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摘要
背景食管粘膜细胞间间隙扩张(DIS)对非糜烂性反流病(NERD)的症状感知可能很重要。NERD患者甚至可能在近端食管有DIS。我们旨在评估酸性和弱酸性溶液灌注对“暴露”和“非暴露”食管黏膜的影响及其与健康受试者症状的关系。
方法14名健康志愿者接受了上消化道内窥镜检查，并在食管胃连接(OGJ)近端3cm和13cm处进行了活检。在接下来的疗程中，受试者在EGJ上方5cm处接受中性、弱酸性、酸性和酸性胆汁酸溶液灌注30分钟(间隔4周)。灌注后20min取活检。使用电子显微镜测量DIS。受试者在灌注过程中用视觉模拟量表评分胃灼热。
结果(1)食管灌注酸溶液(含胆汁酸或不含胆汁酸)可引起“暴露”食管粘膜的DIS;(2)食管灌注弱酸性溶液引起的变化与灌注酸性溶液引起的变化相同;(3)远端食管灌注不仅会引起“暴露”粘膜的变化，而且会引起更近端“未暴露”粘膜的变化;(4)尽管存在灌流诱导的DIS，大多数健康受试者在实验过程中没有感到胃灼热。
结论人食管粘膜对酸性和弱酸性溶液的持续暴露非常敏感。尽管存在腔内酸和DIS，健康受试者没有出现胃灼热，这表明NERD患者的症状背后应该有其他关键因素。
- 扩张在细胞间的空间
- non-erosive返流性疾病
- 弱酸性的
- 人类
- 酸
- 胃食管返流疾病
- 进行非心脏胸痛
来自Altmetric.com的统计
简介
胃食管反流病(GORD)症状的病理生理学尚未完全阐明。在食管炎患者中，反流的胃内容物可通过食管粘膜的糜烂到达感觉神经末梢，导致感觉胃灼热。在非糜烂性反流病(NERD)患者中，机制不那么明显。在这些患者中，当酸和/或反流胃内容物的其他成分通过粘膜扩张细胞间隙(DIS)到达感觉神经末梢时，被认为发生胃灼热。1细胞间隙扩张是这些患者食管黏膜细胞损伤的标志。2脊髓传入神经上皮内神经末梢可能参与介导酸诱导的食管症状。3.
体外胃酸暴露兔食管黏膜可诱发DIS4用质子泵抑制剂(PPIs)减少人的食道酸暴露可以逆转DIS5 - 7这表明，胃酸暴露对DIS的发展至关重要。然而，正常食管胃酸暴露的NERD患者8胃酸分泌得到很好的控制，但在PPI治疗后症状持续的患者也可能患有DIS9这表明，黏膜接触酸性物质的增加并不是导致这种组织学现象的唯一因素。我们最近在老鼠身上发现了急性应激10兔食管黏膜暴露于胆汁酸，11都可能引发DIS。有趣的是，这两个因素可能存在于NERD或难治性ord患者中。1213反流的近端程度是反流感知的一个重要决定因素，特别是在NERD患者中。14这可能是由于对近端食管膨胀的过敏，但也可能与其他粘膜因素有关。最近的一项研究表明，NERD患者不仅食管上皮远端有DIS，而且食管上皮近端也有DIS15这可能有助于增强近端反流的感觉。目前尚不清楚近端DIS的发生是由于食管黏膜与胃内容物的直接接触，还是涉及由更远端食管部位的刺激引发的间接机制，如固有传入纤维、肥大细胞脱颗粒。1617
有人提出，在DIS存在时，腔内酸会通过激活脊髓传入神经的上皮内神经末梢引起胃灼热。然而，目前尚不清楚这两种情况在一个健康的受试者身上是否足以诱发胃灼热。
本研究旨在评估健康受试者食管远端灌注酸性和弱酸性溶液的效果。本研究的目的是:(1)验证健康受试者的食管黏膜，不仅暴露于酸性溶液，而且暴露于弱酸性溶液，也会引发食管远端DIS的假设;(2)评估灌注诱导的粘膜变化从远端“暴露”到近端“未暴露”食管的扩散情况;(3)评估症状感知与DIS的存在或程度之间的关系。
方法
主题
14名健康志愿者(7名男性)无上消化道(GI)症状，平均年龄23±1岁(19-32岁)。所有受试者入组前均给予书面知情同意。
试验协议
受试者按随机顺序接受食管内灌注治疗，中间至少有4周的洗脱期。每次灌注结束约20分钟后，在下食管括约肌(LOS)上方3和13 cm处进行上消化道内窥镜检查，并进行食管活检。在第一个疗程中，进行测压定位LOS近缘。将一根单腔灌注导管和一根双pH传感器导管经鼻置入食管内，使灌注点位于LOS上缘近端5cm处，两个pH传感器分别位于LOS上方3cm和13cm处。
灌注时间为30分钟，流速为2ml /min，受试者半平卧位。采用以下溶液:(1)中性溶液:NaCl 0.9%， pH 7.2;(2)弱酸性溶液:NaCl 0.9%， pH 5.5;(3)酸性溶液:0.9% ph2.0 NaCl + 0.5 mg/ml胃蛋白酶;(4)酸性溶液+胆汁酸:0.9% ph2.0 NaCl + 0.5 mg/ml胃蛋白酶+糖胆酸2mmol /l。
在灌注结束时，受试者被要求饮用50毫升水，以将食管pH稳定在4以上。灌注后约20分钟进行内窥镜检查。外径2.2 mm;Boston Scientific, Heredia, Costa Rica)在每个pH传感器的水平上从第二象限获得。所有的内窥镜检查都是由一个内窥镜医师(RB)完成的。
受试者接受单独的内窥镜检查，在没有灌注的情况下获得相同水平的活检。将暴露于弱酸性和酸性溶液后的活检与未灌注及灌注中性溶液后的活检进行比较。
pH值记录分析
灌注诱导的食管远端酸暴露(pH<4)由远端pH测量计算。在LOS上方13 cm处监测pH值，用于识别远端酸灌注过程中的近端污染。当近端酸暴露时间超过灌注时间的10%时，认为有污染。有近端污染的受试者被排除在分析之外。
症状评分
受试者在灌注期间每5分钟评分一次胃灼热或疼痛，使用视觉模拟评分(范围0 - 10)(0=无感觉到10=最大疼痛强度)。
形态学研究
使用光学和透射电子显微镜检查组织。光镜下，组织固定在4% (w/v)多聚甲醛中。如前所述，活检嵌入OCT化合物(Sakura Finite USA, Torrance, California, USA)中。18半薄片(1 μm)按照Richardson染色法染色et al。19每个方案的两个活检(一个近端和一个远端)由一个组织病理学家(MV)进行分析，他对灌注的溶液和食道部位不可见。所有活检均评估上皮总厚度、乳头长度和基底细胞层厚度。
透射电镜下，组织固定在2.5% (w/v)戊二醛磷酸盐缓冲液中。之后，组织被固定在1%缓冲四氧化锇4℃，通过分级醇系列脱水，然后埋入环氧树脂。用醋酸铀酰-柠檬酸铅对超薄切片进行染色。使用蔡司(Zeiss, Oberkochen, Germany)透射电子显微镜对标本进行检查和拍照。从每个活组织检查中，用三张食管黏膜基底层和基上层的显微照片评价细胞间隙。每张图像中至少有40个随机选择的到相邻膜的垂直横断面被绘制和测量。细胞间隙直径的形态学分析采用计算机软件程序(Image-Pro MC 5.1.0.20;媒体控制论，贝塞斯达，马里兰州，美国)。细胞间隙直径由一名研究人员(RF)盲视灌注溶液和食道部位进行评估。
解决方案和药物
猪胃蛋白酶(猪胃蛋白酶A, 392单位/毫克固体)和糖胆酸购自Sigma Aldrich (Sigma/RBI, Bornem，比利时)和生理盐水溶液购自Baxter (Lessines，比利时)。
统计数据
所有数据均以平均值±SEM表示。采用重复测量方差分析比较不同灌注类型之间的数据，然后Dunnett后测，以确定基线数据(非灌注)和灌注后不同溶液之间的差异。单次比较采用配对或非配对的学生t检验。使用Graph Pad Prism 4.0进行统计分析。p值<0.05表示显著性。
结果
总的来说，有六名受试者被排除在研究之外。4名受试者在远端酸灌注过程中出现食管近端污染，2名受试者未完成灌注序列。
8名受试者纳入最终分析(5名男性/22.8±1.3岁)。在食管灌注酸性溶液或酸+胆汁酸溶液时，食管远端pH分别在27.8±0.5 min和28.2±0.4 min低于4。近端无污染(食管近端pH值分别在0.7±0.4和0.2±0.1 min内低于4)。在中性和弱酸性溶液(pH 7.2和pH 5.5)灌注过程中，完全灌注时间食管远端和近端pH均保持在4以上。
形态学研究
光学显微镜
胃酸、弱酸性和中性溶液灌注食管远端30min均未引起糜烂。此外，灌注后食管远端和近端活检的评估参数(上皮总厚度、乳头长度和基底细胞层厚度)与未灌注前的活检观察到的参数无显著差异。
透射电子显微镜法
未灌注前食管近端和远端细胞间隙直径分别为0.59±0.04 μm和0.52±0.04 μm (N=8, p=0.08)。这些直径与以往研究中在健康受试者中观察到的直径相当。21520.远端食管灌注对远端“暴露”和近端“未暴露”食管活检中细胞间隙直径的影响显示在图1而且2．
暴露于不同测试溶液后健康志愿者食管远端(A)和近端(B)活检的粘膜细胞间隙直径。
食管黏膜暴露于不同试验溶液后的电镜图片。(A)非灌注，(B)酸性溶液，(C)酸性溶液加胆汁酸，(D)弱酸性溶液。注意与未灌注活检相比，B、C和D的细胞间隙扩张。比例尺= 7μm。
与未灌注的活检相比，从酸和酸+胆汁液“暴露”的远端食管获得的活检显示细胞间隙显著增大(≥1 μm) (图1一个而且2)．有趣的是，灌注弱酸性溶液(pH值5.5)引起了相同的效果。食管远端灌注不仅在“暴露”的食管区域引起DIS。弱酸性和酸性溶液也会导致最近端“未暴露”食道区域的细胞间隙明显增大(图1 b)．食管远端和近端活检标本间细胞间隙直径无差异。
与弱酸性和酸性溶液不同，中性溶液(pH 7.2)灌注食管远端不会引起明显的粘膜变化。食管黏膜远端和近端细胞间隙直径与未灌注活检观察到的相似(图1)．
症状评分
注入中性溶液的受试者均无不适或疼痛。尽管在灌注后粘膜活检中有DIS，但灌注弱酸性和酸性溶液的受试者几乎没有症状。他们的症状评分与灌注中性溶液时的症状评分相似(p=0.39)。每组的视觉模拟得分中位数保持在0，表明刺激对大多数受试者是无害的。只有1/8的弱酸性灌注受试者和2/8的酸性灌注受试者出现症状(图3)．感知评分与细胞间隙直径无相关性(N=8, r=0.16, p=0.39) (图4)．
受试者在食管远端灌注30min后记录视觉模拟疼痛评分。粗线表示每个解决方案的视觉模拟评分中值。
用视觉模拟量表评估灌注不同溶液过程中细胞间隙直径与知觉评分的相关性。
讨论
我们对健康受试者进行了酸性、弱酸性和中性溶液食管灌注30分钟的效果评估。我们的主要实验结果如下:(1)食管灌注酸溶液(含或不含胃蛋白酶和胆汁酸)可引起“暴露”的食管远端黏膜的DIS;(2)食管灌注弱酸性溶液引起的变化与灌注酸性溶液引起的变化相同;(3)远端食管灌注不仅引起“暴露的”远端黏膜的变化，而且也引起更近端的“未暴露的”黏膜的变化;(4)尽管存在灌注诱导的食管黏膜病变，但大多数健康受试者在实验过程中没有感到胃灼热或疼痛。
传统上，GORD症状的病理生理学解释为胃酸对受损的远端食管黏膜暴露增加的影响。60% - 70%的胃灼热患者没有食管远端糜烂，被归为肠内糜烂。21在NERD患者中，症状的机制尚未完全阐明。这些患者没有肉眼可见的糜烂，但常表现为显微镜下的粘膜病变。这一特征被认为是NERD症状发病机制中缺失的一环。巴洛和奥兰多1提示DIS使反流胃酸扩散到细胞间隙。通过DIS，酸可以到达并激活化学敏感的痛觉感受器，这些感受器通过脊髓向大脑传递信号，从而产生胃灼热的感觉。
传统上认为，DIS的发展是由于食管远端黏膜暴露于酸的增加。食管黏膜长期暴露于酸性环境是食管炎和巴雷特食管发病的重要原因。13然而，NERD患者并不总是增加了对酸的粘膜暴露研讨会在两种NERD患者中均发现了DIS，即食管酸暴露增加的和未增加的NERD患者。8
了解DIS的发生机制有助于设计治疗方案以减少NERD患者的胃灼热。实验食道酸灌注在动物实验和人体志愿者中均可诱发DIS。42425Bove等在健康受试者中灌注酸性溶液(pH值为1.1)，并在光镜下食管远端活检中发现DIS。我们的研究使用pH值为2的酸溶液和透射电子显微镜检测DIS证实了这些发现。此外，我们还研究了胆汁酸对酸诱导的食管粘膜完整性损伤可能的协同作用。众所周知，与正常受试者相比，NERD患者的一个亚组可能会增加酸和胆汁暴露。13我们实验室最近对兔食管黏膜进行的体外实验表明，在酸溶液中加入糖胆酸可增加食管黏膜通透性，并进一步降低黏膜电阻。11与这个假设相反，Calabresse的一项研究等发现用Bilitec 2000 (Synectics，斯德哥尔摩，瑞典)检测的仅酸反流患者和酸和胆汁反流患者之间的DIS患病率没有差异。20.我们目前的结果与那些发现一致。含胆汁酸(糖胆酸2 mmol/l)的酸溶液灌注远端食管引起的细胞间隙变化与单独灌注酸溶液观察到的细胞间隙变化相似。这些数据表明，在食管酸暴露明显增加的NERD患者中，胆汁酸的存在在症状的发病机制中起着次要作用。酸性暴露增加的NERD患者对PPI治疗反应最好。26
在没有增加食道酸暴露的NERD患者中检测到DIS，在使用PPI进行良好的酸控制的NERD患者中仍有症状。9我们假设，在这些患者中，含有胆汁酸和/或其他胃液成分的弱酸性反流持续存在，可能会诱发或维持DIS和症状。我们实验室最近的体外实验表明，兔食管粘膜暴露于含有胆汁酸的弱酸性溶液可引起食管通透性增加和DIS。27目前的研究结果，在健康的人类受试者，与我们之前的体外结果一致。食管灌注弱酸性溶液(pH 5.5)引起的DIS与酸性溶液引起的DIS相似。这些数据表明，正常酸暴露的NERD患者或“服用”PPIs的患者的弱酸性反流可能通过影响食管粘膜完整性而导致症状。
Caviglia最近的一项研究等结果显示，NERD患者不仅可能在靠近胃食管交界处的部位有DIS，而且可能在更近端的食管部位也有DIS，这些部位的胃返流较少。15目前尚不清楚食管近端DIS的存在是由于近端黏膜直接暴露于反流，还是由食管远端事件触发的间接机制。本研究表明，食管近端病变可能涉及这种间接机制。在我们的研究中，我们排除了远端灌注过程中食管近端“污染”的受试者，即使在近端酸暴露极小的情况下，我们也在近端活检中发现了DIS。虽然这种间接的机制，在远离患处的远处起作用，从未在食道中被描述过，但在胃肠道的其他区域也有类似的现象报道。28
食管黏膜酸化可引起肥大细胞脱颗粒29(组胺释放)，辣椒素敏感传入神经元的激活和神经刺激素的释放。17这些或其他介质可能参与DIS向食管近端扩散。食管黏膜近端DIS的存在可能导致NERD患者对近端反流发作的过敏反应。这种效应可能与中枢因素协同作用，如压力和脊髓皮质致敏，也影响敏感性。1430.健康受试者食管远端实验酸化诱发近端食管对电刺激的超敏反应。3132
这种过敏目前被认为是中枢介导的(脊髓-皮质)，也涉及到自主神经系统的特定激活模式。食管近端黏膜损伤在电刺激过敏中的作用目前仍在研究中。上皮屏障的破坏可能会通过增强初级传入神经的刺激而增加对电刺激的痛觉感受。
尽管存在灌注诱导的食管远端和近端黏膜病变;大多数健康受试者在实验过程中没有感到胃灼热或疼痛。这一发现表明，除了DIS之外，其他因素对NERD患者的症状的产生也是必要的。例如，神经纤维中瞬时受体电位香草素1 (TRPV-1)的上调到三十五和其他质子门控离子通道，如asic(酸感应离子通道)36和P2X嘌呤能受体37可能与症状感知有关。
本研究的局限性在于:(1)接受所有灌注期的受试者数量较少;(2)我们对症状感知的评价仅限于灌注期;(3)在健康受试者或NERD患者中，灌注30分钟多于单次反流暴露。我们选择了30分钟的曝光来产生可测量的效果，2527但我们承认，多次短时间的远端酸暴露可产生和维持食管过敏。32灌注结束后20min活检中存在DIS;在再次接触酸的过程中，可能会出现症状。需要进一步的实验来更好地了解DIS、酸暴露与症状之间的关系。
总之，人食管粘膜对持续暴露于酸性溶液非常敏感。酸性和弱酸性溶液都可能引发DIS。这些粘膜变化也可能发生在更近端的“非外露”食道。然而，尽管存在灌注诱导的食管黏膜DIS和腔内酸，大多数健康受试者并未出现胃灼热，这表明其他因素在NERD症状的病理生理学中至关重要。
关于这个主题我们已经知道了什么?
食管黏膜基底上皮层的扩张细胞间隙(DIS)可能与非糜烂性反流病(NERD)患者的症状感知有关。
DIS最初是在从食管远端获得的活检中描述的，最近从更近端的食管的NERD患者
食管黏膜暴露于酸性环境中是DIS发生的重要原因
新的发现是什么?
在健康人食管灌注酸和弱酸性溶液均可引起细胞间隙扩张
远端食管的食管灌注不仅在灌注区，而且在更近端的“未暴露”粘膜也会引发DIS
尽管存在DIS，大多数健康受试者在灌注过程中没有感到胃灼热或疼痛，这表明除DIS外，其他因素对症状的产生至关重要
在可预见的未来，它会对临床实践产生怎样的影响?
将远端食管暴露在pH值类似于质子泵抑制剂(PPIs)患者持续反流的弱酸性溶液中，可能引发远端和近端细胞间间隙扩张(DIS)，这可能导致这些患者观察到的其余症状和/或过敏。针对酸性和弱酸性反流的抗反流治疗策略将减少这种暴露和黏膜改变。
致谢
我们要感谢R Renwart女士和C Armee女士的出色技术支持。
参考文献
脚注
资金这项工作部分由瑞典阿斯利康公司资助，该公司没有参与研究设计、数据收集、分析或解释。RF是FWO(弗兰德斯研究基金会)博士后。
相互竞争的利益一个也没有。
伦理批准这项研究于2006年10月26日获得鲁汶天主教大学伦理委员会的批准，并按照《赫尔辛基宣言》进行。
病人的同意获得的。
来源和同行评审不是委托;外部同行评议。
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