞暴露于对照培养基或pH调整为4和/或添加0.1 mM胆汁酸鸡尾酒的培养基中。处理后，用正常培养基洗涤2次。在荧光显微镜研究中，细胞用5 μM MitoSOX Red孵育15分钟，然后用10 μM Hoechst 33342-a细胞专用染料孵育5分钟，染色细胞核。为了证实这些数据，Seg-1细胞还与HE(一种非荧光染料，主要由超氧化物ROS氧化)一起孵育。Seg-1细胞经上述处理后，用2 μM HE在无血清培养基中孵育30 min，再用10 μM Hoechst 33342孵育5 min。使用尼康TE300荧光显微镜和数码相机拍摄活细胞图像，数码相机配备了针对个别染料的适当滤光片。使用Image-Pro Plus软件(Media Cybernetics)捕获数字图像。
在流式细胞术中，Seg-1细胞经胰蛋白酶化后，用5 μM MitoSOX Red在37°C下染色15分钟。28实验进行了三次重复，收集了至少10000个事件。使用BD FACScan流式细胞仪(BD Biosciences, San Jose, California, USA)分析MitoSOX Red的荧光强度，激发波长为488 nm，发射波长为620 nm。数据以图表的形式表示，显示了MitoSOX Red在各种处理后与对照培养基处理后的细胞染色阳性百分比。
线粒体膜电位的测定
在pH值4和/或胆汁酸鸡尾酒处理后，评估Seg-1细胞线粒体膜电位(MMP)的变化。在这些研究中，使用了亲脂性阳离子染料MitoTracker Red氯甲基- x - rosamine (CMXRos)，它集中在完整的线粒体中，基于MMP，以及流式细胞术和共聚焦显微镜。29共聚焦显微镜下，细胞用正常培养基处理后洗涤，在37°C下用200 nM CMXRos孵育30分钟。然后将细胞固定，用4 ' -6-二胺基-2-苯林多染色以识别细胞核，并使用适当的激光进行荧光显微镜评估(尼康PCM 2000;尼康，梅尔维尔，纽约，美国)。如前所述，用流式细胞仪对细胞进行分析。28用0.5 mM去氧胆酸钠处理3 h的细胞作为MMP降低的阳性对照。
用亮场显微镜定量细胞凋亡
在凋亡研究中，Seg-1细胞在对照培养基或pH调整为4和/或添加0.1 mM胆汁酸鸡尾酒的培养基中处理10分钟。然后将细胞洗涤并在对照培养基中孵育24小时，胰蛋白酶化，使用Cytospin 2(山东，赛默飞世尔科学公司，沃尔瑟姆，美国马萨诸塞州)将细胞纺丝到载玻片上，用100%甲醇固定2分钟，风干并用吉姆沙染色。如前所述，使用亮场显微镜(100×油浸)评估200个细胞的凋亡情况。30.鉴定凋亡细胞的标准包括染色质凝结、凋亡小体形成和细胞收缩。31
统计分析
采用列联表方法分析8-OH-dG染色强度与发育不良程度的关系(表1)。基于有序列联表的Cochran-Mantel-Haenszel统计进行显著性检验。这些统计解释了染色的有序水平(0-3)，也可以解释基于不典型增生等级的分类顺序。
流式细胞术数据在95%置信水平下通过方差分析确定统计学意义。我们比较了不同处理后荧光强度的平均倍增增长与对照。所有其他数据均表示为均值(SEM)。两组间的差异比较采用双尾Student 's t检验。
结果
Barrett食管8-OH-dG的表达
使用抗8-OH-dG单克隆抗体的免疫组化染色，我们检查了来自不同级别发育不良的Barrett食管患者的活检标本是否与氧化细胞应激增加有关。8-OH-dG抗体可以识别氧化核苷酸作为DNA氧化损伤的标记。在三组(ND、低级别异型增生(LGD)和高级别异型增生(HGD))中，每组15例患者进行评估。我们还评估了食管鳞状上皮(n = 5)和十二指肠黏膜(n = 5)作为这些标记物表达的对照组织。
与鳞状上皮和十二指肠上皮相比，Barrett食管腺体中8-OH-dG的核染色增加(图1)。在发育不良腺体(LGD和HGD)的上皮细胞中观察到8-OH-dG染色最强和最丰富。在未被诊断为发育不良的Barrett食管患者的ND腺体中发现较弱的8-OH-dG信号。同型匹配的免疫对照未显示任何阳性染色。图1A显示了具有代表性的图像。
8-羟基脱氧鸟苷(8-OH-dG)在不同组织中的免疫组化染色模式。代表性图像见图(A): ND，非发育不良Barrett食管;LGD，巴雷特食管伴低级别发育不良;HGD, Barrett 's食管伴高度发育不良(HGD);NEG CTRL,免疫球蛋白2immunocontrols(负控制);二、十二指肠;平方,鳞状上皮;原来400×放大。小插图显示200倍放大的组织样本。图(B)显示了8-OH-dG在ND Barrett 's食管(n = 15)、Barrett 's食管合并LGD (n = 15)、Barrett 's食管合并HGD (n = 15)、SQ (n = 5)和DUO (n = 5)患者个体活检标本中的表达模式。评分使用了一个简单的评分系统(0-3)。中值用横条表示。
如图1B和表1所示，在三个类别(ND, LGD, HGD;p = 0.046)。
活体活检标本在酸化至ph4的培养基和胆汁酸鸡尾酒中孵育，可增加8-OH-dG的形成，8-OH-dG是DNA氧化损伤的标志
为了检测暴露于低pH值和胆汁酸鸡尾酒后活检标本中是否形成ROS，我们将来自10例患者的成对活检标本在对照培养基或pH值酸化至4的培养基中培养10分钟，并添加0.5 mM胆汁酸鸡尾酒。活检标本用8-OH-dG抗体染色检测DNA氧化损伤。采用Media cybertics Image Pro V.4.5.1软件图像分析，测定Barrett食管腺核阳性染色百分比。在本次体外实验中，与仅暴露于对照培养基的活检标本相比，暴露于ph4和胆汁酸鸡尾酒后，10个活检标本中有8个显示8- oh - dg染色阳性的细胞核百分比显著增加(p<0.05，图2)。相比之下，当样本仅被ph4或胆汁酸鸡尾酒处理时，影响较小，数据不一致。
免疫组织化学染色模式和评价8-hydroxy-deoxyguanosine (8-OH-dG)在巴雷特食管组织暴露于pH值4和胆汁酸(BA)鸡尾酒的活检标本10分钟。巴雷特食管是立即固定(A)或孵化控制介质(B)或中等酸化pH值4,并配以0.5毫米英航鸡尾酒(C)。注意8-OH-dG强烈核染色的上皮细胞与pH值4和BA孵化后的鸡尾酒(C), (D)的百分比在对照培养基(open bar)或酸化至pH值为4并添加0.5 mM BA鸡尾酒(dark bar)的培养基中孵卵10分钟的单个活检标本，Barrett食管腺中8-OH-dG阳性核。星号表示差异显著(p<0.05)。
暴露于ph4和胆汁酸混合物中的食道细胞氧化应激
使用荧光染料MitoSOX Red和HE对暴露于对照培养基、酸化至pH值4的培养基、添加0.1 mM胆汁酸鸡尾酒的培养基、酸化至pH值4并添加0.1 mM胆汁酸鸡尾酒(胆汁酸鸡尾酒和酸的组合)的食管细胞进行氧化应激评估。MitoSOX Red检测活细胞中线粒体衍生的ROS，特别是超氧化物，而HE检测细胞中形成的所有超氧化物。因为这两种染料都不会被其他活性氧或活性氮氧化(http://probes.invitrogen.com/media/pis/mp36008.pdf?id=mp36008)，活性氧/活性氮的总水平可能被低估。
我们使用荧光显微镜和流式细胞术的数据表明，在pH值为4和0.1 mM的胆汁酸鸡尾酒中暴露10分钟的Seg-1细胞经历了线粒体氧化应激(图3)。在胆汁酸鸡尾酒和酸的组合处理10分钟的细胞中，荧光显微镜检测到MitoSOX Red的强烈信号(图3A)。相比之下，在未处理的对照细胞或单独使用ph4或单独使用胆汁酸鸡尾酒处理的细胞中，发现了低信号。当细胞进行流式细胞仪检测时，我们发现胆汁酸鸡尾酒和酸联合处理后，荧光强度显著增加(p<0.05，图3C)。当细胞单独用ph4或0.1 mM胆汁酸鸡尾酒处理时，荧光强度未检测到显著增加(图3b,C)。此外，我们还研究了长期单独暴露于胆汁酸鸡尾酒或单独暴露于pH 4是否会诱导氧化应激。尽管长时间暴露在胆汁酸鸡尾酒或pH值为4的环境中(20和30分钟)，但只有胆汁酸鸡尾酒和酸的结合才会导致线粒体氧化应激，如MitoSOX染色所示(数据未显示)。当我们使用HE时也观察到类似的结果。用荧光显微镜观察的胆汁酸和酸联合处理10分钟的细胞经历了氧化应激，显示出强烈的HE信号(数据未显示)，而未处理的对照组细胞或单独使用ph4或单独使用胆汁酸鸡尾酒处理的细胞显示出低HE染色。
荧光显微镜和流式细胞术检测ph4和/或胆汁酸(BA)鸡尾酒处理后Seg-1细胞的线粒体超氧化物。Seg-1细胞分别在对照培养基(pH 7.4)、含有0.1 mM BA鸡尾酒的培养基、酸化至pH 4的培养基和酸化至pH 4并含有BA鸡尾酒的培养基中处理10分钟。然后用5 μM MitoSOX Red对细胞进行清洗和染色，测量线粒体超氧化物(红色信号)。对于荧光显微镜，细胞也用10 μM Hoechst 3222染色，以可视化细胞核(蓝色信号，A)。流式细胞术的数据显示在面板(B)和(C)中。图表显示流式细胞术测量的三份MitoSOX红染色阳性的细胞百分比(B)。直方图表示将MitoSOX转化为荧光染料的细胞百分比(C)。误差条表示扫描电镜。* p < 0.05。
此外，我们利用8-OH-dG单克隆抗体免疫组化分析，评估了Seg-1细胞暴露于pH值为4和/或0.1 mM胆汁酸鸡尾酒10分钟后的DNA氧化损伤。单用胆汁酸鸡尾酒或单用ph4处理的细胞均未检测到8-OH-dG的信号。然而，8-OH-dG的强烈信号主要出现在胆汁酸鸡尾酒和酸联合处理的Seg-1细胞的细胞质中，这表明该处理主要诱导线粒体DNA的氧化损伤(图4)。
用荧光显微镜观察ph4和/或胆汁酸(BA)鸡尾酒剂处理Seg-1细胞后8-羟基脱氧鸟苷(8-OH-dG)的免疫组化染色模式。Seg-1细胞分别在对照培养基(pH值7.4)、含有0.1 mM BA鸡尾酒的培养基、酸化至pH值4的培养基和酸化至pH值4并含有BA鸡尾酒的培养基中处理10分钟。然后将细胞在正常培养基中培养170分钟，固定后用8-OH-dG单克隆抗体免疫染色(红色信号)测量氧化应激，用YOYO-1免疫染色(绿色信号)观察细胞核。
我们还评估了胆汁酸和/或低pH值是否可以诱导Seg-1细胞凋亡。处理24 h后，pH 4单独处理和酸和胆汁酸鸡尾酒联合处理后，凋亡细胞的百分比出现了微小但显著的差异(p<0.05，图5)。在对照组细胞中，我们发现1.5%(0.5%)的凋亡细胞;仅ph4处理的细胞中，凋亡细胞占3.8% (1.2%);在0.1 mM胆汁酸鸡尾酒处理的细胞中，我们发现2.3%(0.8%)凋亡细胞;在酸和胆汁酸混合处理的细胞中，我们发现6.2%(1.0%)的凋亡细胞。作为阳性对照，我们加入用0.5 mM DCA处理3 h的细胞;这种处理诱导了27.4%(2.5%)的细胞凋亡。
ph4和/或胆汁酸(BA)鸡尾酒处理后Seg-1细胞的凋亡。Seg-1细胞分别在对照培养基(pH值7.4)、含有0.1 mM BA鸡尾酒的培养基、酸化至pH值4的培养基和酸化至pH值4并含有BA鸡尾酒的培养基中处理10分钟。处理后，冲洗细胞，在正常培养基中孵育24 h。以0.5 mM脱氧胆酸(DCA)处理3 h的Seg-1细胞为阳性对照。吉氏染色后以形态学标准测定凋亡细胞百分比。* p < 0.05。
为了测试这些发现是Seg-1细胞系独有的，还是其他食道细胞系的代表性发现，我们使用了永生的巴雷特细胞系和正常的食管鳞状上皮HET-1A细胞。然而，由于这些细胞对应激比Seg-1细胞更敏感，在巴雷特食管CP-D细胞和ht - 1a细胞的检测中使用了较短的暴露时间，以避免细胞脱离和丧失活力。图6显示了Barrett食管CP-D细胞和ht - 1a细胞在0.1 mM胆汁酸鸡尾酒和/或pH值为4下分别处理5和1.5 min，并用MitoSOX染色的图像。Barrett食管细胞的结果与Seg-1细胞的结果一致(图6A)。在ht - 1a细胞中，在用胆汁酸和酸联合处理后，以及单独用酸处理后，MitoSOX Red信号被检测到(图6B)。
荧光显微镜检测经ph4和/或胆汁酸(BA)鸡尾酒剂处理后Barrett食管细胞(CP-D细胞)和ht - 1a细胞的线粒体超氧化物。分别用对照培养基(pH 7.4)、含有0.1 mM BA鸡尾酒的培养基、酸化至pH 4的培养基和酸化至pH 4并含有BA鸡尾酒的培养基处理细胞5分钟或1.5分钟。然后用5 μM MitoSOX Red对细胞进行清洗和染色，测量线粒体超氧化物(红色信号)。用10 μM Hoechst 3222染色，观察细胞核(蓝色信号)。(A) Barrett食管CP-D细胞;(B) HET-1A细胞。DCA,脱氧胆酸。
pH值为4和/或胆汁酸鸡尾酒治疗后的MMP
我们观察到，与对照组细胞相比，胆汁酸鸡尾酒和酸的组合处理10min后，细胞的CMXRos染色没有明显下降(图7)。作为阳性对照，DCA钠盐处理3 h后，细胞的染色明显下降，以CMXRos作为MMP的指标(p<0.01，图7A,B)。
用MitoTracker Red(氯甲基- x - rosamine (CMXRos))检测ph4和/或胆汁酸(BA)处理后Seg-1细胞的线粒体膜电位(MMP)，共聚焦显微镜和流式细胞术。分别用对照培养基(pH 7.4)、酸化至pH 4的培养基、含有0.1 mM BA鸡尾酒的培养基、酸化至pH 4并含有BA鸡尾酒的培养基处理细胞10分钟。然后用CMXRos染色细胞，用荧光显微镜(A)或流式细胞术(B)测量MMP。红色信号代表CMXRos，蓝色信号代表用于检测细胞核的4 ' -6-二胺基-2-苯林多。阳性对照为0.5 mM脱氧胆酸(DCA)处理3 h。
讨论
这项研究的主要目的是确定短时间暴露于低pH值和/或胆汁酸是否会诱导氧化应激。免疫组化研究显示，巴雷特食管上皮细胞，特别是发育不良细胞，经常形成8-OH-dG，这是一种氧化性DNA损伤的标记物(图1)。此外，巴雷特食管组织，在体外被胆汁酸鸡尾酒和酸的组合应激，显示氧化性DNA损伤增加的证据(图2)。我们使用食管细胞系的研究表明，暴露于胆汁酸鸡尾酒和酸的组合也会诱导氧化应激(图3-5)。
在反流发作期间，正常的食管远端鳞状上皮通常暴露在胃酸和胆汁酸中。一项对GORD患者食管吸入物的分析显示，86%的患者存在胆汁酸，主要是甘氨酸结合物。8GORD患者的返流液包括糖胆酸、糖脱氧胆酸、糖乙酰脱氧胆酸和牛磺酸结合胆汁酸的混合物。8DCA也出现在服用质子泵抑制剂的Barrett食管患者的返流中。10然而，使用食管抽吸器的临床研究显示，有关个别胆汁酸浓度的结果不一致。5，32因此，我们使用了通常存在于回流液中的等摩尔浓度的胆汁酸。本研究使用的胆汁酸鸡尾酒包括糖胆酸钠盐、牛磺胆酸钠盐、糖脱氧胆酸钠盐、糖脱氧胆酸钠盐和DCA。这种鸡尾酒反应了胃十二指肠反流时远端食管暴露在胆汁酸混合物中。5，8日,10与甘氨酸结合的胆汁酸在pH值为4时是有毒的，因为它们的pKa为~ 4。在这个pH值下，甘氨酸结合胆汁酸部分是非电离的，可能会损伤食道细胞。相反，在较低的pH值下，它们会沉淀，而在较高的pH值下，它们会被电离，因此无法穿透细胞膜。Barrett食管患者返流液中的总胆汁酸浓度通常在0.03-0.82 mM范围内，5尽管在一些巴雷特食管患者的返流液中有报道胆汁酸浓度高达7.6 mM。7因此，我们研究中使用的鸡尾酒的浓度在较低的生理范围(0.1 mM用于培养细胞)和较高的生理范围(0.5 mM用于人体活检标本)。
氧化应激与巴雷特食管的发育有关。33GORD-Barrett食管- adca序列显示抗氧化能力下降和氧化应激增加。34一种假设的机制是食道中的炎症反应，主要涉及中性粒细胞，是ROS的主要来源。33利用Barrett食管和食管腺癌诱导十二指肠胃食管反流的手术模型进行的动物研究也表明氧化应激在Barrett食管发病机制中的重要性。35岁,36然而，评估反流成分(即低pH值和胆汁酸)对人类食道细胞和人类活检标本中ROS产生的直接影响的研究一直缺乏。我们推测胆汁酸与低pH值结合可能会诱导过度氧化应激，导致DNA损伤、DNA突变，最终导致癌症。
我们在目前的研究中已经表明，酸性pH值和胆汁酸的结合诱导了巴雷特食管活检标本和三种不同的食管细胞系的氧化应激。与对照组织(即食管鳞状上皮和十二指肠)相比，活检标本的上皮细胞8-OH-dG核染色增加，这是一种氧化DNA损伤的标记物，表明Barrett食管组织暴露于ROS。ND Barrett食管组织中8-OH-dG表达水平较低，而发育不良组织中8-OH-dG表达水平明显较高。此外，我们的体外实验表明，与仅暴露于对照培养基的活检标本相比，仅暴露于0.5 mM胆汁酸鸡尾酒和酸的组合中10分钟的活检标本显示出更多的氧化DNA损伤。在三种食道细胞系中，正常鳞状上皮HET-1A细胞，Barrett食管来源细胞和腺癌Seg-1细胞中也检测到线粒体ROS的增加。
有大量证据表明，酸和胆汁酸的结合(即混合回流液)比单独酸或单独胆汁酸对食管上皮的伤害更大。5，9，37 -39这种协同作用可能是由撞击线粒体的互补通路的激活引起的，从而诱导线粒体内ROS的生成。酸性pH条件激活质膜相关酸性鞘磷脂酶，40从而产生针对线粒体的神经酰胺。胆汁酸扰乱质膜，从而激活磷脂酶A2导致花生四烯酸的释放，花生四烯酸也可以靶向线粒体。41事实上，先前的研究表明，在发育不良的巴雷特食管和食管腺癌中，线粒体DNA突变经常发生，可能是氧化损伤的结果。42酸和胆汁酸协同诱导氧化应激的另一个机制是NADPH氧化酶的激活，前者通过内体酸化43后者可能是通过膜摄动。44此外，酸性pH可能通过铁介导的Fenton反应放大胆汁酸产生的ROS。45酸和胆汁酸之间协同作用的另一个潜在机制是酸诱导的细胞内酸化46 -48胆汁酸对ros生成酶活性的扩增。上述酸和胆汁酸协同诱导ROS和随后的DNA损伤的机制需要在未来的实验中在食管上皮细胞中进行测试。
细胞防御ROS的一个重要部分是诱导特定基因对氧化应激作出反应，以使细胞适应这种应激。氧化应激与信号转导通路的激活有关，包括核因子-κB, Janus激酶信号转导，转录激活因子和丝裂原激活蛋白激酶通路，可上调抗凋亡，促生存和血管生成蛋白的表达。49岁,50这些通路的激活和抗凋亡蛋白的表达被我们和其他人证实在Barrett食管中增加。18日,19日,51与这些报道一致的是，Barrett食管中发现了低水平的促凋亡标记物。52我们推测低pH和胆汁酸诱导的氧化应激可能导致Barrett食管促生存和抗凋亡通路的激活。抗凋亡细胞中的DNA损伤是一种危险的情况，可以导致复制错误引起的突变，随之而来的是突变细胞的克隆扩展和肿瘤进展。事实上，巴雷特食道病变和邻近癌组织中常见的染色体改变表明了克隆扩展的过程。53岁,54
总之，我们的研究首次表明胆汁酸与低pH值结合可诱导食道细胞的氧化性DNA损伤和线粒体氧化应激。我们推测，长期暴露于胆汁酸和低pH值可能导致基因组不稳定性增加，细胞信号异常和细胞凋亡抵抗。这些改变可能在癌症的发展过程中起着作用。
致谢
这项工作得到亚利桑那州生物医学研究委员会拨款0012,SPORE拨款IP50 CA95060，癌症中心核心拨款CA23074和NIEHS拨款ES06694的支持。
参考文献
脚注
2006年12月1日
竞争利益:没有宣布。