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摘要
客观的口腔疾病与胰腺癌风险增加之间的关系已在若干前瞻性队列研究中报道。在这项研究中，我们测量了唾液微生物群的变化，并评估了它们与胰腺癌和慢性胰腺炎的潜在联系。
方法本研究分为三个阶段:(1)使用人体口腔微生物鉴定芯片对10例可切除的胰腺癌患者和10例匹配的健康对照者的唾液微生物区系进行微生物谱分析，(2)用实时定量PCR (qPCR)对候选细菌进行鉴定和验证，(3)用qPCR对28例可切除的胰腺癌、28例匹配的健康对照者和27例慢性胰腺炎样本进行候选细菌验证。
结果综合比较胰腺癌患者与健康对照者的唾液菌群，发现其唾液菌群存在显著差异。与健康对照组(n=10)相比，胰腺癌患者唾液中的31种细菌/簇增加，而25种细菌/簇减少。六个候选细菌中有两个(奈瑟氏菌属elongata而且链球菌结果显示，胰腺癌患者与对照组(n=56)之间存在显著差异(p<0.05, qPCR)。此外，两种细菌(Granulicatella adiacens而且年代轻的)显示慢性胰腺炎样本与对照组(n=55)差异显著(p<0.05, qPCR)。两种细菌生物标记物的组合(N elongata而且年代轻的)的曲线值下受试者工作特征图面积为0.90 (95% CI 0.78 ~ 0.96, p<0.0001)，在区分胰腺癌患者和健康受试者方面具有96.4%的敏感性和82.1%的特异性。
结论作者观察了患者唾液菌群变化与胰腺癌和慢性胰腺炎之间的关系。该报告还提供了唾液菌群作为发现系统性疾病的非侵入性生物标志物的信息源的证据。
- 唾液
- 微生物群
- 细菌
- 胰腺癌
- 慢性胰腺炎
- 生物标志物
- 胃肠内镜
- 胃肠超声
- 胰腺疾病
- 胰腺疾病
- 癌症预防
- 生物统计学
- 细菌的发病机理
- 分子遗传学
- 糖尿病
- 胰腺癌
- 胃癌
- 胃肠道癌症
- 幽门螺杆菌
- acid-related疾病
- non-ulcer消化不良
- 遗传多态性
- 胃肿瘤
- 内窥镜检查
- 基因表达
- 胰腺炎
- 癌症
来自Altmetric.com的统计
- 唾液
- 微生物群
- 细菌
- 胰腺癌
- 慢性胰腺炎
- 生物标志物
- 胃肠内镜
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- 胰腺疾病
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- 胃肿瘤
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- 基因表达
- 胰腺炎
- 癌症
本研究的意义
关于这个主题我们已经知道了什么?
先前的研究表明，口腔疾病，特别是牙周炎，与包括胰腺癌在内的全身性疾病之间存在联系。
胰腺的慢性炎症与患胰腺癌的风险增加有关。
细菌与自身免疫性胰腺炎和胰导管腺癌的发病机制有关。
新的发现是什么?
第一项研究显示口腔菌群多样性的变化如何与胰腺癌相关。
口腔菌群可作为胰腺疾病的非侵入性诊断生物标志物。
在可预见的未来，它将如何影响临床实践?
尽管尚不清楚这种联系是致病的还是反应性的，但这项研究可能会通过对口腔菌群的操纵，干预改变胰腺癌发病的自然历史，特别是在高危人群中。
简介
与胰腺癌相关的不良结果源于其快速扩散到淋巴系统和远处器官的倾向。1 - 3这种侵袭性生物学，对常规和靶向治疗药物的耐药性，以及缺乏早期检测的生物标志物，导致诊断为胰腺癌的患者的5年生存率仅为5%。45约15%-20%的患者在发病时可通过手术切除，但只有约20%的患者存活5年。3.吸烟被认为是胰腺癌唯一确定的可改变的风险因素，尽管一些数据也表明糖尿病、肥胖和胰岛素抵抗与胰腺癌风险增加有关。此外，慢性胰腺炎与胰腺癌的高风险相关，提示炎症可能参与了胰腺癌的起始和/或促进。炎症可促进细胞增殖和突变，减少对氧化应激的适应，促进血管生成，抑制细胞凋亡，增加炎症介质的分泌。
口腔是一个巨大的细菌蓄水池，由700多种细菌或系统型组成，其中约35%未被培养。6牙周炎是一种由细菌引起的口腔炎症。几项前瞻性研究显示口腔炎症(牙周炎)与胰腺癌风险增加呈正相关。7号到9号其他研究也说明了牙周病作为心脑血管疾病风险因素的潜在作用，10 - 12早产13和某些癌症。14此外，细菌与胰腺疾病的发病机制有关，包括自身免疫性胰腺炎和胰腺导管腺癌。15-28
为了阐明细菌的作用或更好地了解疾病发生时或不同疾病阶段之间的菌群变化，评估菌群组成似乎越来越重要。口腔菌群组成在慢性疾病发展和进展中的作用是重要的，特别是在开发非侵入性诊断测试的背景下。最近开发的基于16S rrna的寡核苷酸微阵列，即人类口腔微生物鉴定微阵列(HOMIM) (http://mim.forsyth.org/index.html)，使得对口腔微生物的变化进行分析和监测成为可能。HOMIM可以同时检测大约300种最常见的口腔细菌种类，包括那些还不能在体外培养的细菌。29
在这项研究中，我们使用HOMIM阵列和实时定量PCR (qPCR)对健康对照受试者和胰腺癌或慢性胰腺炎患者唾液中的口腔菌群进行了全面比较。此外，我们评估了唾液微生物特征作为胰腺癌非侵入性检测的额外生物标志物来源的性能和潜在的翻译效用。
患者和方法
研究设计、总体和样本
这项研究得到了加州大学洛杉矶分校机构审查委员会的批准。研究设计遵循探头设计原则(结果确定前前瞻性标本采集，回顾性盲法评价)。30.所有研究对象前瞻性地从加州大学洛杉矶分校医学中心招募。加州大学洛杉矶分校牙科研究所的胰腺疾病唾液库收集了283个唾液样本。其中，103个唾液颗粒样本，包括38个胰腺癌样本，38个匹配的健康对照样本和27个慢性胰腺炎样本，被选为本研究的发现和验证阶段。疾病患者的入选标准包括确诊局限于胰腺的胰腺癌，可切除或边缘可切除(由于肠系膜上静脉或门静脉受累)，以及慢性胰腺炎。排除标准包括由于动脉累及或直接延伸到邻近器官而导致的局部晚期胰腺癌，转移性胰腺癌，唾液收集前接受化疗或放疗，以及唾液收集后5年内诊断为其他恶性肿瘤的证据。从所有同意作为唾液捐赠者的患者中获得书面知情同意书和问卷数据表。个人特征的信息，如年龄、性别、种族、吸烟和饮酒史(现在或过去)，在表1．健康对照个体的年龄、性别和种族与癌症组相匹配。如前所述，持续收集未受刺激的唾液样本，稳定并保存。31样品球在测定前保存在- 80°C。
这项研究包括一个发现阶段和一个验证阶段，然后是一个独立的验证阶段。使用HOMIM阵列对10例胰腺癌患者和10例健康对照者的颗粒样品中的唾液菌群进行了分析。32从微阵列研究中识别的生物标记物首次使用qPCR对发现的样本集(10例癌症和10例健康对照)进行了验证。一个独立的样本集，包括28名胰腺癌患者，28名匹配的健康对照者和27名慢性胰腺炎患者，用于生物标志物验证阶段(图1)．经验证的生物标志物在三个临床鉴别类别中进行评估:胰腺癌与健康对照、胰腺癌与慢性胰腺炎、胰腺癌与非癌症联合(健康对照+慢性胰腺炎)。将慢性胰腺炎患者纳入验证的目的是评估所发现的生物标志物是否也能将癌症患者与与早期胰腺癌有表型重叠的慢性胰腺炎患者区分开来。
唾液细菌生物标记物的发现(包括验证)和验证策略示意图。电脑,胰腺癌;HC、健康控制;CP,慢性胰腺炎。
唾液微生物区系分析和微生物生物标记物验证
使用超清洁微生物DNA分离试剂盒(MO BIO Laboratories Inc, Carlsbad, California, USA)提取细菌DNA。PCR扩增使用16S通用引物(正向引物，5’-GAG AGT TTG ATY MTG GCT cag3’;反向引物，5 ' -GAA GGA GGT GWT CCA RCC GCA-3 ')，33然后混合到HOMIM阵列。32候选菌的筛选依据Present detection call和p值Mann-Whitney U检验(p call≥20%，p<0.05)。用qPCR法测定原始DNA样品中的细菌种类数量。针对细菌生物标志物候选基因的16S rRNA基因设计特异性引物(表2)．qPCR使用SYBR-Green Master Mix (Applied Biosystems, Foster City, California, USA)在95°C条件下进行15分钟的反应量为10 μl，然后在ABI 7900HT快速实时PCR系统(Applied Biosystems)中进行40个循环，分别在95°C条件下30 s和60°C条件下30 s。验证的微生物生物标记物使用验证样本进行qPCR独立验证。
结果
胰腺癌患者唾液中微生物群图谱与健康对照的显著差异
在HOMIM上的410个寡核苷酸探针中，有149个靶向不同物种或更高分类群的探针杂交后显示出可检测信号。共有56个优势种或优势群显示阳性对照信号的平均信号强度为>的10% (HOMIM阵列上的16S rRNA通用探针)，其中31种/优势群在胰腺癌患者的唾液球中增加(n=10)，而25种/优势群减少(n=10)。在唾液球中检测到的优势种/簇属于五个不同的细菌门，即厚壁菌门(如链球菌而且Granulicatella),变形菌门(如弯曲杆菌而且奈瑟氏菌属)、CFB类细菌(如普氏菌而且Porphyromonas)和放线菌(例如，Atopobium而且罗思氏菌属)．厚壁菌门是最多样的门，包括34个不同属/簇链球菌是种类最多的属，包括13个不同种/组(图2)．
基于16S rRNA基因的56个不同聚类/属的胰腺癌患者和健康对照组的系统发育树。胰腺癌患者唾液中增加的31个簇/种用三角形标记。通过对16S rRNA序列的最小进化分析，推断出系统发生树。
细菌生物标志物的鉴定和独立验证
基于HOMIM数据，16种/类群显示胰腺癌与匹配健康对照之间存在显著差异(p<0.05, n=20;平均信号强度>为阳性对照信号的20%)作为生物标志物候选。这16个种/群代表6个不同属，包括链球菌(3种/组),普氏菌(4种/组),弯曲杆菌(4种/组),Granulicatella(2种),Atopobium(1种)奈瑟氏菌属(2种)。用qPCR对HOMIM阵列结果进行验证。使用10个胰腺癌样本和10个匹配的健康对照，16个物种中有6个被qPCR确认。6种候选微生物标志物在胰腺癌患者与健康对照组之间均有显著性差异(p<0.05, n=20)。这些候选对象随后通过qPCR进行独立验证(28例胰腺癌患者，28例匹配的健康对照组和27例慢性胰腺炎患者)。两种微生物生物标记物(N elongata而且年代轻的(p<0.05, n=56)， ROC-plot AUC值分别为0.657和0.680 (表3)．qPCR结果显示，胰腺癌中这两种细菌标记物的水平均降低，与HOMIM阵列的结果一致。有趣的是，有一种物种的数量增加了(G adiacens)和一种减少(年代轻的)差异有统计学意义(p<0.05, n=55)。的水平G adiacens而且年代轻的胰腺癌组(n=28)与非癌症组(慢性胰腺炎组和健康对照组(n= 55)之间差异也有统计学意义(p<0.05) (表3)．
生物标志物组合分析
Logistic回归用于评价两个生物标志物在三个临床鉴别水平上的不同组合:胰腺癌与健康对照组、胰腺癌与慢性胰腺炎、胰腺癌与非癌症(健康对照组+慢性胰腺炎)。对于胰腺癌和健康对照，两种微生物生物标志物的组合(N elongata而且年代轻的的ROC-plot AUC值为0.90 (95% CI 0.78 ~ 0.96, p<0.0001)，在区分胰腺癌患者和健康受试者时，具有96.4%的敏感性和82.1%的特异性(图3一)．对于胰腺癌和慢性胰腺炎，两种微生物生物标记物的组合(G adiacens而且年代轻的的ROC-plot AUC值为0.70 (95% CI 0.56 ~ 0.81, p=0.0047)，在区分胰腺癌患者和健康受试者时，具有85.7%的敏感性和55.6%的特异性(图3 b)．为了区分胰腺癌与非癌症，胰腺癌与慢性胰腺炎的两种微生物生物标记物的组合(G adiacens而且年代轻的的ROC-plot AUC值为0.68 (95% CI 0.57 ~ 0.78, p=0.0063)，敏感性为85.7%，特异性为52.7% (图3 c)．
交互式点图分析和受试者工作特征(ROC)曲线分析联合唾液细菌生物标志物的预测能力。经验证的生物标志物在三个临床鉴别类别的水平内通过逻辑回归进行评估:胰腺癌与健康对照(A)，胰腺癌与慢性胰腺炎(B)，胰腺癌与非癌症(健康对照+慢性胰腺炎)(C)。每个模型的敏感性和特异性是通过从logistic回归中确定预测概率的分界点来获得的，该分界点最大化了敏感性和特异性之和。总的来说，这些分界点与每个模型中评估的癌症患者比例一致。
讨论
我们的研究是对胰腺癌或慢性胰腺炎患者唾液样本中微生物组的首次系统调查之一。我们应用了HOMIM阵列分析技术来评估胰腺癌和慢性胰腺炎中唾液微生物菌群的改变，以及可能的可验证这些系统性疾病的歧视性唾液微生物生物标志物。通过解决这两个问题，我们的分析结果和对检测生物标志物的进一步预验证打开了新的研究方向，支持系统性炎症导致胰腺疾病的观点，以及唾液是一种科学上可行和可信的非口腔疾病生物标志物来源。癌症的早期发现可以显著提高生存率，尤其是胰腺癌。与结肠癌等癌症不同，胰腺癌没有明确的症状或筛查方法。癌症检测工具需要足够的非侵入性和廉价，以便广泛应用。利用低侵入性方法(如唾液微生物区系改变)利用有价值的疾病特异性生物标志物支持了这一概念。
唾液中微生物群的HOMIM分析显示，在胰腺癌患者和健康对照组之间，微生物组成发生了显著的变化。在我们的研究中发现的经过验证的细菌特征可以在多个方面与胰腺癌有关。最近的前瞻性研究表明牙周病/牙齿脱落与胰腺癌风险增加之间存在关联。7号到9号口腔是一个巨大的细菌蓄水池，由700多种细菌或系统型组成，其中约35%未被培养。6口腔细菌的研究已超越口腔疾病的重点，延伸到全身疾病。一些研究表明牙周病是心脑血管疾病的潜在危险因素，10 - 12早产13和某些癌症。14此外，研究人员发现某些细菌或微生物多样性的变化与动脉粥样硬化有关，36早产，低出生体重37和人类癌症。38-44P gingivalis与牙周病有关，并已被证明在动物模型中加速动脉粥样硬化沉积45通过激活与动脉粥样硬化相关的宿主先天免疫反应。P gingivalis，放线杆菌actinomycetemcomitans而且梅毒denticola在患有动脉粥样硬化的人的动脉粥样斑块中检测到。46-48血清抗体P gingivalis也会增加患冠心病的风险。4950
在我们的研究中N elongata而且年代轻的与健康对照组相比，胰腺癌患者的死亡率显著降低。的水平G adiacens与所有非癌症受试者相比，胰腺癌患者显著升高。这些结果证实了N elongata而且G adiacens牙周疾病。51-53此外,G adiacens已在感染性心内膜炎/动脉粥样硬化患者的菌血症/败血症和原发性菌血症中检测到分离菌。5455总之，这些观察结果表明G adiacens常被认为是机会致病菌，可能与全身性炎症有关。海拔G adiacens可能与年代轻的的水平。有人指出年代轻的对致龋菌粘附有保护作用56殖民地的丧失链球菌细菌可能导致侵袭性牙周炎。57
细菌与胰腺疾病的发病机制有关，包括自身免疫性胰腺炎和胰腺导管腺癌。一个角色的幽门螺杆菌感染在自身免疫性胰腺炎的发病机制中已被提出。15 - 19在最近一项对自身免疫性胰腺炎患者的研究中，AIP肽1 - 7，与PBP的氨基酸序列同源H幽门，从大多数自身免疫性胰腺炎患者中确定。22然而，在少量胰腺腺癌患者中也发现了这种肽。H幽门最近从人类的肝硬化肝脏中分离出来，58提示微生物可能通过上升胃感染或小肠逆行转移感染胰腺和相关组织。20.21其他数据支持之间的关联H幽门定植和胰腺癌。23-28细菌丰度的变化是癌症发生的诱因还是口腔生态位的变化导致癌症发生的衍生反映，还需要在纵向研究中进一步探索。同时，慢性炎症与胰导管腺癌发展之间的联系也越来越清晰。慢性胰腺炎现在被认为是胰腺癌发展的一个危险因素。59
综上所述，这些数据表明口腔菌群变化与胰腺疾病之间的联系可能是致病的而不是反应性的。然而，本研究并没有探讨胰腺癌手术切除后口腔菌群的变化来解决这个问题。目前正在积极研究没有细菌进入血流的局部口腔感染是否以及如何可能导致慢性炎症或肿瘤等全身性疾病。例如，免疫系统通过被称为toll样受体(TLRs)的膜受体家族的表达来识别细菌病原体的存在。细菌上的脂多糖(LPS)可被TLR4特异性识别。通过TLRs识别微生物成分启动信号转导途径，上调参与先天免疫反应的基因，并进一步指导抗原特异性获得性免疫的发展。这些途径进一步被TLR域包含适配器，如TIRAP/Mal, TRIF, TRAM和MyD88调节。
除了对免疫细胞的作用外，LPS还可以作用于包括癌细胞在内的某些上皮细胞，促进其表型转化。例如，核因子-κB是一种转录因子，控制与炎症有关的众多基因的表达，编码生长因子和细胞入侵相关分子的基因。6061它在包括胰腺癌在内的多种类型的癌症中被组成性激活，并可由多种类型的炎症细胞因子(包括胰腺癌中的白细胞介素-1b)诱导。62 - 65此外，也有研究表明，从革兰氏阴性菌细胞膜表面释放的LPS可以促进胰腺癌中核因子-κB的激活，这可能是炎症与癌症发生发展之间的联系。66鉴于对胰腺癌病因的认识有限，进一步研究细菌相关的系统性炎症在胰腺癌发生中的作用是有必要的。最后，应该进一步研究胰腺癌的其他危险因素，包括与炎症、胃酸和硝酸盐还原细菌引起的高亚硝胺有关的肥胖和2型糖尿病。67
胰腺癌筛查有两大挑战。首先是需要检测局限于胰腺的早期小胰腺癌，甚至是癌前阶段，也称为PanIN阶段。第二是区分胰腺癌与表型相似的慢性胰腺炎(一种良性胰腺疾病)的能力。确定特定癌症类型中微生物群变化的具体概况很重要，因为不同的癌症可能具有重叠的特征。我们评估了验证过的微生物生物标记物的特异性，对比另一项在我们实验室使用肺癌进行的HOMIM谱分析研究。本研究中验证的细菌生物标记物在肺癌的菌群图谱中均未发生显著改变。这一跨疾病比较表明，唾液中验证的微生物生物标志物可能是胰腺癌检测的特异性。这是一项发现性研究，对统计上显著的标记进行了初步验证。因此，在没有开发和测试预测面板的情况下，这是一项预验证研究，生物标志物模型将需要在独立的临床相关队列中进行测试，以便“验证”。
这项研究有一定的局限性。首先，研究的横断面性质不能使我们理解关联的机制和时间顺序。需要更多的大型队列研究来建立时间序列，并评估从胰腺癌早期到晚期口腔微生物组的变化。此外，小样本量不允许进行亚组分析，以评估这些关联在不同人群中是否一致，如种族、民族和吸烟状况等因素定义。例如，在我们的发现组中没有患者，在我们的验证组中只有极少数患者有吸烟史。然而，吸烟显然是胰腺癌的一个风险因素，而香烟本身可能是接触多种潜在致病微生物的来源。68然而，这并没有降低这些标记在诊断测试中的潜在价值，目前正在使用基于人群队列的嵌套病例对照研究中进行评估。
致谢
我们感谢阿里·阿马尔收集和处理唾液样本。我们也感谢苏珊·博奇斯提供的技术援助。
参考文献
脚注
资金资金支持由国家卫生研究所提供(RO1DE017170和R21CA126733)。
相互竞争的利益DTWW披露与唾液诊断领域相关的知识产权所有权。其他作者没有披露潜在的利益冲突。
伦理批准加州大学洛杉矶分校IRB委员会。这项研究得到了加州大学洛杉矶分校机构审查委员会的批准。
来源和同行评审不是委托;外部同行评议。
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