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摘要
背景:尽管慢性胰腺炎与酒精中毒、甲状旁腺功能亢进和高甘油三酯血症等危险因素相关，但对该病的实际病因知之甚少。据认为，胰蛋白酶原的不适当激活导致胰腺炎，确实，在遗传性胰腺炎的情况下，阳离子胰蛋白酶原(PRSS1)突变已被描述。由于丝氨酸蛋白酶抑制剂Kazal type 1 (SPINK1)是一种有效的胰蛋白酶活性天然抑制剂，我们假设SPINK1突变在未选择的成年慢性胰腺炎患者队列中比预期的更常见。
目的:检测SPINK1突变在慢性胰腺炎患者队列中的患病率。
方法:从115例酒精性慢性胰腺炎(n=72)、遗传性(n=10)、特发性(n=24)和其他来源(n=9)的成年患者队列中分离DNA。我们对两个PRSS1突变(R122H, N29I)和四个特定SPINK1基因突变(M1T, L14P, N34S, P55S)进行了突变分析，并将结果与120名健康荷兰受试者的对照组进行了比较。
结果:在符合遗传性胰腺炎标准的10名患者中，有6名患者，但在对照组中没有发现PRSS1基因突变。我们在14例患者中检测到SPINK1突变。11例患者的N34S突变为杂合子，测序证实了兄妹中的N34S纯合子状态。2例患者携带P55S突变，1例为与N34S复合杂合子。在我们的队列中未发现M1T和L14P SPINK1突变。在120个对照组中，只有两个检测到N34S突变，而同一组中没有P55S、M1T和L14P突变。与PRSS1基因突变的患者相比，携带N34S等位基因的患者发病较晚，但与突变阴性组相比，发病较早。
结论:在12.2%的成人酒精性和特发性慢性胰腺炎患者中鉴定出SPINK1突变，提示SPINK1是成人慢性胰腺炎的一个重要易感因素。
- 慢性胰腺炎
- SPINK1
- 胰蛋白酶
- 突变
- PRSS1
- PCR，聚合酶链式反应
- CFTR，囊性纤维化跨膜传导调节剂
数据来自Altmetric.com
慢性胰腺炎是一种进行性炎症性疾病，最终导致不可逆的结构变化，导致外分泌和/或内分泌生理功能受损。1它比较常见，患病率估计为每10万居民50-75例。确诊后20年内死亡率接近50%。2这是一个重要的问题，因为大多数慢性胰腺炎患者需要频繁和密集的医疗护理，因为复发发作的丧失能力的腹痛。3.在西方世界，酒精滥用通常被认为是慢性胰腺炎发展的一个重要风险因素。此外，其他病因因素如遗传、吸烟、解剖变异和各种代谢障碍已被确定。在高达30%的患者中，缺乏与上述任何危险因素的联系，该疾病被归类为特发性。1
对慢性胰腺炎发病机制的认识的重大突破源于对遗传性胰腺炎家族的研究结果。遗传性胰腺炎(孟德尔男性遗传167800，http://www3.ncbi.nlm.nih.gov/omim)是一种常染色体显性遗传特征，位置克隆将慢性胰腺炎的易感基因定位在染色体7q上。4,5进一步的研究确定了阳离子胰蛋白酶原基因(蛋白酶，丝氨酸1;PRSS1)作为致病基因。在受影响个体中对该基因的突变分析显示了一种错义突变，导致密码子122 (R122H)上精氨酸替换为组氨酸。6随后在不同家庭中进行的研究发现了第二个错义突变N29I。7，8据推测，这些缺陷导致“功能增加”，并导致胰蛋白酶活性增加，从而导致自身消化和胰腺炎。虽然这些发现可以在一定程度上解释这些患者胰腺炎的病因，但两项观察表明，在这方面其他机制也可能很重要。首先，一些遗传性胰腺炎家族不携带PRSS1基因突变，其次，PRSS1基因突变在没有慢性胰腺炎家族史的个体中不常见。
胰腺丝氨酸蛋白酶抑制剂Kazal型1 (SPINK1，也称为胰分泌胰蛋白酶抑制剂，PSTI)是一种79个氨基酸的多肽(AF286028)，作为胰蛋白酶活性的有效抑制剂。在最近一项针对特发性或家族性胰腺炎儿童的研究中，在96名患者中有18名患者检测到SPINK1基因(N34S)密码子34上的天冬酰胺被丝氨酸取代。9尚不清楚SPINK1突变的相关性是否仅限于患有胰腺炎的儿童，或者这一概念是否可以扩展到其他形式的(成人)慢性胰腺炎。因此，我们开始研究SPINK1突变是否与非选择的成年患者慢性胰腺炎相关，并调查可能存在的基因型-表型相关性。
方法
患者的选择
该研究得到了医院伦理委员会的批准。我们首先设计了一个计算机化的慢性胰腺炎患者数据库。我们回顾了1980年至2000年因慢性胰腺炎症状转诊到圣内梅亨大学医疗中心的所有患者的记录。慢性胰腺炎的诊断基于有典型病史(反复出现上腹痛，向肩胛骨尖放射，前倾或坐直缓解，进食后加重)，提示影像学表现，如胰腺钙化或假性囊肿，和/或胰腺内镜逆行胰腺造影或磁共振成像在分泌素刺激前后显示的病理表现(胰管不规则和扩张)。共有165份记录可供查阅。我们收集的数据特别强调慢性胰腺炎的病因、症状的发生、早期(脾静脉血栓形成、胰腺假性囊肿)和长期并发症(脂肪水肿、糖尿病)、手术程序、使用麻醉药和吸烟行为。由于我科积极参与了胸腔镜下内脏去神经治疗疼痛的项目，我们能够将疼痛的特征分为两种类型。3.A型疼痛代表反复发作的疼痛，而B型疼痛表明持续不断的疼痛。10估计每日酒精摄入量超过60克(女性)或80克(男性)超过两年的患者被归类为酒精性慢性胰腺炎。11在没有酗酒、胆结石、外伤、药物治疗、感染、代谢紊乱和阳性家族史等诱发因素的情况下，诊断为特发性慢性胰腺炎。12当两个或两个以上的家庭成员存在慢性胰腺炎时，遗传性胰腺炎被定义为。研究人员给这些患者和他们的全科医生发了一封信，解释了研究的目标，并要求他们提交血液样本。这项研究总共提供了115个DNA样本，所有患者在入组前都知情同意。
DNA的研究
我们使用Puregene DNA分离试剂盒(Gentra Systems, Minneapolis, Minnesota, USA)根据既定协议从全血中提取基因组DNA。为了识别疾病相关突变，我们采用了以下方法。我们首先筛选了PRSS1基因中最常见的突变(N29I和R122H)。使用等位基因特异性聚合酶链反应(PCR)检测N29I突变。13使用pcr限制性片段长度多态性对患者进行R122H突变筛查。简单地说，50 μl反应混合物含有200 ng基因组DNA, 10 mM Tris HCl (pH 9.0)， 50 mM KCl, 0.1% Triton, 2 mM MgCl2， 0.25 mM dNTPs, 100 ng义引物(5 ' -GGTCCTGGGTCTCATACCTT-3 ')， 100 ng反义引物(5 ' -GTAATGGGCACTCGAAATGT-3 ')， 3.0 U Taq-DNA聚合酶生成555 bp片段。循环条件是在94°C的初始步骤5分钟，然后在94°C的30秒，60°C的30秒，72°C的30秒，以及72°C的5分钟的最终延伸步骤。PCR产物用10u BbrPI (Roche Diagnostics, Mannheim, Germany)在37℃下孵育2小时。将酶切后的PCR样品在3% RESponse PCR琼脂糖(Biozym, Landgraaf，荷兰)上电泳，产生野生型327 bp和228 bp的两个片段，出现R122H突变时，产生另外两个208 bp和20 bp的片段。
在具有家族病史的突变阴性患者中，我们使用表1所示的引物对PRSS1的所有5个外显子进行测序。循环条件为初始步骤在94°C下5分钟，然后在94°C下循环35次，持续30秒，62.5°C/57.5°C (PCR 1/PCR 2)持续30秒，72°C持续1分钟，最后延伸步骤在72°C下持续5分钟。PCR产物在琼脂糖凝胶上电泳后，使用Qiaex II凝胶提取试剂盒(Qiagen, Hilden，德国)进行纯化。对于纯化的产物，我们使用Thermo Sequenase CyTM5染料终止器试剂盒(Amersham Pharmacia Biotech，白金汉郡，英国)根据制造商手册进行测序，并将其加载到ALFexpress DNA测序仪(Amersham Pharmacia Biotech)上。
接下来，我们分析了SPINK1基因的四个特定突变:M1T, L14P, N34S和P55S。我们使用等位基因特异性PCR在所有慢性胰腺炎患者中寻找这些突变。简单地说，用200 ng基因组DNA、10 mM Tris HCl (pH 9.0)、50 mM KCl、0.1% Triton、2 mM MgCl制备了50 μl反应2， 0.25 mM dNTPs, 3.0 U Taq-DNA聚合酶，100 ng正义、反义和突变引物(见表2)。循环条件为初始步骤94°C 5分钟，然后在94°C 30秒，59°C 30秒，72°C 30秒，最后一个延伸步骤72°C 5分钟。当N34S突变存在时，该等位基因特异性PCR产生两个片段，当野生型存在时产生一个片段。以意义引物为测序引物，对SPINK1基因外显子3进行完全测序，证实了N34S和P55S突变的异质性或纯合子性。
人口筛查
为了排除观察到的突变可能作为自然多态性存在于整个种群的可能性，进行了基于种群的研究。为此，我们对120个不相关的荷兰血统健康个体的240条染色体进行测序，以检测SPINK1变异和PRSS1突变R122H和N29I。健康受试者平均年龄35±11岁，其中女性65岁。
统计分析
我们使用Fisher精确检验来估计三组之间的患病率差异。采用Wilcoxon符号秩检验比较发病年龄差异。所有p值均基于双侧比较。p值0.05为最低显著性水平。
结果
患者特点
患者的临床特征见表3。115例患者包括72例酒精相关性胰腺炎，24例特发性胰腺炎，10例家族性胰腺炎，9例各种病因。其中男性71例，女性44例。复发性腹痛作为诊断问题或治疗困境通常是转诊的原因。
DNA的研究
表3为PRSS1和SPINK1基因突变筛选结果。我们检测到6名携带突变PRSS1基因的患者。携带N29I等位基因的两名患者是兄弟姐妹，第三名患者是他们的侄女。在一位母亲和她的女儿以及来自遗传性胰腺炎家族的第三位无亲属关系的患者中检测到R122H突变。然后，我们对其他四个慢性胰腺炎家族性病例的PRSS1基因的整个编码区域进行了测序，但无法在这些患者中证明PRSS1的五个编码外显子中的任何一个发生突变。然后，我们使用等位基因特异性PCR检测所有患者的四个SPINK1突变。总的来说，14例慢性胰腺炎患者(12.2%)至少有一个SPINK1突变，而PRSS1突变阳性的患者中没有一例携带SPINK1突变。我们在13例患者中检测到N34S等位基因(图1)。其中11例患者的N34S突变是杂合的(图2A)，而其余两例(兄弟和姐妹)的N34S突变是纯合的(图2B)。对120名患者的240个对照等位基因进行测序，发现两个N34S杂合突变(占等位基因的0.83%，健康队列的1.67%)(p<0.0001)。在两名慢性胰腺炎患者中发现一个P55S杂合等位基因。1例为复合杂合子，携带不同等位基因P55S和N34S。 The P55S variant was present in none of the control chromosomes tested (p<0.0001). The M1T and L14P mutations were not detected in any of the patient or control samples.
SPINK基因外显子3上N34S突变的等位基因特异性聚合酶链反应分析野生型SPINK带位于285 bp处。如果像2号、6号和8号患者一样存在N34S突变，则在190 bp处出现第二个条带。左车道显示尺寸标记
(A) DNA序列电球图显示疾病相关的N34S SPINK1突变。注意94碱基上的双峰，导致杂合子a向G转变，导致天门冬酰胺被丝氨酸(N34S)取代。(B)显示疾病相关纯合子N34S SPINK1突变的DNA序列电球图。注意，在碱基93处有一个G表示a在两个等位基因上都被G取代了。这导致了天门冬酰胺被丝氨酸(N34S)纯合取代。
基因型-表型相关性评估
表4显示了根据DNA研究结果分组的慢性胰腺炎患者队列。分为三组:有SPINK1突变的患者(14例)，有PRSS1突变的患者(6例)，以及没有任何列出的突变的患者(95例)。胰腺炎的病因在突变阴性组和SPINK1突变组之间没有差异。在5名SPINK1等位基因突变的患者中，慢性胰腺炎与酒精滥用有关，尽管一名患者在诊断时的酒精摄入量仅为25克/天，低于大多数与酒精性胰腺炎相关的摄入量。另外9例SPINK1等位基因突变的患者被诊断为特发性(5例)、家族性(2例)、甲状旁腺功能亢进症(1例)和环状胰腺(1例)。SPINK1突变的杂合或纯合组出现症状较早(26(18)年)v38(11)年;p<0.05)，但与突变阴性患者相比，每位患者的住院次数相似(表4)。两名N34S纯合子患者发病较早(11.5年和18年)，但病程和严重程度与杂合子患者相似。他们的父母，专性N34S杂合子，没有出现慢性胰腺炎的症状。突变阴性的患者与SPINK1突变的患者在放射学研究中的异常表现相似。突变阴性组95例患者中有42例出现胰腺假性囊肿，SPINK1突变组14例患者中有7例出现胰腺假性囊肿，而PRSS1突变组仅1例出现胰腺假性囊肿。两组中约75%的患者在病程中接受了胰腺手术，最常见的是疼痛控制，两组中三分之一的患者接受了胸腔镜下内脏神经去神经治疗。与突变阴性患者相比，在SPINK1突变的患者中，糖尿病作为胰腺内分泌衰竭的标志更常见，尽管这没有达到统计学意义(表4)。与其他两组相比，PRSS1等位基因突变的患者出现症状的时间要早得多(6(5)年)，需要更多的住院治疗(每个患者16次)，并消耗更多的麻醉剂(p<0.05)。与突变阴性组和SPINK1组的2例患者相比，所有PRSS1基因突变的患者都有该疾病的阳性家族史。一名N34S和P55S SPINK1突变的复合杂合子患者患有非常严重的疾病。这名54岁男性患有8年的酒精性胰腺炎。 Pancreatitis was complicated by exocrine and endocrine insufficiency, diffuse pancreatic calcifications, and severe type B pain. Because of exacerbation of his chronic pain computer tomography of the pancreas was performed which disclosed a 3 cm tumour compatible with a pancreatic adenocarcinoma. He died eight months later.
讨论
我们的调查有两个主要目标。首先，评估SPINK1突变是否与慢性胰腺炎相关，其次，与SPINK1阴性患者相比，携带SPINK1突变的患者是否遵循不同的病程。我们在115例因慢性胰腺炎症状转介给我们的患者队列中发现慢性胰腺炎与SPINK1等位基因之间有很强的相关性。在这些患者中，SPINK1突变的频率比健康对照组高7倍。大多数SPINK1突变的患者有N34S变异(13/14)，但有两名患者有P55S等位基因。拥有这些等位基因具有临床后果，因为携带者比没有这种突变的患者更早发病，但比有PRSS1基因突变的患者更晚发病。虽然我们在突变阴性组和SPINK1阳性组之间的临床表现中发现了微小的差异，但在个体患者的基础上判断慢性胰腺炎的表型非常相似。我们的研究扩展了以前的工作，因为我们纳入了由于各种原因导致的慢性胰腺炎的成年患者。9事实上，我们的慢性胰腺炎队列反映了在日常临床实践中所见的患者组，因为据估计，在发达国家，60-70%的慢性胰腺炎患者有过度饮酒史，而30%的慢性胰腺炎被视为特发性疾病。2我们的数据显示SPINK1等位基因也与特发性胰腺炎有关，这与Chen最近的一项研究一致等他们在187名无关的法国特发性慢性胰腺炎患者中检测到N34S突变的患病率为6.4%。14然而，我们也在酒精性慢性胰腺炎中检测到SPINK1等位基因携带者。在我们的慢性胰腺炎队列中，74例患者符合酒精性慢性胰腺炎的标准，其中5例检测到SPINK1突变。11另一项研究也得出了类似的结果，274例酒精性慢性胰腺炎患者中有16例出现了N34S突变。15酒精性胰腺炎的诊断是基于急性胰腺炎反复发作的临床病史和过度饮酒史。尽管有这些标准，但对于酒精摄入量实际上会增加胰腺炎的风险，人们仍存在相当大的困惑。数据从25克/天到5年以上超过80克/天不等。10日,16这可能是合理的假设，SPINK1突变使患者更容易受到酒精、高钙血症和胰腺炎发展的解剖变异等危险因素的影响。9
胰蛋白酶原被认为是目前胰腺炎发病机制模型中的起始分子。PRSS1突变被认为导致活性胰蛋白酶的降解减少或促进胰蛋白酶原的激活。在这个发病模型中，SPINK1作为活化胰蛋白酶的抑制剂，我们的研究结果证实了过早蛋白酶活性在胰腺炎的发病机制中的重要作用。17事实上，等摩尔量的胰蛋白酶和SPINK1孵卵产生非活性复合物，据估计SPINK1可以使10-20%的活性胰蛋白酶失活。17SPINK1基因突变可能会对功能产生影响。可能突变改变了蛋白质结构，从而影响了非活性复合物的有效构建。18
目前尚不清楚SPINK1基因突变是否会导致一种具有单独孟德尔遗传模式的独特形式的胰腺炎。M1T突变破坏SPINK1的翻译起始密码子已在受影响的祖父和未受影响的父亲中观察到，这可能涉及常染色体显性遗传。9N34S突变的情况似乎不同，因为它在一个法国家庭中被检测到(没有PRSS1突变)，但没有与疾病隔离。19如果我们认为SPINK1突变是一种常染色体隐性遗传特征，那么纯合子患者将会患上非常严重的疾病。在我们队列中的两名患者中，情况并非如此。与杂合子相比，他们出现症状的年龄更早，但病程相似。如果SPINK1导致常染色体隐性疾病，杂合子就不会像我们的患者那样发展为慢性胰腺炎。此外，如果模型为常染色体显性，杂合子将有胰腺炎的风险。我们发现基因频率约为1%，考虑到西方人群中慢性胰腺炎的估计为0.05-0.07%，这表明非外显率不太可能很高。1威特等分析了受影响的家庭(有N34S突变)，并显示出强烈的连锁不平衡，这表明该基因确实是这些家庭中疾病的原因9但最近的一项研究无法证实这一点。18这些数据可能表明，SPINK1突变本身并不是一种疾病诱导剂，而是一种修饰基因。这让我们想起了以前研究慢性胰腺炎患者囊性纤维化基因突变的研究。在一项研究中，科恩等据估计，在特发性胰腺炎患者中，单个囊性纤维化跨膜传导调节因子(CFTR)突变的频率是预期频率的11倍，两个突变等位基因的频率是预期频率的80倍。20.在134例由酒精中毒、代谢性疾病或特发性疾病引起的慢性胰腺炎患者的队列中，CFTR突变的频率是预期频率的近2.5倍。21最后一项研究包括30例特发性胰腺炎患者，在30%的患者中检测到CFTR突变。22研究SPINK1基因突变是否与慢性胰腺炎患者的CFTR突变相关可能是有意义的。这在一定程度上解释了N34S突变的低外显率。同样，尽管我们队列中的PRSS1阳性患者没有SPINK1突变，但很容易推测这种组成将导致严重的表型，因为这两种基因改变以不同的方式增加胰蛋白酶活性。
本研究可能低估了SPINK1突变在慢性胰腺炎患者中的患病率，因为我们只检查了四个特定的SPINK1突变。另一项调查家族性胰腺炎的研究发现了SPINK1编码区外显子3的额外突变。该D50E在1/112受感染个体中存在。另一个位于外显子4的突变G77G也出现在一个病例中。一项研究在三名患者中描述了一种内含子突变(IVS3-2T >C)。18鉴于这些突变的频率非常低，在我们的队列中测试这些突变不太可能显著改变这里提出的结果。
总之，我们的研究确定了SPINK1基因突变是慢性胰腺炎的危险因素。此外，它增加了我们对胰腺炎发病机制的理解，并可能增加我们对该病临床行为的理解。
致谢
我们感谢荷兰奈梅亨圣内梅亨大学医学中心外科的H van Goor医生为我们提供了他的接受胸腔镜下内脏神经去神经的慢性胰腺炎患者的数据库。我们还感谢荷兰奈梅亨圣内梅亨大学医学中心的FM Nagengast博士和AHJ Naber博士将患者转诊给我们。我们感谢患者和他们的全科医生的合作，他们使这项研究成为可能。我们感谢荷兰奈梅亨天主教大学医学院的Tevfik Gunenc，他在数据库中输入了临床数据。这项研究得到了“荷兰消化疾病基金会”(WS 00-21)的支持。Joost PH Drenth博士是荷兰皇家艺术与科学学院的研究员