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摘要
背景和目的:瘦素是一种主要由脂肪细胞产生的激素，主要作用于下丘脑，调节能量消耗和食物摄入。瘦素受体在多种组织中表达，瘦素可能的生理作用正在被广泛研究，结果发现了该激素在机体中的重要外周作用。近年来的研究表明，瘦素和瘦素受体在胃上皮细胞中有表达。在目前的研究中，我们报道了长瘦素受体亚型(OB-Rb)在人、大鼠和小鼠小肠中存在，支持瘦素作为一种参与胃肠道功能的激素的假设。
方法:瘦素受体的存在是通过免疫细胞化学方法确定的，使用抗体对抗瘦素受体长亚型羧基末端对应的肽。对接受胃肠内窥镜检查的正常人的十二指肠活检，以及Wistar大鼠和瑞士小鼠的肠碎片进行了研究处理。
结果:长瘦素受体亚型的免疫反应性在三个研究物种中被观察到。染色遍布肠细胞的细胞质、绒毛和隐窝以及基底外侧质膜。在甲醛和多聚甲醛固定样品的人肠细胞刷缘中也发现了OB-Rb蛋白的免疫标记。
结论:该报告显示，在大鼠、小鼠和人类小肠的吸收细胞中存在长瘦素受体亚型，提示瘦素可能在调节营养物质吸收方面具有生理作用。
- 瘦素受体
- 小肠
- 鼠标
- 老鼠
- 免疫细胞化学
- OB-Rb，长瘦素受体亚型
- BBPM，刷边质膜
- 基底外侧质膜
- 逆转录聚合酶链反应
- 拥堵,多聚甲醛
来自Altmetric.com的统计
瘦素是一种16kda的激素，主要由脂肪细胞产生1它通过向下丘脑提供传入信号来调节食物摄入和能量消耗。2 -4它的表达和分泌与体脂质量和脂肪细胞大小高度相关，受激素、营养状态和交感神经系统等不同因素的调节。5 -7瘦素与某些细胞因子及其受体(从大脑克隆的OB-R蛋白)结构相似，8是细胞因子I类受体超家族的一员。
有几种OB-R异构体是单基因转录的剪接变体。9 -11所有受体异构体中的相同区域包括细胞外结构域、跨膜结构域和细胞质结构域的前29个氨基酸。根据胞内结构域的长度，有一个长异构体(OB-Rb)和四个短异构体(OB-Ra, c, d, f)，它们的胞质羧基末端不同。最后，有一种可溶性异构体(OB-Re)缺乏跨膜结构域，可能参与了瘦素在血液中的运输。当瘦素与OB-Rb受体结合时，它在多种体外系统中激活JAK/STAT (Janus激酶/信号转导器和转录激活器)和MAPK(丝裂原活化蛋白激酶)信号转导通路。12
除了克隆瘦素及其受体的原始组织外，在许多其他组织中也发现了这两种蛋白质的表达，13 -17这证明了啮齿动物和人类可能存在重要的周边行为。18岁20.最近的数据表明，瘦素也可以被认为是一种胃肠道激素。大鼠胃基底上皮中存在瘦素mRNA和瘦素蛋白。14在人类中，不仅瘦素，它的受体也在胃上皮细胞中表达。15，21通过逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)和western blot分析，已有报道在小鼠小肠中存在OB-Rb，静脉给药瘦素可降低空肠载脂蛋白AIV mRNA水平。22此外，我们实验室的功能研究表明，瘦素可以减少体外大鼠小肠对糖的吸收。23
根据我们之前的研究，本报告记录了人、大鼠和小鼠肠细胞中长瘦素受体亚型的免疫细胞化学定位。这是首次报道在哺乳动物肠细胞中存在瘦素受体蛋白。
材料和方法
主题
经伦理委员会批准，在纳瓦拉大学医院接受上消化道内窥镜检查的患者(n=10)被使用。本研究纳入的所有患者十二指肠黏膜均正常。免疫组化研究中，每个患者取2 - 3个十二指肠活检样本，在石蜡包埋前用10%甲醛、Bouin's或4%多聚甲醛(PAF)固定剂固定。此外，一些PAF固定样品被冷冻并用于低温切片。
Wistar大鼠(200-250 g;n=4)和瑞士小鼠(100-110 g;N =2)，分别在禁食24或12小时后，分别因颈椎脱位和空肠段分别为20 cm和10 cm而死亡，迅速切除并用冰冷的生理盐水冲洗。切片切成1 ~ 2 cm的小块，用Bouin’s或formol固定剂固定，进行免疫组化检查。室温固定24小时后，样品脱水并包埋石蜡。
大鼠空肠也采用灌流/固定方法进行树脂包埋。24固定成分为:4% PAF, 0.1%戊二醛，0.2%饱和苦味酸，在0.125 M磷酸盐缓冲液中，pH为7.4。固定后将空肠切成1mm片，脱水后嵌入epon，切成1 μm厚切片。
免疫组织化学过程
切出厚度为3 μm的切片，安装在载玻片上。用二甲苯脱蜡后，用链霉亲和素生物素法进行免疫细胞化学染色。用酒精水合切片，用3% H阻断内源性过氧化物酶2O2在黑暗中放置10分钟，然后放入磷酸盐缓冲盐水(65 mM NaCl, 1.05 mM KCl, 4.05 mM Na2HPO4， 0.5 mM KH2阿宝4, pH值7.4)。
非特异性背景用2%正常猪或兔血清阻断30分钟，切片与一抗在4°C下孵育过夜。在与生物素化的链接抗体(猪抗兔Dako E0353，兔抗山羊Dako E466)孵育一小时和过氧化物酶标记的链亲和素孵育一小时后，工作稀释倍数均为1:200，通过0.25% 3 '，3 '浸泡处理切片，结合抗体可见。-在0.05 M Tris-HCl缓冲液中，pH为7.36,0.5% H中使用四盐酸二氨基联苯胺作显色剂2O230秒。切片用自来水冲洗，用苏木精反染色，脱水，DPX裱片。半薄(1 μm)切片免疫染色，epon用饱和氢氧化钠在乙醇中老化1小时去除。一抗的孵育时间延长至48小时，在4℃下，生物素化抗体和链霉亲和过氧化物酶复合物以1:100工作稀释使用。在含有2.5%硫酸镍铵，0.2% β-的0.1 M醋酸钠/醋酸溶液中加入0.03%四盐酸二氨基联苯，pH为5.6，对某些反应进行了强化d-葡萄糖，0.04%氯化铵，0.01%葡萄糖氧化酶。
使用了两种不同的抗体:人瘦素受体山羊多克隆抗体(C-20;Santa Cruz Biotechnology Inc, Santa Cruz, California, USA)以1:50的工作稀释法用于人肠道样本，大鼠瘦素受体兔多克隆抗体(OBR13;阿尔法国际诊断公司圣安东尼奥，德克萨斯州，美国)，以1:200稀释，用于大鼠和小鼠样品。针对全长瘦素受体羧基末端的氨基酸1146-1165 (C-20)和1145-1162 (OBR13)对应的肽段产生抗体，因此对长受体亚型(OB-Rb)具有特异性。针对大鼠和小鼠受体的抗体OBR13与人体组织样品无交叉反应。微波预处理改善了这两种固定剂在三种植物中的免疫标记，但没有改变其分布格局。预处理切片在10mm柠檬酸钠缓冲液(pH值为6)中加热15分钟。
吸收对照检测免疫染色的特异性。瘦素受体抗血清与过量10倍的同源肽在4℃下预孵育过夜，然后应用于组织切片。对于所有抗体，抗血清与肽的预吸收消除了免疫反应。当一抗被遗漏时，免疫标记也不存在。
为了检查人抗体是否显示出与任何其他类似肽抗原的交叉反应性，使用Protein BLAST数据库进行计算机搜索。结果表明，人C-20抗体识别的肽只与人OB-Rb受体的羧基端对齐(100%的一致性)，与大鼠和小鼠OB-Rb受体对齐(95%的一致性)。与细胞因子受体的同源性为0%。同样，大鼠OBR13抗体识别的肽也与小鼠(99%识别)和人类(94%识别)OB-Rb受体一致。这些结果表明，这两种抗体都是特异性的长瘦素受体亚型。此外，C-20抗体已在其他论文中广泛使用，以显示不同组织中长瘦素受体亚型的免疫定位。21
在最初的实验中，使用了另外两种多克隆抗体，并在大鼠和小鼠组织样本中发现阳性。两种抗体都是山羊抗瘦素受体产生的，分别针对小鼠瘦素受体的877-894羧基端片段和32-51氨基端片段(研究诊断公司)。佛兰德斯，新泽西州，美国)。然而，这种抗体识别所有的受体异构体，因此不区分短和长受体异构体。
rt - pcr过程
使用TriPure Isolation Reagent (Boehringer Mannheim, Germany)从24例人十二指肠黏膜样本中分离总RNA。使用4 μg RNA和M-MLV逆转录酶(Gibco BRL, Life Technologies, Barcelona, Spain)生成第一条cDNA。为了检测OB-Rb mRNA的表达，我们使用了之前描述的人类眼底活检样本引物和PCR条件。21PCR产物经测序确认。
结果
瘦素受体长亚型的免疫反应性在三种研究物种(人、大鼠和小鼠)的肠细胞中被发现。在所有病例中，免疫染色均位于吸收细胞的细胞质和基底外侧质膜(BLPM)。此外，人肠细胞在刷缘处也显示出免疫标记。需要几种免疫组化处理方法来显示免疫标记的不同位置。
瘦素受体的免疫染色存在于人(图1A)、小鼠(图1C-F)和大鼠肠细胞的细胞质中。标记通常延伸到整个细胞，包括顶端和基底细胞质。刷刷边缘下的顶端细胞质区染色通常更强烈(图1E, F)。在肠绒毛(图1A, C, E)和隐窝(图1D)内衬的肠细胞中观察到胞浆内染色。虽然绒毛染色始终存在，但在一些样品隐窝染色较弱或无。预吸收试验显示了染色的特异性(图1B, G)。
长瘦素受体亚型(OB-Rb)的胞浆内免疫标记(A, B:人十二指肠，Bouin固定;C-G:小鼠空肠，甲醛固定)。(A)在人肠细胞的细胞质中发现了OB-Rb(*)的免疫染色。笔刷边框上没有标签(短箭头)。白色箭头，高脚杯细胞。偶尔也会出现未染色的内分泌细胞(黑色箭头)。(B)人体组织吸收试验:使用预吸收抗血清取消免疫标记。(C, D)瘦素受体(*)的免疫标记存在于小鼠肠细胞的基底和顶端细胞质中。相比之下，刷子边缘未进行免疫染色(短箭头)。在绒毛(C)和隐窝(D)中均观察到标记。在肠绒毛和隐窝内衬的所有肠细胞中观察到免疫染色。 White arrow, Goblet cell; black arrow, Paneth cell. (E, F) Panoramic micrograph of two intestinal villi (E) and detailed enterocytes (F). Intracytoplasmic immunolabelling for OB-Rb, although extended throughout the cell, was stronger in the apical cytoplasm underlying the brush border (*). Nickel enhancement method. (G) Absorption test in mouse tissue: no immunostaining was obtained. A–D, F, G: bars=14 μm; E: bar=35 μm.
在Bouin’s固定的样本中，人肠细胞的细胞质标记总是可以实现，但在其他固定剂中则不能(图2、3)。使用固定剂和除OBR13外的其他两种抗体时，小鼠和大鼠肠细胞显示出相同的胞质内标记模式。在确认瘦素受体的存在时，这些抗体(如方法部分所示)不能区分短受体和长受体异构体。
人肠细胞刷缘长瘦素受体亚型免疫染色:甲醛固定，石蜡包埋样品(A, B);多聚甲醛(PAF)固定，石蜡包埋样品(C, D);PAF固定，低温切片(E, F)。刷状边界显示在肠绒毛(A, C-E)和隐窝(B)的肠上皮细胞中免疫染色。刷状边界的条纹外观很明显(箭头)。用预吸收抗血清(F)对瘦素受体(E)进行免疫染色无效。A, D: bar =14 μm;B, C, E, F:棒=35 μm。
预吸收试验证实了福尔摩固定人肠刷缘质膜上瘦素长受体免疫染色的特异性。抗血清与抗原孵育(B)取消了刷缘免疫染色(A)。注意，刷缘质膜免疫标记发生在所有肠细胞中。酒吧= 40μm。
在甲醛(图2A, B, 3)和PAF(图2C-F)固定样品中的人肠细胞刷状边界质膜(BBPM)中也发现了瘦素受体的免疫染色。与细胞质内标记一样，在肠绒毛(图2A, C, E, 3A)和隐窝(图2B)中均观察到染色的刷状边界。预吸收试验也显示了染色的特异性(图2E, F, 3)。
在BLPM中，Bouin固定人活检和大鼠和小鼠肠道中经常观察到棕色染色，特别是在使用镍增强显示法时(图4A, B)，但在使用预吸收抗血清时消失(图4C)。鉴于BLPM染色的免疫标记难以确定，第三种处理方法也用于啮齿类动物。当将大鼠特异性抗体OBR13应用于epon包埋的大鼠肠道1 μm切片时，可以明显发现BLPM的免疫标记(图4D, E)。
肠细胞基底外侧质膜(BLPM)的长瘦素受体亚型免疫染色。(A-C:人十二指肠，Bouin固定;D, E:大鼠空肠，epon嵌套)。在人肠上皮细胞的纵向(A)和横向/斜向(B)切片中观察到瘦素受体的BLPM免疫染色。(C) BLPM的免疫标记随着抗血清的预吸收而消失。(D, E)在(D)中，BLPM的免疫标记是明显的(箭头)。注意，标记不存在于细胞最顶端的外侧区域，而那里已知存在于质膜中的连接复合体。因此，在标签(曲线箭头)中可以系统地观察到一个“环”。在预吸收切片(*，E)中，BLPM的免疫标记消失。固有层(*，D)的染色没有特异性，因为它在抗血清吸收后没有消失(E)。星形，细胞间基底外侧间隙增宽。 Bars=14 μm.
在人十二指肠黏膜中检测到编码OB-Rb蛋白的mRNA的表达，进一步支持长瘦素受体亚型在人肠细胞中的存在(图5)。
逆转录聚合酶链式反应检测人十二指肠长瘦素受体亚型(Ob-Rb) mRNA。1巷100碱基对DNA阶梯;巷2,OB-Rb(预期尺寸238bp);第三道，逆转录酶缺失。
讨论
在这项研究中，我们使用免疫细胞化学技术证实了长瘦素受体亚型(OB-Rb)在人和小鼠小肠中的存在。在人体组织中，RT-PCR证实了OB-Rb的存在。
鉴于免疫细胞化学研究中免疫标记的实现往往依赖于样本的组织学处理，我们采用了不同的处理方法。结果，在肠细胞的刷缘、细胞质和基底外侧膜上获得了免疫标记。
虽然许多研究已经检查了瘦素对参与调节食物摄入和能量代谢的下丘脑神经元的影响，但关于瘦素在小肠中的作用还知之甚少。最近的报道表明瘦素在肠道脂质处理中可能发挥作用22和糖的吸收23，25通过生化方法检测小鼠肠道和Caco-2细胞中瘦素受体的存在。22此外,研究125I-leptin的组织分布表明，大鼠和小鼠的小肠含有最高浓度的激素。26，27此外，在雏鸡和性成熟鸡的肠道中发现了OB-R mRNA的表达，雌激素处理可以增强肠道中OB-R mRNA的表达。28
肠细胞中发现的OB-Rb细胞内免疫染色与其他组织中瘦素受体的亚细胞定位一致。例如，使用不区分不同受体亚型的抗体，人脑的免疫染色模式显示细胞质内呈颗粒状外观，外周细胞质边缘强烈。29在小鼠大脑中，超微结构免疫细胞化学显示染色集中在神经元高尔基复合体水平。30.OB-Rb在人白色脂肪组织中的超微结构定位再次显示其在细胞质边缘的最强表达31最后，内皮细胞共聚焦免疫荧光显微镜显示OB-Rb强信号，其特征为细胞内分散点状染色。32在转染人长、短受体亚型cDNA的COS-7细胞中，免疫荧光显示细胞质核周强烈染色。33
在肠细胞中，我们不知道细胞内免疫染色是否对应瘦素结合后的内化受体，受体的循环，或生物合成通路隔室，包括新形成的含有受体的囊泡的运输，如转染瘦素受体的COS-7细胞所示。34然而，所有的免疫细胞化学研究都报道，大多数受体，短或长亚型，位于细胞内隔室29 -34顶端表面有一定程度的极性(即更强烈的免疫染色)，如脑室管膜细胞29和肠上皮细胞。
在肠细胞的BLPM中也发现特异性免疫反应。考虑到瘦素从血液到达肠上皮细胞，受体的这个位置是我们所预期的。事实上，这种标记在所有的制剂中都不明显，可能是由于细胞内标记的强度会掩盖基底外侧染色，或由于BLPM中受体的周期性缺失，反映了个体的生理状态。
令人惊讶的是，在人肠细胞的BBPM中也发现了标记。免疫染色似乎是确定的，因为发现了三种不同的组织学处理方法和对照吸收显示了其特异性。
如果瘦素必须从血液到达肠细胞，为什么瘦素受体会出现在BBPM ?研究表明，大鼠和人的胃粘膜都能储存和分泌瘦素。14，21更准确地说，除了内分泌细胞外，人胃粘膜主要细胞的分泌颗粒中还含有瘦素。15此外，正常人输注分泌素或五胱天冬素可增加胃液和血浆中的瘦素输出。21由于这些作者还在胃细胞的BLPM中发现了OB-Rb蛋白，他们认为胃中的瘦素具有旁分泌/自分泌作用，可能与控制喂养行为有关。14，15根据这一发现，我们也可以认为瘦素不仅到达肠细胞的基底外侧，而且到达刷状边界，与其受体结合，并调节糖运输和脂质处理。22日,23，25事实上，肠细胞顶端细胞质胞浆内染色通常较强，这可能反映了携带瘦素受体的囊泡更密集的转运。
总之，我们已经证明了长瘦素受体亚型在人、大鼠和小鼠肠细胞中的存在，这支持了瘦素作为一种参与调节胃肠道功能的新激素的考虑。
致谢
我们感谢I Ordoqui、B Irigoyen和JL Lanciego提供的技术援助。本研究得到PM98-0034拨款(西班牙政府Educación文化部)和Consejería de Educación文化部(纳瓦拉政府)的支持。杰比是纳瓦拉大学“Asociación de Amigos”奖学金的获得者。