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背景和目的:胃肠粘膜屏障的损伤导致的艾滋病毒感染。本研究的目的是调查的影响高活性抗逆转录病毒疗法(HAART)艾滋病病毒导致的肠道屏障的缺陷和识别潜在机制。
方法:上皮屏障功能的特点是阻抗光谱学和[3H]甘露醇通量从11治疗十二指肠活检和8抑制艾滋病病毒感染者治疗,和9 HIV-seronegative控制。绒毛/地下室比显微镜下决定。上皮apoptoses被终端分析原位脱氧尿苷三磷酸缺口末端标记(TUNEL)和caspase-3染色。紧密连接蛋白表达是由光密度定量免疫印迹分析。粘膜细胞因子的生产是由仪珠数组。
结果:只有在未经处理而不是治疗感染艾滋病毒的病人,上皮抵抗减少23(13(1)和(2)Ω厘米2,p < 0.01)和甘露醇渗透率增加与阴性对照相比(19(3)和9(1)纳米/ s, p < 0.05)。结构相关,上皮apoptoses和表达的造孔claudin-2增加而表达的密封claudin-1降低相比,未经治疗的病人和阴性对照组治疗。此外,绒毛萎缩明显,粘膜白介素2 (IL2)的生产,IL4和肿瘤坏死因子α(TNFα)在未经处理而不是增加感染艾滋病毒的病人治疗。孵化与IL2 IL4 TNFα和使用IL13 transepithelial阻力降低大鼠空肠粘膜。
结论:抑制HAART废除艾滋病病毒导致的肠道屏障缺陷和绒毛萎缩。艾滋病病毒导致的障碍缺陷是由于改变紧密连接蛋白组成和上皮apoptoses升高。粘膜细胞因子是艾滋病病毒导致粘膜屏障的介质缺陷和绒毛萎缩。
来自Altmetric.com的统计
作为一个主要CD4的隔间+T细胞耗竭和病毒复制,1- - - - - -5胃肠粘膜是HIV感染的主要目标。最近的数据表明,肠上皮屏障功能发挥核心作用在艾滋病毒感染的疾病进展。的发现了等离子体脂多糖(LPS)水平与LPS刺激单核细胞有关6了假设艾滋病病毒导致上皮屏障的破坏会导致增强的易位腔的有限合伙人在肠道上皮细胞等抗原。饱和后抵消这种抗原易位和中和机制被认为是引起慢性免疫激活,7这被称为进步的主要推动力慢性感染艾滋病毒的免疫失败。8- - - - - -10
在一些研究中,治疗HIV感染确实被证明与肠上皮细胞的渗透性增加。11- - - - - -15这一障碍缺陷发生机会性感染的独立11121416因此反映出艾滋病毒感染的影响及其免疫学后遗症上皮的完整性。转换结构、慢性感染艾滋病毒引起的肠道粘膜hyporegeneration和dysmaturation肠道上皮细胞,导致部分绒毛萎缩。17- - - - - -21粘膜转换和上皮屏障缺陷被认为是由于粘膜T细胞激活炎性细胞因子的增加产量。151822
对这些证据,一个模型可以概念化,艾滋病毒复制导致粘膜的T细胞的激活,而由当地炎性细胞因子的分泌,引起肠上皮屏障功能的损害。结果反过来进一步燃料粘膜上皮屏障缺陷以及系统性免疫激活。恢复上皮完整性的直接干预上皮水平不可行,唯一办法打断粘膜免疫激活的自我循环会降低免疫激活的抑制艾滋病毒复制。符合这个推理,降低感染艾滋病毒的患者的血清LPS水平观察高活性抗逆转录病毒疗法(HAART)解释结果的调整胃肠上皮屏障。6然而,HAART的上皮屏障功能的影响到目前为止还没有调查艾滋病病毒感染者。此外,有一个缺乏数据关于艾滋病病毒导致粘膜屏障的底层机制缺陷。
在这项研究中,我们调查了屏障功能和形态的十二指肠粘膜标本获得艾滋病毒感染患者未经治疗或抑制通过鸡尾酒疗法治疗。在治疗病人,我们观察到正常化的粘膜屏障缺陷和绒毛萎缩。抑制的鸡尾酒疗法也正常粘膜细胞因子升高,暗示了病毒复制之间的紧密战略位置图,粘膜细胞因子激活和艾滋病病毒导致粘膜屏障缺陷。
材料和方法
研究对象
11首次治疗和八个鸡尾酒疗法包括艾滋病毒感染患者的研究。九个艾滋病毒阴性的病人没有胃肠道病理作为控制。临床病人中给出的细节表1。在病人治疗,艾滋病毒复制以下的被抑制的检测极限(定量PCR < 50拷贝/毫升,罗氏Amplicor,罗氏,曼海姆,德国)的鸡尾酒疗法中值时间25个月(范围3-50)。抗逆转录病毒治疗是一个标准的组合两个核苷逆转录酶抑制剂与非核苷逆转录酶抑制剂或双蛋白酶抑制剂。感染艾滋病毒的患者进行内镜对上消化道症状相关,和控制为探索原因不明的贫血患者。肠道感染患者(排除如前所述14)、腹泻、炎症性肠病或十二指肠的病理损伤和/或腔被排除在外。这项研究是经当地伦理委员会批准,所有患者给予书面知情同意参与这项研究。
组织准备
从降低十二指肠粘膜标本得到一个3.4毫米钳。直接运输到实验室后,一个塑料环(内径2.5毫米)粘在浆膜的活检标本histoacryl组织胶(布劳恩,Melsungen,德国)的援助解剖显微镜。圆盘粘膜被放入一个修改Ussing-type室。23
电生理实验
如前所述执行阻抗光谱学。1424利用容性上皮的属性,这种技术解决了透壁的壁阻力(Rt)进入上皮(Re)和牙龈(R子)组件。1424甘露醇渗透率,局限于paracellular途径,评估从[3H(甘露醇粘膜浆膜通量描述,2510毫米的未标记的甘露醇两边和上皮暴露面积0.049厘米2。在额外的实验中,transepithelial抵抗决心在传统美国钱伯斯对大鼠空肠粘膜(组织从男性白化Wistar鼠)获得部分剥夺了从底层黏膜下组织所描述。26这些实验,大鼠细胞因子(PeproTech GmbH,汉堡,德国)是用作表示。洗澡的解决方案包含(更易/ l): Na+,140;Cl−123.8;K+5.4;Ca2 +1.2;毫克2 +1.2;HPO42−2.4;H2阿宝4−0.6;HCO3−21岁,d(+)葡萄糖10;β-OH-butyrate 0.5;谷氨酰胺,2.5;和d(+)甘露糖,10。解决方案被毒气毒死O为95%2/ 5%股份有限公司2,其温度保持在37°C使用水套水库、pH值为7.4。抗生素(50 mg / l阿洛西林和4 mg / l妥布霉素)添加到洗澡的解决方案所示阻止细菌生长以及初步实验中得到的浓度没有影响离子通量和阻力。26
形态分析和上皮细胞凋亡
粘膜样本接近活检获得的样本用于电生理实验。活检标本固定在4%福尔马林和嵌入在石蜡的量化上皮apoptoses或固定在乙醇/冰醋酸(3:1)并存储在75%乙醇进行形态分析。免疫荧光检测上皮apoptoses,串行部分(3μm)脱蜡和细胞DNA沾终端原位脱氧尿苷三磷酸缺口末端标记(TUNEL)试验(罗氏,曼海姆,德国)。钝的双链DNA链断裂暴露的形象化的酶标签免费3′-哦末端与荧光素/三磷酸脱氧尿苷。caspase-3活化的免疫组织化学染色,幻灯片受到燥热引起抗原决定基之前的检索步骤孵化与主兔多克隆抗体裂解caspase-3(美国马萨诸塞州细胞信号,丹弗斯,稀释1:10 0)。对于检测,streptavidinAP工具包(K5005, Dako、斯特鲁普、丹麦)使用和碱性磷酸酶快红了发色体。上皮apoptoses被确定为上皮细胞的百分比与凋亡细胞核或caspase-3-positive上皮细胞每视野(凋亡比率)。平均六视觉领域(∼150肠上皮细胞/字段)是计算每个样本。形态分析在H&E-stained部分利用分析软件(版本3.0,柔软的成像系统,德国明斯特)。如果有必要,重复部分在不同的轴进行调查,直到绒毛轴平面内的部分。 The mean height and mean depth of a minimum of 10 villi and 10 crypts, respectively, were determined in each specimen. The morphological analysis and the quantification of epithelial apoptosis were performed without knowledge of the respective specimen’s patient status.
免疫印迹分析
紧密连接蛋白表达的检测,免疫印迹分析进行膜提取十二指肠活检标本如前所述。25主要是兔多克隆抗体免疫球蛋白G claudin-1抗体(免疫球蛋白),claudin-2 occludin,主要claudin-4鼠单克隆免疫球蛋白G抗体。Peroxidase-conjugated山羊anti-rabbit免疫球蛋白或山羊anti-mouse免疫球蛋白抗体和化学发光检测系统Lumi-LightPLUS西方墨点法工具包(罗氏,曼海姆,德国)是用于检测结合抗体。这些抗体的合成和特异性(病菌,旧金山,加利福尼亚,美国)被Rahner描述等。27化学发光信号检测使用一个拉斯维加斯- 1000成像系统(富士、东京、日本)和AIDA densitometrically分析程序包(Raytest,柏林,德国)。
粘膜细胞因子分泌
测定黏膜细胞因子分泌进行最后substudies,然后附加控制艾滋病毒阴性样本被收集(n = 13,除了白介素12 (IL12)与n = 15控制)。另一方面,由于样本数量有限,更少的样本来自感染艾滋病毒的患者接受仪珠阵列(CBA)(天真,7;鸡尾酒疗法,6)比其他研究。活检是像之前描述的那样培养48 h28和原位细胞因子产生量化在上层的CBA(德国海德堡,正欲)根据制造商的协议。
粘膜IL13-positive细胞
Formalin-fixed和石蜡包埋4μm部分十二指肠组织在蛋白酶K deparaffinised和受到抗原决定基检索解决方案(Dako) 5分钟。使用IL13染色,幻灯片孵化了45分钟与人类使用IL13兔抗体(Chemicon泰梅库拉,加州,美国)其次是30分钟,驴anti-rabbit生物素(Dianova,汉堡,德国),streptavidin-alkaline磷酸酶(Dako)和Dako红发色体。核与苏木精复染色。所有步骤都是在室温下进行。
统计分析
结果意味着(SEM)。在单变量分析中,意义被双尾学生t测试测试。多变量分析是由单向方差分析的方法(方差分析)。Bonferroni的多重比较检验被用于事后分析。p值< 0.05被认为是重要的。
结果
鸡尾酒疗法对十二指肠上皮屏障功能的影响
Transepithelial阻力确定在传统我们体外设置由上皮(Re)和牙龈阻力(R子)。然而,体内有效扩散障碍是由R表示e只有。29日因此,我们进行阻抗光谱学使R的具体确定e和R子。
原始阻抗轨迹图中描述图1 a - c。所示图1 d,Re未经治疗的艾滋病病毒感染者是减少了∼40%,而在对待艾滋病病毒感染者Re没有不同于控制(p = 0.32)。另一方面,R子大致反映牙龈组织的厚度layers-did之间没有不同感染艾滋病毒的病人和阴性对照组(26.6Ω厘米(2.0)2在未经治疗的艾滋病病毒感染者(p = 0.15), 30.8(3.2)Ω厘米2在对待艾滋病病毒感染者(p = 0.93)和31.2(2.6)Ω厘米2在控制)。
为了描述R的变化e此外,我们执行甘露醇通量评估paracellular渗透率。所示图1 e增加,> 100%甘露醇的渗透率在未接受治疗的患者,而接受治疗的患者不是甘露醇渗透率不同的控制(p = 0.90)。虽然有更高的CD4细胞计数的趋势与未经治疗的患者相比,治疗没有相关外围CD4细胞与Re或甘露醇通量被发现在治疗或未经治疗的患者(数据未显示)。综上所述,电生理以及通量数据表明,艾滋病毒感染会导致明显的肠上皮屏障功能的损害。这个艾滋病病毒导致粘膜屏障缺陷完全被有效抑制艾滋病毒复制HAART后逆转,因此似乎与活跃的病毒复制。
形态的变化
在未经治疗的艾滋病病毒感染者中,我们发现减少三分之一的绒毛高度,而隐窝深度并不不同于阴性控件(图2)。另一方面,通过HAART治疗的艾滋病病毒感染者,绒毛高度并不不同于阴性对照组(分别为p = 0.33, p = 0.07)。因此,部分绒毛萎缩患者与艾滋病毒感染有关的逆转在抑制病毒复制,和屏障功能的恢复后抑制的鸡尾酒疗法是平行的上皮细胞形态的调整。
艾滋病病毒导致的屏障损伤机制
paracellular渗透率增加可能是由于严重违反上皮连续性(如溃疡和/或侵蚀),通过增加上皮细胞凋亡,增加上皮细胞紧密连接的渗透性。自十二指肠活检的患者没有任何腐蚀性或ulcer-type病变的组织学检查,第一种可能性被排除。
十二指肠上皮细胞中的凋亡率增加两个在未经治疗的感染艾滋病毒的患者相比,治疗感染艾滋病毒的患者或艾滋病毒阴性控件(图3)。因此,鸡尾酒疗法引起的上皮屏障功能的调整由上皮凋亡减少平行的比率,表示频率的增加上皮细胞凋亡机制的艾滋病病毒导致的肠道屏障的缺陷。
作为一名杰出的角色使用IL13在溃疡性结肠炎黏膜屏障缺陷最近被描述,30.我们免疫组织化学量化IL13-positive粘膜细胞在一个额外的分析。与阴性对照相比(2(2)细胞每10大功率领域(高通滤波器),n = 3), IL13-positive细胞显著增加治疗和治疗艾滋病病毒感染者(48(3)细胞每10高通滤波器,p < 0.05 vs控制,n = 4,每10个高通滤波器,73(12)细胞p < 0.01 vs控制,分别,n = 3),但两组互相感染艾滋病毒的患者显示没有区别(数据没有显示)。
免疫印迹和随后的光密度分析被用于定量分析的膜结合紧密连接蛋白occludin和密封(claudin-1 claudin-4)或造孔(claudin-2) claudins (图4)。在未经治疗的艾滋病病毒感染者,claudin-1表达式被∼40%,抑郁claudin-2强烈表达增加,而在治疗病人claudin-1和claudin-2表达没有明显不同于阴性对照组(p = 0.57, p = 0.95,分别图4 a, B)。Occludin claudin-4表达式,另一方面,没有明显不同于阴性控制治疗和治疗艾滋病病毒感染者(Occludin, p = 0.92, p = 0.06;claudin-4, p = 0.35, p = 1.0,分别;图4)。密封claudin-1的表达减少和增加的表达成孔claudin-2未经治疗的患者中发现艾滋病毒表明改变上皮紧密连接成分作为第二艾滋病病毒导致的肠道屏障机制缺陷。
粘膜细胞因子和十二指肠屏障功能
在未经治疗的艾滋病病毒感染者的粘膜样本,IL2 (Th1细胞因子的生产图5),但不是干扰素γ(IFNγ)(图5 b)和IL12 (图5度)是提高对艾滋病毒阴性的控制。以类似的方式,生产IL4 Th2细胞因子(图5 d),但是不是IL5 (图5 e)和IL10 (图5 f)在未经治疗的患者中,升高和促炎细胞因子肿瘤坏死因子α(TNFα)(图5克),但不是白细胞介素6 (图5 h)是在这些患者中升高。因此,增强粘膜细胞因子的生产在未经治疗的艾滋病病毒感染者并不符合经典Th1、Th2模式,而是代表未指明的粘膜细胞因子激活。在治疗患者中,另一方面,粘膜生产Th1、Th2或其他促炎细胞因子没有明显不同于控件(p > 0.05);图5),表明在抑制粘膜细胞因子生产正常化治疗病人。
为了研究粘膜屏障作用的细胞因子,在未经治疗的患者增加,我们培养大鼠空肠粘膜细胞因子鸡尾酒含IL2 IL4,使用IL13 TNFα。所示图6,细胞因子鸡尾酒一滴transepithelial电阻引起的上皮中表明小肠粘膜屏障缺陷的感应这些细胞因子的协同动作。
![Effect of highly active antiretroviral therapy (HAART) on barrier function as quantified by impedance spectroscopy and mannitol permeability. Representative impedance locus plots of duodenal specimens obtained by endoscopic forceps biopsy from (A) a HIV-negative control, (B) an untreated HIV-infected patient and (C) a suppressively treated HIV-infected patient. Zreal gives the ohmic component and Zimaginary the reactive component of the complex impedance, the latter constituted by the capacitive properties of the epithelial cell membranes. Intersections between the fitted semicircle and the x-axis at low and high frequencies represent transmural resistance (Rt) and subepithelial resistance (Rsub), respectively. The epithelial resistance (Re) results from Rt minus Rsub. (D) Effect of suppressive antiretroviral therapy on Re and (E) paracellular mannitol permeability (Pmannitol) of duodenal mucosa obtained from HIV-negative controls (circles), untreated (diamonds) and treated (squares) HIV-infected patients. Re was determined by impedance spectroscopy. Paracellular Pmannitol was determined from mucosal to serosal [3H]mannitol fluxes at a mannitol concentration of 10 mM. The horizontal bars represent the respective mean values. ***p<0.001; *p<0.05; ns, not significant vs controls.](http://www.marcconsult.com/content/gutjnl/58/2/220/F1.large.jpg?width=800&height=600&carousel=1){kind=link}
讨论
一个肠上皮屏障的缺陷被认为是免疫激活和疾病进展的关键机制在艾滋病毒感染,6但是鸡尾酒疗法对胃肠道上皮的屏障功能的影响尚不清楚之前,我们的研究。这里我们报告完整解决艾滋病病毒导致肠粘膜屏障的缺陷以及逆转的绒毛萎缩,抑制HAART治疗的病人。因此,艾滋病病毒导致胃肠道屏障缺陷和粘膜转换似乎并非不可逆转,而是取决于病毒复制活跃。抗逆转录病毒药物诱导而不是提高故障的粘膜屏障,31日似乎不太可能,HAART施加直接的有益影响粘膜屏障。因此我们的发现不仅证实艾滋病毒复制粘膜损害的独立的病原学的作用建议在早先的研究中,1719- - - - - -213233但也提供了一个简单的解释为减少感染艾滋病毒的患者接受HAART治疗的有限合伙人易位。6
执行机械的艾滋病病毒导致粘膜屏障缺陷的描述,我们寻找之间的关联结构改变,粘膜屏障功能受损和他们对鸡尾酒疗法的反应。这样,凋亡的增加频率上皮细胞在未经治疗的患者减少使用鸡尾酒疗法。上皮细胞凋亡在中间频率升高的治疗病人可以解释为proapoptotic抗逆转录病毒疗法的效果,31日尽管艾滋病毒感染有关的其它因素也发挥了作用。随着甚至适度增加上皮apoptoses影响上皮屏障功能,34- - - - - -37> 100%的频率增加凋亡上皮细胞在治疗感染艾滋病毒的患者很有可能导致粘膜屏障缺陷。这个概念是由最近的研究也支持使用高分辨率体内成像证明瞬态的形成在细胞脱落的肠粘膜上皮的差距。3839在控制条件下,这些差距不会增加上皮通透性。腹腔内TNFα管理,这是一个公认的凋亡诱导物,然而,增加上皮细胞的数量差距和上皮通透性。3839
Claudins上皮紧密连接的主要部件是制约溶质的运动,包括离子和小抗原,在胃肠粘膜。4041claudin-1,密封性能已经证明。4243Claudin-2,另一方面,作为小阳离子paracellular通道为特征,44和超表达claudin-2紧密连接链中断。45claudin-1结合增加差别因此,对这些基因的表达在未经治疗的艾滋病患者claudin-2意味着增加上皮紧密连接为整体的渗透性屏障缺陷患者中观察到。
大量研究表明诱导粘膜屏障缺陷的炎性细胞因子在肠道上皮细胞模型2230.3646- - - - - -50以及本地肠道粘膜。2630.3451然而,冲突的结果报告为炎性细胞因子是否实际上增加了肠粘膜的未经处理的感染艾滋病毒的病人。基于组织RNA量化,增加黏膜细胞因子表达被描述,52- - - - - -56但单核细胞隔离感染艾滋病毒的患者的结肠没有显示增加细胞因子的生产。5758与后者的发现,我们发现粘膜增产TNFαIL2和IL4未经治疗的艾滋病病毒感染者。当我们从完整的粘膜活检,量化细胞因子分泌的失败分离单核细胞产生大量的细胞因子增加5758可以解释为缺乏co-stimulation粘膜微环境提供的“生理”。最后,细胞因子的鸡尾酒怀疑导致屏障缺陷根据我们数据诱发大鼠空肠黏膜缺损,一个巨大的障碍进一步确凿的炎性细胞因子和黏膜屏障损伤之间的关系。
粘膜的细胞因子被发现在未经治疗的患者中,增加TNFα明确影响粘膜屏障功能已被证明,2230.3436464951而IL2的粘膜作用和IL4不太好描述。TNFα诱导绒毛萎缩,59上皮细胞凋亡2230.和删除的claudin-1顶端膜。50此外,TNFα上皮抵抗力下降,减少claudin-1但claudin-2表达增加肠道上皮细胞模型。34486061年我们观察到TNFα和其它粘膜细胞因子并不增加患者的抑制艾滋病毒复制进一步假设绒毛萎缩,上皮细胞凋亡增加,改变紧密连接成分在治疗艾滋病毒感染可能是由TNFα,额外的潜在贡献的粘膜细胞因子如摘要意思,IL4和使用IL13。
总之,我们提出以下模型的艾滋病病毒导致胃肠道上皮屏障的损害。艾滋病病毒复制活跃导致当地增加胃肠道粘膜内的炎性细胞因子。53这些细胞因子诱导上皮屏障功能受损导致上皮细胞凋亡和紧密连接蛋白表达的改变。随后的屏障缺陷促进肠道菌的易位62年63年和细菌抗原如有限合伙人。6进一步增加抗原暴露刺激粘膜细胞因子的产生,促进粘膜和可能系统性免疫激活。6抑制艾滋病毒复制的HAART中断粘膜免疫激活和障碍的自我循环障碍,允许调整的上皮屏障功能。
确认
作者希望表达他们的感谢安雅提供的优秀的技术援助,戴安娜Bose和西蒙Spieckermann。
引用
脚注
资助:这项工作是支持的德国研究基金会(DFG KFO格兰特104)。
利益冲突:一个也没有。
伦理批准:这项研究是由当地伦理委员会批准。
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